Name: Moss Verimli Polietilen Glikol (PEG) aracılığı ile Dönüşüm Physcomitrella Dini ayinlerde kullanılan patenler /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 54 s
Description: Öğrenin Physcomitrella patens protoplastlarını PEG ile verimli bir şekilde dönüştürme yöntemini. Bu protokol gen fonksiyonu çalışmaları için güvenilir sonuçlar sağlar ve yaklaşık üç saatte tamamlanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

LV NSF (IOS 1.002.837) tarafından desteklenen

1. Protoplast yapma <ol><li> Petri kabı mannitol% 8 9 ml ekleyin. </li><li> 5 2-3 PPNH4 plakalardan bir spatula kullanarak, 7 gün eski yosun koymak Petri kabı içeren mannitol. </li><li> Petri kabı 3 ml (Sigma D9515-25G) 2% Driselase ekleyin. </li><li> Petri kabı, 1 saat süreyle hafif sallayarak ile oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 100 mikron mesh (BD Falcon 352.350) ile protoplast süspansiyon Filtresi. </li><li> 5 dakika boyunca 250 gr süzülmüş süspansiyon dönerler. Süpernatantı. </li><li> 500 mcL% 8 mannitol ile çok yavaşça protoplast yeniden askıya. </li><li> Kültür tüpüne 9.5 ml% 8 mannitol ekleyin. Protoplast tamamen askıya alınır emin olun. </li><li> Filtrasyon ve yeniden süspansiyon adımları (1.6, 1.7 ve 1.8) iki kez daha tekrarlayın. </li><li> Protoplast çözüm 10 mcL alın ve bir hemasitometre protoplast saymak. </li><li> (Bkz: Şekil 1) mL başına protoplast numarası almak için 16 kare alanda protoplast sayısı 10.000 ile çarpın. </li></ol> 2. Dönüşüm <ol><li> 5 dakika için 250 g protoplast süspansiyon Spin. Süpernatantı. </li><li> 1,6 milyon protoplast / mL konsantrasyonda MMG çözüm protoplast yeniden askıya. </li><li> Protoplast süspansiyon 20 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Protoplast süspansiyon 60 mg DNA içeren bir kültür tüpe 600 mcL ekleyin. Tüp nazikçe Swirl. </li><li> 700 PEG / Ca çözüm mcL protoplast / DNA karışımı ekleyin. Swirl tüp nazikçe tüm karışımı homojen kadar. </li><li> Karışımı oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. </li><li> Bu bekleme süresi sırasında, PRM-B selofan levhalar (80 mm çapında daireler, AA Ambalaj Limited Şirketi, Birleşik Krallık) kapak; levha yüzeyi üzerinde en az 5 dakika hidrat izin selofan. </li><li> Spatula ile, selofan ve plaka arasında sıkışmış hava kabarcıkları. </li><li> W5 çözüm 3 mL karışım sulandırınız. </li><li> Spin karışımı 5 dakika boyunca 250 gr. Süpernatantı. </li><li> PRM-T eritilmiş 2 mL yeniden askıya protoplast (bu çözüm, 42 ° C'de sıvı muhafaza edilebilir protoplast eklemeden önce). Plaka PRM-B selofan kapsadığı plaka başına yeniden askıya protoplast 1 ml. Micropore (3M Sağlık) plakaları sarın. Bir büyüme odasında plakalar 25 ° C'de tutun. </li><li> Alternatif olarak, 1 ml sıvı kaplama orta ve selofan ile kaplanmış bir PRM-B plaka kaplama 0,5 mL protoplast yeniden askıya alınmış olabilir. Bu hızlı yenilenmesini sağlar, ancak yenileyici bitkilerin sayısı düşüktür. </li><li> Büyüme odası, 16 saat için ayarlanır. ışık ve 8 saat. karanlık döngüsü. </li><li> Selofan dönüşüm 4 gün sonra yeni bir seçim plaka üzerine taşıyın. </li></ol> 3. Temsilcisi Sonuçlar: Dönüşüm bir örnek Şekil 2'de gösterilmiştir. Bu örnekte kullanılan DNA hygromycin dayanıklı kaset taşıyan plazmid supercoiled 7.8 kb oldu. Fotoğrafçılığı için% 50, kaplama protoplast miktarı azaldı. Resimler bitkilerin seçimi plakaları taşındı iki hafta sonra alındı. Dönüşüm verimliliği DNA konsantrasyonu 60 mg kadar etkilenmez. DNA yüksek konsantrasyonlarda dönüşüm verimliliği zararlıdır. Bu yöntem veri DNA miktarda geniş bir yelpazede içinde tutarlı sonuç sağladığını gösterdi. Bu yöntem aynı zamanda etkili bir şekilde Tablo 1'de gösterilmiştir istikrarlı transformants oluşturabilir, daha önce 14 bildirilmiştir çok daha yüksek Lineerleştirilmiş DNA mikrogram başına 4 istikrarlı transformants alabilirsiniz. Biz de bir belirteç olarak flüoresan protein geni taşıyan bir supercoiled plazmid dönüştürerek dönüşüm verimliliği ısı şok etkisi test edilmiştir. Isı şoku, 3 dakika boyunca 45 ° C su banyosu karışımı kuluçka (Adım 2.6 içinde), oda sıcaklığında kuluçka 10 dakika sonra gerçekleştirildi. Karışım 17 dakika süreyle ısı şok hemen sonra oda sıcaklığında su banyosunda inkübe edildi. Sonuçlar 22 saat sonra dönüşüm kaydedildi. Transformants ile elde edilen ve ısı şok olmadan oranları (~% 25) çok benzer, ama biz protoplast (veriler gösterilmemiştir) canlılığı üzerindeki ısı şok bir yan etki gözlenmedi. <img src="/files/ftp_upload/2560/2560fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Hemasitometre içinde protoplast gör. Protoplast sayımı için gerekli bölüm, kırmızı bir kare ile gösterilir . Not protoplast (1.11) sayımı için gerekli olan 16 kareler; görüntü 24 protoplast sayısı (240.000 hücre / ml). <img src="/files/ftp_upload/2560/2560fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. 18 günlük geçici transformants Resimleri protoplast transsupercoiled plazmid belirtilen miktarda kurdu. A: 15μg; B: 30μg; C: 60μg; D: 120μg. <table border="1"><tbody><tr><td> DNA (mikrogram) Miktarı </td><td> Verim (tranformants / mg DNA) </td></tr><tr><td> 15, plazmid supercoiled </td><td> 120 ± 24 </td></tr><tr><td> 30, plazmid supercoiled </td><td> 145 ± 54 </td></tr><tr><td> 60, plazmid supercoiled </td><td> 121 ± 60 </td></tr><tr><td> 120, plazmid supercoiled </td><td> 71 ± 38 </td></tr><tr><td> 60, plazmid lineerleştirilmiş </td><td> 4 ± 1 </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Çeşitli DNA miktarlarda Dönüşüm verimliliği.

<ol><li>Abel, S., Theologis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+transformation+of+Arabidopsis+leaf+protoplasts%3A+a+versatile+experimental+system+to+study+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Transient transformation of Arabidopsis leaf protoplasts: a versatile experimental system to study gene expression.</a> Plant J. 5, 421-427 (1994).</li>
<li>Wood, A. J., Oliver, M. J., Cove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bryophytes+as+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Bryologist%22%5BJournal%5D)">Bryophytes as model systems.</a> Bryologist. 103, 128-133 (2000).</li>
<li>Schaefer, D. G., Zrÿd, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+targeting+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene targeting in the moss Physcomitrella patens.</a> Plant J. 11, 1195-1206 (1997).</li>
<li>Schaefer, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+in+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene targeting in Physcomitrella patens.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 4, 143-150 (2001).</li>
<li>Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parameters+determining+the+efficiency+of+gene+targeting+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens.</a> Nucleic Acids Res. 33, e173-e173 (2005).</li>
<li>Cove, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">The moss Physcomitrella patens.</a> Annu. Rev. Genet. 39, 339-358 (2005).</li>
<li>Kamisugi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+gene+targeting+in+Physcomitrella+patens%3A+homologous+recombination%2C+concatenation+and+multiple+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The mechanism of gene targeting in Physcomitrella patens: homologous recombination, concatenation and multiple integration.</a> Nucleic Acids Res. 34, 6205-6215 (2006).</li>
<li>Vidali, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+formin-mediated+actin-filament+elongation+is+essential+for+polarized+plant+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Rapid formin-mediated actin-filament elongation is essential for polarized plant cell growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2009).</li>
<li>Sawahel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+foreign+DNA+into+Physcomitrella+protonemal+tissue+by+using+the+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transfer of foreign DNA into Physcomitrella protonemal tissue by using the gene gun.</a> Plant Mol. Biol. 10, 315-316 (1992).</li>
<li>Schaefer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transformation+of+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Gen.+Genet%22%5BJournal%5D)">Stable transformation of the moss Physcomitrella patens.</a> Mol. Gen. Genet. 226, 418-424 (1991).</li>
<li>Cho, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+bombardment+mediated+transformation+and+GFP+expression+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cells%22%5BJournal%5D)">Particle bombardment mediated transformation and GFP expression in the moss Physcomitrella patens.</a> Mol. Cells. 9, 14-19 (1999).</li>
<li>Ashton, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bryophyte+Physcomitrella+patens+replicates+extrachromosomal+transgenic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">The bryophyte Physcomitrella patens replicates extrachromosomal transgenic elements.</a> New Phytol. 146, 391-402 (2000).</li>
<li>Hohe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+and+highly+standardized+transformation+procedure+allows+efficient+production+of+single+and+multiple+targeted+gene-knockouts+in+a+moss%2C+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Genet%22%5BJournal%5D)">An improved and highly standardized transformation procedure allows efficient production of single and multiple targeted gene-knockouts in a moss, Physcomitrella patens.</a> Curr. Genet. 44, 339-347 (2004).</li>
<li>Vidali, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profilin+is+essential+for+tip+growth+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Profilin is essential for tip growth in the moss Physcomitrella patens.</a> Plant Cell. 19, 3705-3722 (2007).</li>
</ol>

Burada sunulan yöntem Physcomitrella Dini ayinlerde kullanılan patenler protoplast içine basit ve tutarlı bir DNA dönüşümü sağlar . Bu yöntem başlangıçta Arabidopsis 1 için geliştirilmiş, ancak burada Physcomitrella Dini ayinlerde kullanılan patenler, daha basit ve farklı bitki protoplast ile iyi bir performans ortaya koydu. Bu nedenle, bu yöntem, küçük değişiklikler ile diğer bitki türlerinin uygulanabilir. Optimizasyonu için olası değişiklikler MMG protoplast konsantrasyon, kuluçka süresi, MMG ve PEG / Ca çözüm içerir. (Tablo 1) Bu noktada transformants sayısı kadar DNA konsantrasyonu ile doğrusal olarak artar, çünkü bizim rutin deneyler 60 mg DNA kullanmayı tercih. Biz bitkilerin büyük bir nüfus daha fazla tarama ve analiz için izin veren tek bir 60 mg DNA dönüşümü, yaklaşık 7000 geçici transformants veya 200 istikrarlı transformants alabilir. Dönüştürülmüş protoplast sıvı kaplama, orta ya da PRM-T ile iki yayılmış olabilir. Protoplast supercoiled plazmid dönüştürülmüş olduğu rejenerasyon sıvı kaplama orta kullanıldığında verimliliği düşük olmasına rağmen, bu yöntemi tercih etmektedir. Tablo 1&#39;de gösterdi supercoiled plazmid DNA ile yapılan dönüşümler, çok daha fazla transformants ve bu nedenle, biz hala sıvı kaplama orta ile çok sayıda bitki elde edebilirsiniz. Ayrıca, sıvı kaplama orta protoplast yayılmasını deneyler 9,15 yıkmak, RNAi olarak geçici fenotipleri içeren deneyler için önemli olan hızlı yenilenme sağlar. Buna ek olarak üst agar yokluğunda, immün ve RT-PCR 9,15 kolay bitki izolasyon sağlar .

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifin Adı </td><td> Bileşen </td></tr><tr><td> PPNH 4 </td><td> 1.84 mM KH 2 PO 4 3.4 mM Ca (NO 3) 2 1 mM MgSO 4 2.72 mM Diamonyum tartarat 54 mcM FeSO 4 .7 H 2 O 9.93 mcM H 3 BO 3 1.97 mcM MnCl 2 .4 H 2 O 0.23 mcM CoCl 2 .6 H 2 O 0.19 mcM ZnSO 4. 7H 2 O 0.22 mcM CuSO 4. 5H 2 O McM 0.10 Na 2 Moo 4 .2 H 2 O 0.168 mcM KI Katı besiyeri için% 0.7 agar ekleyin. </td></tr><tr><td> PRM-B </td><td> PPNH 4,% 6 mannitol ve% 0.8 agar . Plakalar dökülmeden önce 10 mL 1M CaCl 2 1 L ekleyin. </td></tr><tr><td> PRM-T </td><td> PPNH 4,% 6 mannitol ve% 0.6 agar . 0.5 mL 1M CaCl kullanmadan önce 2 ila 50 ml ekleyin. </td></tr><tr><td> Sıvı Kaplama Orta </td><td> PPNH 4% 8.5 agar olmadan mannitol. 0.5 mL 1M CaCl kullanmadan önce 2 ila 50 ml ekleyin. </td></tr><tr><td> 2% Driselase </td><td> Driselase 4 g (Sigma D9515-25G),% 8 mannitol 200 ml ekleyin. 30 dakika hafifçe karıştırın. oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. 4 ° C ve 5 dakika boyunca yavaşça karıştırın. oda sıcaklığında. Pelet atın, 10 dakika Spin 2.500 gr. Filtre 10 ml alikot olarak dondurulmuş 0.22 mikron ve mağaza. Kullanmadan önce oda sıcaklığında su banyosunda çözülme. </td></tr><tr><td> MMG </td><td> 0,4 M mannitol 15 mM MgCl 2 4 mM MES (pH 5.7) </td></tr><tr><td> PEG / Ca </td><td> 4 g PEG4000 3 mL H 2 O 2.5 ml 0.8 M mannitol 1 ml 1M CaCl 2 </td></tr><tr><td> W5 </td><td> 154 mM NaCl 125 mM CaCl 2 5 mM KCl MES (pH 5.7) 2 mM </td></tr></tbody></table>

moss verimli polietilen glikol (peg) aracılığı ile dönüşüm physcomitrella dini ayinlerde kullanılan patenler</em

Efficient Polyethylene Glycol (PEG) Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

Physcomitrella pantens protoplast dönüştürmek için basit ve etkili bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem Physocmitrella protonemal protoplast ve Arabidopsis mezofil protoplast dönüşüm 1 protokolleri uyarlanmıştır. Verimli mitotik homolog rekombinasyon geçmesi kapasitesi nedeniyle Physcomitrella Dini ayinlerde kullanılan patenler, son yıllarda 2 önemli bir model sistem olarak ortaya çıkmıştır . Bu kapasite, Arabidopsis gibi diğer model tesislerinde görülen 3-9 hedef gen yüksek frekansları sağlar . Bu sistemin tam olarak yararlanmak için, biz yosun hücrelerin içine DNA sunmak için etkin ve kolay bir yöntem gerekir. Bu yosun dönüştürmek için en yaygın yolu, partikül bombardımanı 10 ve PEG-aracılı DNA alımı 11 . Partikül bombardımanı yüksek dönüşüm verimliliği 12 üretebilir rağmen, gen silahlar birçok laboratuvarda hazır değildir ve protokol standardize etmek zordur. Öte yandan, PEG aracılı dönüşüm uzman ekipman gerektirmeyen, ve steril bir kukuleta ile, herhangi bir laboratuvar yapılabilir. Burada, yosun protoplast dönüşüm için basit ve son derece etkili bir yöntem gösteriyor. Bu yöntem daha önce 13 DNA, en verimli protokolü bir gelişmedir mikrogram başına 120&#39;den fazla geçici transformants üretebilir . Basitlik, verimlilik ve tekrarlanabilirlik için, bu yöntem rutin dönüşümün yanı sıra çok sayıda transformants gerektiren projeler için uygulanabilir.

Dönüştürmek için basit ve etkili bir yöntem<em&gt; Physcomitrella pantens</em&gt; Protoplast açıklanmıştır. Bu yöntem için protokolleri uyarlanmıştır<em&gt; Physocmitrella</em&gt; Protonemal protoplast ve<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Mezofil protoplast dönüşüm<sup&gt; 1</sup&gt;.

Moss Verimli Polietilen Glikol (PEG) aracılığı ile Dönüşüm Physcomitrella Dini ayinlerde kullanılan patenler</em

Physcomitrella patens protoplastlarını transforme etmek için basit ve etkili bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, Physcomitrella ... için hazırlanan protokollerden uyarlanmıştır.

Bu prosedürün genel amacı SCO Metre protoplastlarını transforme etmektir. Bu işlem, öncelikle bitkilerin Drizly ile sindirilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, protoplastlar drizly'yi uzaklaştırmak için mannitol ile yıkanır ve daha sonra DNA ve peg ile inkübe edilir.Son olarak, transforme edilmiş protoplastlar plakalara yayılır ve inkübe edilir. Nihayetinde, floresan mikroskopisi aracılığıyla floresanla işaretlenmiş proteinleri eksprese eden transforme olmuş protoplastları gösteren sonuçlar elde edilebilir. Prosedürü laboratuvarımdan doktora sonrası araştırmacı Y lu uygulamalı olarak gösterecektir.Bu tekniğin temel avantajı, etkili olması ve ilgilenilen proteini eksprese eden protoplastları tutarlı bir şekilde üretmesidir. Yosun protoplastlarını izole etmek için, bir spatula kullanarak bir Petri kabına dokuz mililitre %8 mannitol ekleyerek başlayın. İki ila üç PP NH dört plaklarından alınan beş ila yedi günlük yosunları mannitol içine yerleştirin. Bunun ve ek reaktif tarifleri için lütfen ekteki yazılı protokole bakınız. Ardından, üç mililitre %2 drizly ekleyin ve oda sıcaklığında, hafifçe çalkalayarak bir saat boyunca inkübe edin.Yeşil homojen bir süspansiyon elde etmek için karışımı 100 mikronluk elekten süzün. Ardından filtratı 250 G'de beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çok nazikçe uzaklaştırın.Protoplastları 500 µL %8 mannitol içinde yeniden süspanse edin. Ardından, 9,5 mL daha %8 mannitol ekleyin. Protoplastların tamamen süspanse olduğundan emin olun.Çözeltiyi beş dakika boyunca 250 G'de tekrar döndürerek yıkama adımlarını iki kez daha gerçekleştirin. Süpernatantı atın ve protoplastları önce 500 µL içinde yeniden süspande edin.Ardından, bir hemositometre kullanarak %8 mannitolin 9,5 mililitresini ekleyin. İzole edilen protoplastlara DNA transformasyonu yapmak için süspansiyonun 10 mikrolitresindeki protoplast sayısını sayın. İlk olarak, protoplast karışımını 250 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.Süpernatantı uzaklaştırın ve protoplastları MMG çözeltisi içinde mililitrede 1,6 milyon olacak şekilde yeniden süspande edin. Süspansiyonu oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Ardından, 60 µg DNA içeren bir kültür tüpüne 600 µL protoplast çözeltisi ekleyin. Çalkalayın.700 µL PEG kalsiyum çözeltisini nazikçe ekleyin ve çalkalayın. Bu bekleme süresi boyunca numuneyi oda sıcaklığında 30 dakika boyunca iyice inkübe edin. PRMB plakalarının üzerini selofan ile kapatın.Ardından süspansiyonu üç mililitre W 5 çözeltisi ile seyreltip 250 G'de beş dakika boyunca santrifüj edin. PEG'i uzaklaştırmak için protoplastları iki mililitre PRM tamponunda yeniden süspande edin, her bir PRMB plağına bir mililitre olacak şekilde ekleyin ve plakları selofanla örtün. Plakları bir büyüme odasında 25 °C'de tutun.Son olarak, transformasyondan dört gün sonra, selofan tabakasını taze seleksiyon plaklarına aktarın. Bu şekil, higromisin direnç kaseti taşıyan 15 µg süper kıvrımlı plazmid DNA ile transforme edilmiş protoplastlardan rejenerasyonu gerçekleştirilen 18 günlük bitkilerin bir örneğini göstermektedir. Burada, aynı süper kıvrımlı plazmid DNA'dan 30 µg protoplastlara transforme edilmiştir.Bu örnekte 60 µg plazmid DNA transformasyonu gerçekleştirilmiştir. Son olarak, bu bitkiler, higromisin direnç kasetini taşıyan aynı süper kıvrımlı plazmid DNA'nın 120 µg'ı ile transforme edilmiş protoplastlardan rejenerasyon yoluyla üretilmiştir. Transformasyon verimliliği, 60 µg'a kadar olan DNA konsantrasyonlarından etkilenmemektedir.Buna karşın, daha yüksek DNA konsantrasyonları bu prosedür için sakıncalıdır. Veriler, bu yöntemin geniş bir DNA miktarı aralığında tutarlı sonuçlar verdiğini göstermektedir. Bu teknik, uygun şekilde uygulandığında üç saat içinde tamamlanabilir.Bu prosedürün ardından, gen fonksiyonuna ilişkin ek soruları yanıtlamak amacıyla geçici RNAi ve gen nakavtları gibi ek yöntemler uygulanabilir.

efficient-polyethylene-glycol-peg-mediated-transformation-moss

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Protokol Metilotropik maya kullanarak protein ekspresyonu açıklar.

Rekombinant Proteinlerin Metilotropik maya İfade Pichia pastoris</em

Bu makalede, tek hücreli deniz alg genetik dönüşümü...

Picoeukaryote genomik Dönüşüm<em&gt; Ostreococcus tauri</em

Bir yüksek verimlilik, otomatik, tütün protoplast üretim ve dönüşüm metodolojisi açıklanmıştır. Robotik sistem dışı bir model ürünlere çevrilebilir olmalıdır modeli BY-2 sistemde güçlü paralel gen ifadesi ve keşif sağlar.

Yüksek verim Protoplast İzolasyonu ve Dönüşüm için Robotik Platformu

Genetik Ustilago Maydis'in karalamak mantar işlemek için Biz sağlam bir gen değiştirme stratejisini açıklar. Bu protokol enfeksiyon fenotipleri araştırmak için silme mutantlarını üretmek açıklar. Bir floresan protein etiketi kodlayan bir sekansı ilave olarak, örneğin, arzu edilen herhangi bir şekilde, genleri değiştirme uzatılabilir.

Bitki patojeni olarak genetik manipülasyonu<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Mantar Biyoloji ve Bitki Mikrop Etkileşimleri Eğitim için

Biz canlı hücrelerdeki karmaşık düzenleyici ve sinyal mekanizmaları incelemek soya önceki büyük miktarlarda hazırlanması için basit ve etkili iletişim kuralı geliştirilmiştir.

Soya önceki ve geçici gen ifade analiz için uygulama yalıtım için basit bir yöntem

Agrobacterium aracılı dönüşümü daldırma çiçek yöntemini kullanarak başarılı bir şekilde Schrenkiella parvulaextremophyte modelinin kararlı transgenik satırları oluşturmak için istihdam edilebilir. Biz bundan farklı büyüme alışkanlıkları ve extremophyte fizyolojik özellikleri dikkate alınarak Arabidopsis thalianaiçin değiştirilmiş bir iletişim kuralı mevcut.

Bitki büyüme ve Floral daldırma dönüşümün Agrobacterium aracılı Extremophyte Schrenkiella parvula

Burada, mısır mezofil hücrelerinde büyük plazmid kütüphanelerini test etmek için milyonlarca mısır protoplastını geçici olarak transfekte etmek için yüksek verimli bir protokol sunuyoruz.

Mısır Mezofil Protoplastlarının Ölçeklenebilir Transfeksiyonu

Bu protokol, ilgilenilen gen(ler)i yeşil mikroalgler Chlorella vulgaris'in nükleer genomuna entegre etmek için Agrobacterium tumefaciens aracılı dönüşümün (AMT) kullanımını ana hatlarıyla belirtir ve kararlı dönüştürücülerin üretimine yol açar.

Yeşil Mikroalglerin Agrobacterium tumefaciens Aracılı Genetik Mühendisliği ( Chlorella vulgaris)

Phytophthora palmivora'nın Agrobakteriya aracılı dönüşümü için basit, etkili ve tekrarlanabilir bir protokol sunuyoruz; bu protokol P. capsici  için de geçerlidir.

Phytophthora palmivora'nın Agrobakteri Aracılı Dönüşümü İçin Basitleştirilmiş Bir Yöntem

Genom ve fenotipik varyasyon bir alt kümesi içinde genomik değişimi besin stres altında bazı keten çeşitleri Büyüyen. Belirli bir yerinde karmaşık bir ekleme çeşitli besin rejimler altında büyüme ile bu sitede çevresinde gen ekspresyonu değişiklikleri ile ilişkilidir.

Keten içinde değişiklikler Kalıtsal Çevre İndüklenmiş

Öğrenin Physcomitrella patens protoplastlarını PEG ile verimli bir şekilde dönüştürme yöntemini. Bu protokol gen fonksiyonu çalışmaları için güvenilir sonuçlar sağlar ve yaklaşık üç saatte tamamlanır.

Moss Verimli Polietilen Glikol (PEG) aracılığı ile Dönüşüm Physcomitrella Dini ayinlerde kullanılan patenler

Daha fazla video keşfet