Kraniofasial Geliştirme sırasında Ektodermal Epiteli Sinyal Özellikleri değerlendirilmesi

Bu prosedürün genel amacı, donör embriyolardan alınan ektodermin civciv embriyolarının gelişmekte olan üst çenesine nakledilerek kimera embriyolar oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle transplantasyon için donör dermin çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. Ardından konakçı bölgesi greftleme için hazırlanır.

Prosedürün son adımı, donör dokuyu konak bölgeye yerleştirmek ve grefti konumunda sabitlemektir. Nihayetinde, yalnızca donör ektodermin tutunduğunu gösteren sonuçlar elde edilebilir ve moleküler ve morfolojik analizler aracılığıyla, yeniden kodlanmış donör dermin fonksiyonu belirlenebilir. Bu yöntem, morfogenez sırasında çeşitli dokuların rolünün tanımlanması gibi gelişimsel biyolojideki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Prosedür, laboratuvarımızdan kıdemli bir araştırmacı olan Dr. Diane tarafından gösterilecektir. Bu prosedüre başlamadan önce besiyerlerini hazırlayın ve gerekli tüm çözeltilerin erişilebilir olduğundan ve doğru sıcaklıkta olduğundan emin olun. Ardından, uygun göz koruyucu ekipman kullanarak, mikro kapiler tüpleri bir alkol alevi üzerinde ince bir uç oluşturacak şekilde çekin.

Propan pürmüzü alevinde tutarak tungsten iğneleri keskinleştirmek için cam pinler hazırlayın. Yumurtanın ucuna bir parça bant yapıştırarak donör embriyoyu kabuktan çıkarma işlemine başlayın. Ardından, bandın merkezinde küçük bir delik açmak için bir diseksiyon iğnesinin ucunu kullanın.

10 mililitrelik bir şırınga ve 18 gauge'lik bir hipodermik iğneyi deliğe yerleştirin ve yumurtadan bir mililitre albümin çekin. Ardından bir disseksiyon iğnesi kullanarak kabuğun üst kısmında küçük bir delik açın. Bu deliği kapatmak için ikinci bir bant parçası yerleştirin.

İki çift pens kullanarak yumurtada dairesel bir açıklık açın. Embriyoyu kavrayın ve yıkamak için buz gibi soğuk PBS içeren bir kaba yerleştirin. Embriyonun başı çıkarıldıktan sonra, onu oda sıcaklığında, serumsuz DMEM içeren bir doku kültürü kabına yerleştirin.

Baş kısmını pensle tutarak petri kabını diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin. Üst çeneyi ve lagonu başın geri kalanından kaba diseksiyonla ayırmak için yaylı makas kullanın. Ardından, keskin bir jilet takılmış bisturi tutacağı kullanarak frontal nazal çıkıntıyı üst çeneden kesin.

Fronton nazal prosesi, yeterli hacimde PBS içinde çözünmüş dispa içeren 30 milimetrelik bir Petri kabına aktarmak için bir pipet kullanın ve 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. İnkübasyon süresi dolduktan sonra, dokuyu rahatsız etmeden dispa solüsyonunu aspire edin. Ardından dokuları, %1 BSA içeren DMEM ile tamamen kaplayın.

Sindirimi durdurmak için dokuyu yeni bir kültür kabına aktarın. Ardından, bir diseksiyon mikroskobu altında çalışarak, dokuyu köreltilmiş bir tungsten iğne ile tutarken sivriltilmiş bir tungsten iğne kullanın.

Ektodermi diğer dokulardan soyarak ayırın. Hazırlandıktan sonra, greft dokuyu konakçı transplantasyona hazır olana kadar buz üzerinde BSA içeren DMEM içerisinde saklayın. Daha önce gösterilen yöntemi kullanarak tavuk yumurtasında bir pencere açın.

Embriyo içeren yumurtayı iki çift pens kullanarak diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin. IGN membranını ve amniyonu kavrayıp nazikçe yırtarak bir delik açın ve konak embriyoyu açığa çıkarın. Baş sabit tutulurken, bir çift pensi sağ göze yerleştirip baskı uygulayarak başı döndürün.

Grefti yerleştirmek için pens ve iğne kullanarak konakçı dermisini çıkarın. Hazırlanan greftleri içeren Petri kabına iki µL nötr kırmızı ekleyin. Grefti konakçıya aktarmak için bir cam pipet kullanın.

Grefti, çıkarılan ektodermin yerine gelecek şekilde konumlandırın. Greftleme sonrası grefti sabitlemek için aşılanan dokunun her köşesine bir cam iğne yerleştirin. Pencereyi bantla sıkıca kapatın.

Embriyoyu, analiz için gerekli gelişim aşamasına gelene kadar inkübatöre geri yerleştirin; bu görüntü, anti Q-C-P-N-A bıldırcına özgü antikor ile boyanmış bir bıldırcın civciv URA dokusunu göstermektedir. Greftlenen doku iki ok arasında yer almaktadır. Burada, bir fare civciv kimerasında görülen orta tür dokusunda QCPN boyanmasına dair herhangi bir kanıt yoktur; greftlenen doku yeniden iki ok arasında yer almaktadır. C'de, sign B iki tekrarlayıcı dizisine özgü onaylanmış prob ile hibridizasyon gerçekleştirilmiştir.

Sınıf bir genlerin aynalaması, sign B iki ifadesinin, burada bir sülün civcığı kimera aynasının görüntüsü olarak gösterilen grefti kapsayan bölgeyle sınırlı olduğunu ortaya koymaktadır. trikrom boyama, kolajen ve kemiği mavi renkte gösterir. Üst çene iskeletinin duplikasyonu, okla belirtildiği şekilde görülmektedir. Bu görüntü, yeniden trikrom boyanmış bir fare civcığı kimera aynasını göstermektedir.

Üst çene iskeletinin duplikasyonu görülmektedir. Bu görüntü, burada gösterilen bir fare-civciv kimera dokusu olan raftlanmış civciv embriyosunun mezenşiminde normal BMP seven ekspresyonunun radyoaktif C iki hibridizasyonunu göstermektedir. Okla belirtildiği üzere, greftin bitişiğindeki mezenşimde BMP seven ekspresyonunun indüklendiği görülebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, ön ve burun çıkıntılarının gelişimini düzenleyen mekanizmaları değerlendirmek için civciv embriyolarının nasıl manipüle edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.