Nükleik Asitlerin NanoDrop Microvolume kantitasyonu

NanoDrop Numune tutma sistemi, QTS veya kılcallar kullanmadan, sıvıların doğal yüzey gerilimini kullanarak mikro hacimli numuneleri iki optik kaide arasında tutan ve ölçen yenilikçi bir teknolojidir. Alt optik yüzeyin üzerine doğrudan bir mikrolitre kadar az numune pipetlenir. Spektrometre kolu kapatıldığında, üst ve alt optik kaideler arasında bir sıvı sütunu oluşur.

Yüzey gerilimi ile dikey bir optik yol oluşturulması sayesinde, dikey yol uzunluğu ölçüm sırasında gerçek zamanlı olarak otomatik olarak değişebilir. Yol uzunluğunun kısalması daha yüksek konsantrasyonların ölçülmesine olanak tanıyarak, çoğu nükleik asit örneği için dilüsyon yapma gereksinimini etkili bir şekilde ortadan kaldırır. Ayrıca, örnek tutma sistemi, optik yüzeylerin sadece bir laboratuvar silgisi ile silinmesinden ibaret olan hızlı bir temizleme işlemiyle deneysel süreci hızlandırır.

Bugün, Thermo Scientific mikro hacim cihazları kullanılarak nükleik asit konsantrasyonunun belirlenmesine yönelik iki prosedürü göstereceğiz. İlk protokol, NanoDrop 2000 C spektrofotometresi kullanılarak yapılan doğrudan nükleik asit ölçümüdür. İkinci protokol ise NanoDrop 3000 fluoro spektrometresi kullanılarak yapılan dolaylı floresan nükleik asit ölçümüdür.

Başlamak için, alt optik yüzeye iki ila üç mikrolitre temiz deiyonize su pipetleyerek mikro hacimli spektrofotometre numune tutma sisteminin üst ve alt optik yüzeylerini temizleyin. Üst kaidenin deiyonize suyla temas ettiğinden emin olarak kaldıraç kolunu kapatın. Kaldıraç kolunu kaldırın ve her iki optik yüzeyi temiz, kuru, tüy bırakmayan bir laboratuvar silgisiyle silin.

Ardından, NanoDrop yazılımını açın ve nükleik asit uygulamasını seçin. Alt optik yüzeye bir mikrolitre tampon çözelti damlatarak, düşük hacimli kalibre edilmiş bir pipetle boş ölçüm gerçekleştirin. Manivela kolunu indirin ve nükleik asit uygulamasındaki boş (blank) seçeneğini belirleyin.

Blank ölçümü tamamlandıktan sonra, her iki optik yüzeyi de bir laboratuvar mendili ile temizleyin. Daha önce olduğu gibi, ölçülecek örnek için uygun sabiti seçin. Ardından, alt optik kaide üzerine bir mikrolitre nükleik asit örneği damlatın ve kaldıraç kolunu kapatın.

Ölçüm hacimden bağımsız olduğu için numunenin yalnızca iki optik yüzey arasındaki boşluğu doldurması yeterlidir. Ölçüm yapmak için uygulama yazılımından measure seçeneğini belirleyin; yazılım, nükleik asit konsantrasyonunu ve saflık oranlarını otomatik olarak hesaplayacaktır. Numune ölçümünün ardından spektral çıktıyı inceleyin. Tipik bir nükleik asit numunesi, oldukça karakteristik bir profile sahip olacaktır.

Düşük kaliteli bir örneğin spektral göstergeleri arasında, çukurda ve 260 nanometre pikinde görülen dalga boyu çentikleri yer alır. Belirli nükleik asit izolasyon teknikleriyle ilişkili yaygın kontaminan kaynakları arasında fenol, triol ve kolon ekstraksiyonu bulunur. Fenol triol ekstraksiyonu durumunda, kalıntı reaktif kontaminasyonu, 220 ile 240 nanometre arasındaki anormal spektrumların yanı sıra 260 ile 280 nanometre bölgesindeki kaymalarla belirtilebilir.

Aksine, kolon ekstraksiyonundan kalan guanidin, 230 nanometre civarında bir pike ve çukurun 230 nanometreden yaklaşık 240 nanometreye kaymasına neden olabilir. Numune saflığını doğru bir şekilde değerlendirmek için 2 62 80 ve 2 62 30 oranları, genel spektral kalite ile birlikte analiz edilmelidir. Saf nükleik asitler tipik olarak sırasıyla DNA için yaklaşık 1,8 ve RNA için yaklaşık 2,0 oranında bir 2 62 80 oranı verir.

Bu oran, kör ve numune ölçümlerini gerçekleştirmek için kullanılan tampon çözeltinin pH değerine ve iyonik gücüne bağlıdır. Banana drop 3, 300 florospektrometre, NanoDrop 2000 C spektrofotometresi ile aynı patentli mikro hacimli numune tutma sistemini kullanır. Floresans ölçümleri yalnızca bir mikrolitre numune ile gerçekleştirilirken, kullanıcı, numuneye yatay olarak ışın gönderen üç LED'den birini uyarım kaynağı olarak seçer.

Ardından, örnek floresansı 90 derecelik bir açıyla dikey olarak dahili bir spektrometreye toplanır. NanoDrop 3, 300 kullanılarak mikro hacimli nükleik asit miktar tayininde yüksek hassasiyeti göstermek için Pico Green floresan kiti kullanılır; öncelikle kit standartları ve tüm nükleik asit örneklerinin oda sıcaklığına gelmesi sağlanır. Floresan örnekler ışığa duyarlıdır ve kehribar rengi veya alüminyum folyoyla sarılmış tüplerde saklanmalıdır.

Ölçülecek tüm standartlar ve örneklerin yanı sıra ihtiyaç duyulacak pico green çalışma çözeltisi için yeterli miktarda bir XTE tamponu hazırlayın. Üreticinin protokolüne uygun olarak, sağlanan 20 XTE tamponunu nükleaz içermeyen su ile seyrelterek bir XTE tamponu hazırlayın. Reaksiyon hacimleri 200 microliters ile 10 microliters kadar düşük değerler arasında değişebilir.

Bu örnekte, 10 µL reaksiyon hacimleri hazırlayacağız. Ardından, bilinmeyen DNA örneklerinin beklenen konsantrasyon aralığını kapsayacak şekilde, seri dilüsyona uğratılmış çift zincirli DNA standartları ve nükleaz içermeyen flakonlar veya tüpler hazırlayın.

Seyreltilmiş çift zincirli DNA standartlarının her birinden beş µL'yi, ayrı ayrı etiketlenmiş nükleaz içermeyen kehribar renkli veya folyo ile kaplanmış tüplere aktarın. Ardından, ilgilenilen her bir çift zincirli DNA örneğinden beş µL'yi uygun şekilde ışık korumalı tüplere paylaştırın. Pico Green Çalışma çözeltisini üreticinin protokolüne göre hazırladıktan sonra, çift zincirli DNA standardı veya çift zincirli DNA örneği içeren her bir tüpe, bu durumda beş µL olacak şekilde, çözeltiden eşit hacimde aktarın.

Eşit hacimlerde XTE tamponu ve Pico Green çalışma çözeltisini birleştirin. Referans çözelti görevi görecek olan negatif kontrolü hazırlayın. Her tüpün içeriğini nazikçe pipetleyerek iyice karıştırın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin.

Floresan sinyali sıcaklıktan etkilendiği için tüm standartlar ve örnekler ölçümden önce aynı sıcaklıkta dengelenmelidir. Cihazı hazırlamak ve ölçümleri gerçekleştirmek için öncelikle örnek tutma sisteminin alt ve üst yüzeylerini temizleyin, alt optik yüzeyin yakınına iki ila üç µL deiyonize su pipetleyin. Ardından kolu açın ve alt ve üst kaideleri temiz, hav bırakmayan bir laboratuvar mendiliyle kurulayın.

İşleme geçmeden önce yüzeylerin tüyden arındırılmış olduğundan emin olun. Tüy, bir eksitasyon kaynağının varlığında floresans sergileyebilir ve ölçümü etkileyebilir. Cihaz yazılımını açın.

Nükleik asit uygulamasını ve pico green çift sarmallı DNA seçeneğini seçin; alt kaideye 2 µL 1X TE pipetleyin. Kaldıraç kolunu kapatın ve cihaz yazılımı alanından blank seçeneğini belirleyin. Blank işlemi tamamlandığında, numune tutma sisteminin her iki yüzeyindeki blank çözeltisini silerek temizleyin.

Ardından, düşük tutulumlu uçlar kullanarak nazikçe pipetleme yaparak referans çözeltiyi karıştırın. Alt kaideye iki mikrolitre referans çözelti pipetleyin ve kaldıraç kolunu kapatın. Standartlar sekmesi altından referansı seçin ve istenen birimleri belirleyin.

Ölçüm döngüsünü başlatmak için measure düğmesine tıklayın. Ölçüm döngüsü tamamlandığında, manivela kolunu açın ve örnek tutma sistemi yüzeylerini iyice kurulayın. Her tekrar için yeni bir Eloqua kullanarak referansın beş tekrara kadar ölçümünü yapın.

Standart eğrisi oluşturmak için işlemi diğer standartlar için tekrarlayın. Yedi standarta kadar kullanılabilir. Yazılım, her bir standart için beş tekrara kadar veri depolayacak şekilde tasarlanmıştır.

Örnek konsantrasyonlarının otomatik olarak belirlenmesini sağlayan bir standart eğri oluşturmak için standartların tekrarlarının ortalaması alınır. Standart eğri tamamlandığında, örnekler sekmesini seçin, ilgili örnek kimliği bilgilerini girin ve her bir bilinmeyen örneği ölçün. Geçerli bir eğri, minimum standart sayısının karşılandığını gösterir.

DNA konsantrasyonu, standart eğriye göre otomatik olarak belirlenir. NanoDrop mikro hacim cihazları, nükleik asit konsantrasyonunu doğrudan A₂₆₀ ölçümleriyle veya dolaylı florometrik yöntemlerle tespit edebilir. NanoDrop spektrofotometreleri ayrıca, doğrudan A₂₈₀ absorbansı veya protein kolorimetrik assay'leri kullanılarak proteinlerin miktarını belirlemek için de kullanılabilir.