Kraniofasial Geliştirme sırasında Ektodermal Epiteli Sinyal Özellikleri değerlendirilmesi

Bu prosedürün genel amacı, ektodermi donör embriyolardan civciv embriyolarının gelişmekte olan üst çenesine naklederek kimerik embriyolar oluşturmaktır. Bu, önce transplantasyon için donör derminin çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra konak site aşılama için hazırlanır.

İşlemin son adımı, donör dokuyu konak bölgeye yerleştirmek ve grefti yerine sabitlemektir. Sonuç olarak, donör ektoderminin özel aşılanmasını gösteren sonuçlar elde edilebilir ve moleküler ve morfolojik analizler yoluyla donör recod derminin işlevi belirlenebilir. Bu yöntem, morfogenez sırasında çeşitli dokuların rolünü belirlemek gibi gelişimsel biyolojideki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımızdan kıdemli bir araştırmacı olan Dr.Diane olacaktır. Bu prosedüre başlamadan önce, ortamı hazırlayın ve gerekli tüm çözeltilerin erişilebilir ve doğru sıcaklıkta olduğundan emin olun. Daha sonra yeterli göz koruması takarken, mikro kılcal tüpleri alkol alevi üzerinde ince bir noktaya çekin.

Cam pimler yapmak için, tungsten iğnelerini bir propan meşalesinin alevi içinde tutarak keskinleştirin. Yumurtanın ucuna bir parça bant yerleştirerek donör embriyonun kabuktan çıkarılmasına başlayın. Kabuk daha sonra bandın ortasında küçük bir delik oluşturmak için bir diseksiyon iğnesinin ucunu kullanın.

Deliğe 10 mililitrelik bir şırınga ve 18 gauge hipodermik iğne yerleştirin ve yumurtadan bir mililitre albümin çıkarın. Daha sonra bir diseksiyon iğnesi kullanarak, kabuğun üstünde küçük bir delik açın. Bu deliği kapatmak için ikinci bir bant parçası yerleştirin.

İki çift forseps kullanarak yumurtada dairesel bir açıklık kesin. Embriyoyu kavrayın ve yıkamak için buz gibi soğuk bir PBS kabına koyun. Embriyonun başı çıkarıldıktan sonra, oda sıcaklığında, serum içermeyen DMEM içeren bir doku kültürü kabına yerleştirin.

Kafayı forseps ile tutarken çanağı diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin. Üst çeneyi ve lagonu başın geri kalanından çıkarmak için yaylı makas kullanın. Daha sonra keskin bir tıraş bıçağına sahip bir bıçak tutucu kullanarak, ön burun işlemini üst çeneden kesin.

Fronton nazal işlemi PBS'de yeterli miktarda diss içeren 30 milimetrelik bir Petri kabına aktarmak için bir pipet kullanın ve 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Kuluçka süresi geçtikten sonra, dokuyu rahatsız etmeden dispa solüsyonunu aspire edin. Daha sonra dokuları %1 BSA içeren DMEM ile tamamen örtün.

Sindirimi durdurmak için dokuyu yeni bir kültür kabına aktarın. Sonra diseksiyon mikroskobu altında çalışmak. Keskinleştirilmiş bir tungsten iğnesi kullanarak dokuyu keskinleştirilmemiş bir tungsten iğnesi ile tutun.

Ektodermi diğer dokulardan soyarak ayırın. Hazırlandıktan sonra, greft dokusunu, konakçı transplantasyon için hazır olana kadar BSA ile DMEM'de buz üzerinde saklayın. Daha önce gösterilen yöntemi kullanarak, tavuk yumurtasında bir pencere oluşturun.

Embriyoyu içeren yumurtayı iki çift forseps kullanarak diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. IGN zarını ve amniyonunu kavrayın ve bir delik açmak ve konakçı embriyoyu ortaya çıkarmak için nazikçe yırtın. Sağ göze bir çift forseps yerleştirerek ve başı sabit tutarken baskı uygulayarak başı döndürün.

Grefti yerleştirmek için konakçı dermi çıkarmak için bir dil ve iğne kullanın. Hazırlanan greftleri içeren Petri kabına iki mikrolitre nötr kırmızı ekleyin. Grefti konakçıya aktarmak için bir cam pipet kullanın.

Grefti, çıkarılan ektodermi değiştirecek konuma yerleştirin. Greftlemeyi takiben grefti yerine sabitlemek için greftlenmiş dokunun her köşesine bir cam pim yerleştirin. Pencereyi bantla sıkıca kapatın.

Analiz için gerekli gelişim aşamasına kadar embriyoyu inkübatöre geri koyun, bu görüntü anti Q-C-P-N-A bıldırcın spesifik antikoru ile boyanmış bir bıldırcın civciv URA'dan alınan dokuyu göstermektedir. Aşılanan doku iki ok arasında yer alır. Burada bir fare civciv çanı aynasından alınan meen tür dokuda QCPN lekelenmesine dair bir kanıt yoktur Yine, aşılanmış doku, C iki hibridizasyonda iki ok arasına yerleştirilmiştir ve B işaretine özgü iki tekrarlayan dizilim

Aynalama sınıfında, birinci sınıf genler, B iki işaretinin ifadesinin, burada gösterilen grefti içeren ome ile sınırlı olduğunu ortaya koymaktadır: trikrom lekeli bir bıldırcın civciv çanı aynası, trikrom boyama, kollajen ve kemik mavisi rengini verir. Üst çene iskeletinin duplikasyonu ok ile gösterildiği gibi görülür. Bu görüntü, tekrar trikrom lekeli bir fare civciv zili aynasını göstermektedir.

Üst çene iskeletinde duplikasyon görülür. Bu görüntü, C'de radyoaktif, normal BMP'nin iki hibridizasyonunu, burada gösterilen bir rafting civciv embriyosunun mechy'sindeki yedi ekspresyonunu göstermektedir, burada bir fare civciv çanı aynasından alınan dokudur. BMP yedi ekspresyonunun, okla gösterildiği gibi grefte bitişik mekikte indüklendiği görülebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, ön ve nazal sürecin gelişimini düzenleyen mekanizmaları değerlendirmek için civciv embriyolarını nasıl manipüle edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.