İnsan Takip edilen-Lusiferaz Malign Periferik Sinir Kılıf Tümör Hücreleri Ortotopik Xenografting In vivo Test

Lusiferaz etiketli insan malign periferik sinir kılıfı tümör hücreleri, bağışık yetmezliği olan farelere siyatik sinir grefti için güvenilir bir yöntem açıklanmıştır. Biyoparlaklık görüntüleme, çalışma grupları içine hayvanların rastgele ayrımı için tümör greft ve kriterlere uygun kurulmasını göstermek için kullanımı da tartışılmıştır.

Bu prosedürün genel amacı, bir aday terapötik ajanın, immün yetmezliği olan farelerin siyatik sinirine aşılanan M-P-N-S-T hücrelerinin büyümesini etkili bir şekilde inhibe edip etmediğini belirlemektir. Bu, önce tümör hücrelerinin bir doku şişesinden çıkarılması, yıkanması ve uygun konsantrasyonda tekrar askıya alınmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, siyatik siniri cerrahi olarak açığa çıkarmak ve daha sonra sinire 5.000 hücre enjekte etmektir.

Bir sonraki adım, CIN'i çalışma gruplarına randomize eden in vivo, ışık tabanlı görüntüleme kullanarak greftlemenin başarısını belirlemek ve aday terapötik ajan ile tedaviye başlamaktır. Prosedürün son adımı, greftlemeden 30 gün sonra tümörlerin toplanması ve aday terapötik ajanın tümör üzerindeki etkilerinin analiz edilmesidir. Sonuç olarak, terapötik ajanın, tümör ağırlıklarının karşılaştırılması, KI 67 için immün boyama yoluyla nispi proliferasyon oranlarına bakılması ve tünel tahlilleri ile kontrol ve tedavi edilen farelerde tümör hücresi ölümü seviyelerinin değerlendirilmesi gibi yöntemlerle tümör büyümesini azaltıp azaltmadığını gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin deri altı greftleme gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, normal mikro çevreyi modellemesidir, bu da M-P-N-S-T büyümesini daha iyi modelleyen bu tekniği gösteren laboratuvarımdan bir teknisyen olan Amy Turk olacaktır. Çıplak olmayan immün yetmezliği olan fareler aşılamadan bir gün önce hazırlanır. Vücut ısısını korumak için bir ısıtma yastığı üzerinde çalışan anestezi uygulanmış bir farenin saçlarını tıraş etmek için makas kullanın.

Kalan tüyleri almak için kimyasal bir tüy dökücü madde kullanın. Tüylerin tamamı alındıktan sonra, fareyi tamamen iyileşene kadar yataksız bir izolasyon kafesinde bir ısıtma yastığına yerleştirin. Aşılama gününde, hücreleri beş dakika boyunca 3000 RPM'de santrifüjleyin.

Snat dikkatlice çıkarın ve hücre peletini DMEM 10'da saf misin olmadan, üç mikrolitre başına beş kez 10 ila üçüncü hücrelere kadar nihai konsantrasyona yeniden süspanse edin. Hücreleri kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde tutun. Başlamak için, anestezi uygulanmış bir hayvanı bir ısıtma yastığına yerleştirin ve her göze oftalmik merhem sürün.

Her farenin sağ kulağına benzersiz bir tanımlayıcı numarası olan bir kulak küpesi takın. Çalışma boyunca tanımlama kolaylığı için, hayvanı karnına yerleştirin ve arka ayaklarını açın. Fareyi steril bir örtü ile örtün ve aşılamanın gerçekleşeceği cerrahi bir pencereyi ortaya çıkarın.

Betadine'i pamuk uçlu bir aplikatör ile kanadın ortasından başlayarak ve yavaş yavaş cerrahi pencerenin kenarlarına doğru dışa doğru spiral çizerek cerrahi bölgeye uygulayın. Daha sonra ameliyat bölgesine %70 etanol aynı şekilde uygulanır. Betadin'in ardışık uygulamaları ve ardından etanol iki kez daha tekrarlanır.

Hücreleri buzdan çıkarın ve yerleşmiş hücreleri yeniden askıya almak için tüpü hafifçe girdaplayın veya hafifçe vurun. Hücre süspansiyonunun 3.2 mikrolitresini çıkarmak için bir pipet kullanın ve bir paraform parçasına çıkarın. Hücre süspansiyonunun üç mikrolitresini 10 mikrolitrelik bir Hamilton şırıngasına çekin.

33 gauge iğne ile donatılmıştır. Hücreleri ve şırınga içeren hücreyi kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde tutun. 22 numaralı neşter bıçağı ile donatılmış dört numaralı bir neşter sapı kullanın ve uyluk kemiğinin hemen altında ve uyluk kemiğine paralel olarak yan taraftaki deriden bir kesi yapın.

Altta yatan kası ortaya çıkarmak için cerrahi kelepçe ile cilt kesisini açın. Bacak boyunca uzanan fasyayı köreltmek, incelemek için bir çift keskin uçlu makas kullanın ve mikroskop altında çalışan kalın bir ipliğin kalınlığı hakkında beyaz doğrusal bir yapının altında yatan siyatik siniri ortaya çıkarın. Sinirin altını dikkatlice incelemek için bir çift keskin uçlu kavisli forseps kullanın ve onu alttaki kastan gevşetin.

Siniri hem yüksekte hem de izole tutmak için forsepsleri dikkatlice yerinde bırakın Hamilton şırıngasının iğnesini sinirin içine sokun, enjeksiyon açısını sinire mümkün olduğunca paralel tutmaya çalışın, böylece alt tarafı delmemek için. İğne sinire düzgün bir şekilde yerleştirildikten sonra, forseps tarafından üretilen gerginliği gevşetin ve hücreleri 45 ila 60 saniye boyunca yavaşça enjekte edin. Tümör hücrelerinin geri yıkanmasını önlemek için yavaş bir enjeksiyon gereklidir ve bu da kayıplarına neden olur.

Tüm hücreler başarılı bir şekilde enjekte edildikten sonra, enjekte edilen materyalin kaybını en aza indirmek için iğneyi yavaşça geri çekin. Enjeksiyon tamamlandıktan sonra cerrahi kelepçeyi ve forsepsleri çıkarın. Ardından siniri dikkatlice orijinal konumuna geri yerleştirin.

Yapıştırıcının kurumasını sağlamak için kesiği vet bond cerrahi yapıştırıcı ile kapatın ve forseps ile yaklaşık 20 saniye bir arada tutun. Hayvanı, tamamen iyileşene kadar yataksız ısıtılmış bir kafese koyun. Farelerin sağlığını izleyin.

Günlük fareler çalışmadan çıkarılır. Tümör yükü hayvanın normal vücut ağırlığının %10'unu aşarsa veya kilo kaybı %20'yi aşarsaİşlemin başarısını belirlemek için, aşılamadan bir ve üç gün sonra biyolüminesans görüntüleme yapın. Bir fareye 2,5 miligram Lucifer enjekte edin ve anestezi uygulanmış hayvanı ısıtılmış görüntüleme platformuna yerleştirin.

Tümör eksprese edilen ateşböceği lusiferazından ışık emisyonu, substratın enjeksiyonundan 10 dakika sonra tespit edilir. Xeno Gen'in yazılımını kullanarak, görüntü alma sürelerini bir saniye ile 10 dakika arasında bir aralığa ayarlayın. Ardından, farelerin siyah beyaz fotoğraflarını çekin Pseudocolor.

Biyolüminesansın ölçeklendirilmesi, ışık emisyon yoğunluğunun bir ölçüsünü sağlamak için bu görüntülerle kaplanmıştır. Klinik öncesi bir araştırma kohortuna dahil edilmeye uygun olmak için, farelerin aşılamadan hem bir hem de üç gün sonra saptanabilir bir biyolüminesans sinyaline sahip olması ve sinyalin yoğunluğunun bir ila üçüncü günler arasında artması gerekir. Burada, çıplak bir farede uygun şekilde kurulmuş bir ortotopik ksenogreftte aşılamadan bir ila 18 gün sonra gözlenen biyolüminesansta tipik bir ilerleyici artış gösterilmiştir.

Farklı farelerin ilgi alanı içinde tespit edilen sinyallerdeki benzerliğe dikkat edin. Greftlemeden 10 gün ve 18 gün sonra yeniden görüntüleme, bireysel farelerde greft bölgesinde biyolüminesan sinyallerin giderek arttığını göstermektedir. Greftlemeden bir ila 24 gün sonra gözlenen biyolüminesan sinyallerin nicelleştirilmesi, bu sinyallerin giderek artmasına rağmen, çalışma süresinin sonraki aşamalarında tümör büyümesinin belirgin şekilde hızlandığını göstermektedir.

M pns ts'nin agresif büyümesi göz önüne alındığında, aşılanmış tümör hücreleri sıklıkla sinirin normal bariyerlerini ihlal eder ve bitişik dokuları istila eder. Greft bölgesinin bu foto mikrografı, tümör büyümesini ve bitişik iskelet kasına fokal invazyonu gösterir Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapıldığında bir farede 10 dakika içinde gerçekleştirilebilir.