Name: Nükleik Asitlerin NanoDrop Microvolume kantitasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-22T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Öğrenin, NanoDrop mikrohacim sistemleriyle nükleik asit kantitasyonu için doğrudan ve floresan ölçüm protokollerini. Bu yöntemler, moleküler biyoloji laboratuvarlarında hızlı ve hassas analiz sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Richard W. Beringer ve David L. Ash, teknik yardım ve film çekimi için başvurular Bilim adamları, Thermo Scientific NanoDrop ürünleri.

1. Microvolume Nükleik Asit Niceleme NanoDrop 2000c Spektrofotometre <ol><li> Başlamak için, optik alt yüzeye temiz deiyonize su 2 - 3 mcL pipetleme microvolume spektrofotometre numune tutma sistemi, üst ve alt optik yüzeyler temiz. </li><li> Üst kaide deiyonize su ile temas halinde gelir sağlamak, kol kapatın. Kol kaldırın ve her iki optik yüzeyler temiz, kuru, tüy bırakmayan ücretsiz laboratuvar silin silin. </li><li> NanoDrop yazılımını açın ve Nükleik Asit uygulamayı seçin. Optik alt yüzeye tampon 1 mcL dağıtım boş bir ölçüm gerçekleştirmek için küçük bir hacim, kalibre pipet kullanın. Alt kol ve Nükleik Asit uygulaması "Boş" seçeneğini seçin. </li><li> Sonra boş bir ölçüm tamamlandığında, optik yüzeyler hem de temiz temiz, kuru, tüy bırakmayan ücretsiz laboratuvar silin. </li><li> Ölçülecek numune için uygun sabit seçin. <table border="1"><tbody><tr><td> Örnek Türü </td><td> Seçenek Seçin </td><td> Konsantrasyonunun hesaplanması için kullanılan sabit </td></tr><tr><td> dsDNA </td><td> DNA-50 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> ssDNA </td><td> DNA-33 </td><td> 33 </td></tr><tr><td> RNA </td><td> RNA-40 </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Oligo </td><td> Özel </td><td> 15-150 </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Tipik bir NanoDrop microvolume spektrofotometre, TrayCell Microcell küvet ile kullanılan geleneksel bir küvet tabanlı spektrofotometre ve PicoGreen testi ile birlikte bir microvolume NanoDrop fluorospectrometer kullanarak doğrudan A280 absorbans ölçümleri için nükleik asit konsantrasyon aralıkları. </li><li> 1 mcL nükleik asit örnek optik alt kaide üzerine koyun ve kol kapatın. Ölçümü bağımsız ses olduğundan, örnek, sadece yapılacak bir ölçüm için iki optik yüzeyler arasında köprü gerekir. </li><li> Uygulama yazılımı "Ölçü" i seçin. Yazılım otomatik olarak nükleik asit konsantrasyonu ve saflık oranları hesaplar. Örnek ölçüm ardından, spektral çıktısını gözden geçirin. </li><li> Yazılım otomatik olarak nükleik asit konsantrasyonu ve saflık oranları hesaplar. Örnek ölçüm ardından, örnek kalitesini değerlendirmek için spektral görüntü gözden geçirin. </li><li> Tipik bir nükleik asit örneği çok karakteristik bir profile sahip. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1: Tipik bir nükleik asit örneği çok karakteristik bir profile sahip. </li><li> Ortak spesifik nükleik asit izolasyon teknikleri ile ilişkili bulaşanların kaynakları Fenol / Trizol ve sütun çıkarma içerir. Fenol / Trizol çıkarma durumda, kalıntı reaktif kontaminasyonu 220 - 240 nm arasında anormal spektrumları yanı sıra 260-280 nm bölgede vardiya endike olabilir. Tersine, sütun çıkarma artık guanidin tepe ve çukur bir kayma yaklaşık 240 nm 230 nm 230 nm yakın bir katkıda bulunabilir. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2, B ve C örnekleri zirveler ve dipler vardiya olarak kirleticiler, nükleik asit örneklerinin spektrumları nasıl etkilediğini göstermek örnek kıyasla. </li><li> Doğru örnek kalitesini değerlendirmek için, 260/280 ve 260/230 oranları genel spektral kalite ile birlikte analiz edilmelidir. Saf nükleik asitler genellikle sırasıyla ~ 1.8 oranı 260/280 ve 260/280 oranı ~ 2.0 DNA ve RNA için bir verim. Bu oran, boş ve örnek ölçümleri yapmak için kullanılan tampon pH ve iyonik kuvvet bağlıdır. Asidik çözümler temel bir çözüm 0.2-0.3 oranı fazla temsil edecek iken, 0.2-0.3 oranı altında temsil edecek. Önemli ölçüde farklı saflık oranları, 280 nm veya yakınındaki kuvvetle absorbe protein, fenol ya da diğer kirleticiler varlığına işaret edebilir. 260/230 saflık oranı 1.8-2.2 aralığında yaygın bir "saf" nükleik asit değerleri ile DNA saflık ikinci bir ölçüsüdür. Saflık beklenen değerlere göre anlamlı derecede düşük oranlar kullanılan izolasyon tekniği daha fazla optimizasyon isteyebilir gösterebilir. </li><li> NanoDrop spektrofotometreler da doğrudan absorbans kullanarak protein ya da protein kolorimetrik testleri ile ölçmek için kullanılabilir. Uygun sütun oluşumu ve tekrarlanabilirlik sağlamak için, 2-ul örnekleri protein örnekleri için tavsiye edilir. Aşağıdaki vallahi video bakın: Microvolume Protein Konsantrasyonu Tayini <a href="https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610</a> NanoDrop Spektrofotometre </li></ol><ol><li> NanoDrop 3300 kullanarak yüksek hassasiyetli microvolume nükleik asit kantitatif göstermek için, bir PicoGreen floresan kiti kullanılır. Başlamak için, oda sıcaklığına kadar kiti standartları ve nükleik asit örneklerinin dengelenmesi. Floresan örnekleri ışığa duyarlı ve kehribar veya alüminyum sarılmış tüpler tutulmalıdır. </li><li> , Gerekli olacak PicoGreen çalışma çözeltisinin yanı sıra ölçülebilir tüm standartlar ve örnekler için yeterli 1x TE tampon hazırlayın. 20x TE tampon üreticinin protokol başına nükleaz içermeyen su ile seyreltilmesi ile 1xTE tampon hazırlayın. Reaksiyon hacmi 200 mcL kadar az 10 ul uzanabilir. Bu örnekte, 10 mcL reaksiyon hacmi hazırlanacaktır. </li><li> Nükleaz şişeleri ya da tüpler 2x nihai istenen konsantrasyona seri seyreltilmiş dsDNA standartları hazırlayın. Nükleaz içermeyen amber veya folyo kaplı tüp etiketli bir birey haline seyreltilmiş dsDNA standartlarını her 5 mcL aktarın. </li><li> Uygun etiketli nükleaz içermeyen sarı veya folyo kaplı tüpler içine ilgi her dsDNA örnek kısım 5 mcL. </li><li> Üretici firmanın protokolüne göre PicoGreen çalışma çözeltisi hazırlayın. PicoGreen çalışma çözeltisi eşit hacimde bir ilgi standart ya da numune (bu örnekte 5 mcL) da içeren her tüp aktarın. </li><li> Bir referans çözüm olarak hizmet veren negatif kontrol hazırlamak, 1x TE tampon ve PicoGreen çalışma çözeltisi eşit hacimlerde birleştirin. </li><li> Nazik pipetleme ile iyice karıştırın ve Her reaksiyon tüpü içeriğini reaksiyonların, oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Floresan sinyal sıcaklığından etkilenir gibi tüm standartlar ve örnekler önce aynı ölçüm sıcaklığına gelmesi beklenmelidir. </li><li> Alet hazırlamak ve ölçümlerini yapmak, ilk numune tutma sistemi alt ve üst yüzeyleri temizlemek. Optik alt yüzeye deiyonize su pipetleyin 2 3 mcL yakın, sonra kol ve temiz, havsız ile alt ve üst kaideleri blot, laboratuvar silin. Yüzeyleri tüy bırakmayan bir floresan bir uyarım kaynağının varlığını gösterirler ve ölçümü ile karışabilir geçmeden önce tüy bırakmayan ücretsiz olun. </li><li> , Cihazın yazılımını açın "Nükleik Asitler" uygulamasını seçin ve "PicoGreen-dsDNA" seçeneğini seçin. </li><li> Araç boş için, alt kaide 1x TE 2 mcL ekleyin, kol kapatın ve cihaz yazılımı alanında "Boş" seçeneğini seçin. Boş komple sonra, numune tutma sistemi her iki yüzeyine boş bir çözüm kurulayın. </li><li> Nazik pipetleme referans çözüm karıştırın. Alt kaide üzerine düşük tutma ipuçları, pipet 2 mcL kullanma ve kol yakın. </li><li> Ölçüm tipi "Referans" seçin ve istenilen birimleri seçin. Ölçüm döngüsü başlatmak için "Ölçü" ı tıklayın. </li><li> Ölçüm döngüsü tamamlandığında, kol açık ve iyice kurulayın numune tutma sistemi yüzeyler. Beş kadar ölçüm her çoğaltmak için taze bir kısım kullanarak, referans çoğaltır. </li><li> Standart bir eğri oluşturmak için ek standartlar için bu işlemi tekrarlayın. Kadar yedi standartları kullanılıyor olabilir. Bu yazılım, her standart için beş çoğaltır kadar saklamak için tasarlanmıştır. Standartların çoğaltır örnek konsantrasyonları otomatik olarak belirlendiği ve standart bir eğri oluşturmak için ortalaması alınır. </li><li> Standart eğri tamamlandıktan sonra, "Örnekler" sekmesini seçin, ilgili örnek kimlik bilgilerini girin ve her bilinmeyen numune ölçün. </li></ol>

<ol><li>Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pH+and+Ionic+Strength+on+the+Spectrophotometric+Assessment+of+Nucleic+Acid+Purity%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Effect of pH and Ionic Strength on the Spectrophotometric Assessment of Nucleic Acid Purity.</a> BioTechniques. 22, 474-481 (1997).</li>
<li>Voolstra, C., Jungnickel, A., Borrmann, L., Kirchner, R., Huber, A. Spectrophotometric Quantification of Nucleic Acids: LabelGuard enables photometric quantification of submicroliter samples using a standard photometer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVoolstra%2C+C+%22Implen+Applications+Note%22">Implen Applications Note</a>. , Munich, Germany. (2006).</li>
<li>Jr, I. ngle, D, J., Crouch, S. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJr%2C+Ingle+%22Spectrochemical+analysis%22">Spectrochemical analysis</a>. , Prentice Hall. Englewood Cliffs, NJ. XV-590 (1988).</li>
<li>Van Lancker, M., Gheyssens, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+four+frequently+used+assays+for+quantitative+determination+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Lett%22%5BJournal%5D)">A comparison of four frequently used assays for quantitative determination of DNA.</a> Anal. Lett. 19, 615-623 (1986).</li>
</ol>

Philippe Desjardins ve Debra Conklin Bu makalede kullanılan aletleri üreten Thermo Scientific NanoDrop Ürünler, Inc tarafından istihdam edilmektedir.

Burada sunulan kantitatif protokolleri en yaygın kabul gören microvolume sistemleri dayanmaktadır. Bu tür sistemler daha fazla numune hacimleri ve çevreleme cihazların kullanımı güveniyor geleneksel nükleik asit kantitatif metodoloji için pratik alternatifler sağlar. NanoDrop microvolume teknolojisi, yüzey gerilimi özellikleri üzerine bir sıvı sütunu oluşturmak için ölçülen örnek güvenir bir örnek tutma sistemi kullanmaktadır. Bu örnek, uygun sütun oluşumu için alt ve üst optik ölçüm yüzeyleri ile temas yaptığı esastır. Eğer herhangi bir noktada ölçüm sonuçlarının yanlış ya da tekrarlanabilir değil gibi görünüyor, büyük olasılıkla örnek heterojenite veya sıvı sütun kırılması sonucu. Deterjan ve temizlik maddeleri, kaide ölçüm yüzeyleri uncondition olarak izopropil alkol tavsiye edilmez. Koşulsuz kaide örnek damlacık bir düzleşme, kaide hidrofobik yüzey özellikleri uzlaşılan olduğu zaman oluşur. Koşulsuz kaideleri ölçüm sırasında sıvı sütunun kırılmaya yol açabilir. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 koşulsuz yüzey, bir su damlasının bir düzleşme tarafından karakterize edilir . Uncondtioned kaide yüzeyleri NanoDrop Ayak Yenileme Bileşik (PR-1, Thermo Scientific NanoDrop Ürünleri) kullanılarak yenilenmiş olabilir. ~ 30 saniye süreyle kurumasına izin, üst ve alt kaide yüzeyleri, bileşik yenileme ince bir tabaka uygulanır, daha sonra temiz, kuru, tüy bırakmayan ücretsiz laboratuvar silin kullanarak ovuşturdu. Başarılı bir şekilde yenilenmiş bir devlet, bir su damlacığı alt kaide yüzeyine uygulandığında kadar boncuk ile karakterizedir. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 yenilenmiş bir yüzey, bir su damlasının bir boncuk tarafından karakterize edilir . Microvolume kantitatif sistemleri büyük ölçüde örnek tüketimini azaltmak ve daha geleneksel kantifikasyon sistemleri ile kıyaslandığında önemli ölçüde konsantrasyon aralığı artırmak. Microvolume kantitatif genellikle iğne biyopsileri ve lazer yakalama mikrodiseksiyon sınırlı hücre gibi kütle, verimlilik ve kolaylığı bu metodoloji yaptı yaygın olarak kabul gören alternatif geleneksel nükleik asit kantitatif yöntemleri içeren durumlar için elverişli bir teknoloji haline gelmiştir rağmen bile Örnek bol olduğu zaman.

<table><tbody><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 3300</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-3300</td><td></td></tr></tbody></table> Serisi

nükleik asitlerin nanodrop microvolume kantitasyonu

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biyomoleküler deneyleri genellikle microvolume kantitatif gerçekleştirebileceğiniz bu nükleik asit kantitatif geleneksel küvet-temelli araçların kullanımını engelleyen, sürekli kullandığınız malzemenin giderek daha az miktarlarda gelişmiş ediliyor. NanoDrop microvolume numune tutma sistemi (Thermo Scientific NanoDrop Ürünler) Küvet veya kapiler gibi geleneksel çevreleme cihazların bağımsız örnek dakika miktarda yakalamak ve korumak için fiber optik teknoloji ve doğal yüzey gerilim özelliklerini birleştirerek fonksiyonları. Ayrıca, sistem, aslında dilüsyonları gerçekleştirmek için ihtiyacı ortadan kaldırır. Kısa yol uzunluklarında, nükleik asit konsantrasyon ölçümleri geniş bir yelpazede Sonuç olarak, istihdam Spektroskopik analiz için gerekli olan örnek hacminin azaltılması da dahil birçok moleküler iş akışları boyunca ek kalite kontrol adımları kolaylaştırır verimliliğin artırılması ve sonuçta aşağı sonuçlarında daha fazla güven. Sınırlı bir kitle yüksek hassasiyetli floresan analizi için ihtiyaç da deneysel son gelişmeler ile ortaya çıkmıştır. Aynı microvolume örnek saklama teknolojisini kullanarak, floresan ölçümler, floresan testleri hacim gereksinimleri önemli ölçüde azaltılabilir sağlayan 2 mcL malzeme ile olabilir. Bu mcL 10 veya daha az microreactions adanmış microvolume fluorospectrometer kullanarak artık mümkün. İki microvolume nükleik asit kantitatif protokolleri geleneksel küvet tabanlı protokoller için pratik alternatif olarak entegre numune tutma sistemleri kullanan gösterilecektir. Birincisi, bir microvolume spektrofotometre kullanarak doğrudan A260 absorbans yöntemi açıklanmıştır. Bu microvolume fluorospectrometer ile az hacimli floresan reaksiyonlar sağlayan bir floresan tabanlı bir yöntem bir gösteri izledi. Bu yeni teknikler 1 pg / ml numune en az tüketim ile 15.000 ng / ml arasında değişen nükleik asit konsantrasyonlarının değerlendirilmesi sağlar.

Pratik ve verimli bir alternatif olarak geleneksel nükleik asit kantitatif metodolojiye NanoDrop microvolume sistemlerinin kullanımı iki microvolume nükleik asit kantitatif protokolleri gösteri ile tarif edilir.

Nükleik Asitlerin NanoDrop Microvolume kantitasyonu

Sürekli olarak, giderek daha az miktarda materyal kullanan biyomoleküler analizler geliştirilmektedir ve bu durum genellikle geleneksel ... kullanımını imkansız kılmaktadır.

NanoDrop Numune tutma sistemi, QTS veya kılcallar kullanmadan, sıvıların doğal yüzey gerilimini kullanarak mikro hacimli numuneleri iki optik kaide arasında tutan ve ölçen yenilikçi bir teknolojidir. Alt optik yüzeyin üzerine doğrudan bir mikrolitre kadar az numune pipetlenir. Spektrometre kolu kapatıldığında, üst ve alt optik kaideler arasında bir sıvı sütunu oluşur.Yüzey gerilimi ile dikey bir optik yol oluşturulması sayesinde, dikey yol uzunluğu ölçüm sırasında gerçek zamanlı olarak otomatik olarak değişebilir. Yol uzunluğunun kısalması daha yüksek konsantrasyonların ölçülmesine olanak tanıyarak, çoğu nükleik asit örneği için dilüsyon yapma gereksinimini etkili bir şekilde ortadan kaldırır. Ayrıca, örnek tutma sistemi, optik yüzeylerin sadece bir laboratuvar silgisi ile silinmesinden ibaret olan hızlı bir temizleme işlemiyle deneysel süreci hızlandırır.Bugün, Thermo Scientific mikro hacim cihazları kullanılarak nükleik asit konsantrasyonunun belirlenmesine yönelik iki prosedürü göstereceğiz. İlk protokol, NanoDrop 2000 C spektrofotometresi kullanılarak yapılan doğrudan nükleik asit ölçümüdür. İkinci protokol ise NanoDrop 3000 fluoro spektrometresi kullanılarak yapılan dolaylı floresan nükleik asit ölçümüdür.Başlamak için, alt optik yüzeye iki ila üç mikrolitre temiz deiyonize su pipetleyerek mikro hacimli spektrofotometre numune tutma sisteminin üst ve alt optik yüzeylerini temizleyin. Üst kaidenin deiyonize suyla temas ettiğinden emin olarak kaldıraç kolunu kapatın. Kaldıraç kolunu kaldırın ve her iki optik yüzeyi temiz, kuru, tüy bırakmayan bir laboratuvar silgisiyle silin.Ardından, NanoDrop yazılımını açın ve nükleik asit uygulamasını seçin. Alt optik yüzeye bir mikrolitre tampon çözelti damlatarak, düşük hacimli kalibre edilmiş bir pipetle boş ölçüm gerçekleştirin. Manivela kolunu indirin ve nükleik asit uygulamasındaki boş (blank) seçeneğini belirleyin.Blank ölçümü tamamlandıktan sonra, her iki optik yüzeyi de bir laboratuvar mendili ile temizleyin. Daha önce olduğu gibi, ölçülecek örnek için uygun sabiti seçin. Ardından, alt optik kaide üzerine bir mikrolitre nükleik asit örneği damlatın ve kaldıraç kolunu kapatın.Ölçüm hacimden bağımsız olduğu için numunenin yalnızca iki optik yüzey arasındaki boşluğu doldurması yeterlidir. Ölçüm yapmak için uygulama yazılımından measure seçeneğini belirleyin; yazılım, nükleik asit konsantrasyonunu ve saflık oranlarını otomatik olarak hesaplayacaktır. Numune ölçümünün ardından spektral çıktıyı inceleyin. Tipik bir nükleik asit numunesi, oldukça karakteristik bir profile sahip olacaktır.Düşük kaliteli bir örneğin spektral göstergeleri arasında, çukurda ve 260 nanometre pikinde görülen dalga boyu çentikleri yer alır. Belirli nükleik asit izolasyon teknikleriyle ilişkili yaygın kontaminan kaynakları arasında fenol, triol ve kolon ekstraksiyonu bulunur. Fenol triol ekstraksiyonu durumunda, kalıntı reaktif kontaminasyonu, 220 ile 240 nanometre arasındaki anormal spektrumların yanı sıra 260 ile 280 nanometre bölgesindeki kaymalarla belirtilebilir.Aksine, kolon ekstraksiyonundan kalan guanidin, 230 nanometre civarında bir pike ve çukurun 230 nanometreden yaklaşık 240 nanometreye kaymasına neden olabilir. Numune saflığını doğru bir şekilde değerlendirmek için 2 62 80 ve 2 62 30 oranları, genel spektral kalite ile birlikte analiz edilmelidir. Saf nükleik asitler tipik olarak sırasıyla DNA için yaklaşık 1,8 ve RNA için yaklaşık 2,0 oranında bir 2 62 80 oranı verir.Bu oran, kör ve numune ölçümlerini gerçekleştirmek için kullanılan tampon çözeltinin pH değerine ve iyonik gücüne bağlıdır. Banana drop 3, 300 florospektrometre, NanoDrop 2000 C spektrofotometresi ile aynı patentli mikro hacimli numune tutma sistemini kullanır. Floresans ölçümleri yalnızca bir mikrolitre numune ile gerçekleştirilirken, kullanıcı, numuneye yatay olarak ışın gönderen üç LED'den birini uyarım kaynağı olarak seçer.Ardından, örnek floresansı 90 derecelik bir açıyla dikey olarak dahili bir spektrometreye toplanır. NanoDrop 3, 300 kullanılarak mikro hacimli nükleik asit miktar tayininde yüksek hassasiyeti göstermek için Pico Green floresan kiti kullanılır; öncelikle kit standartları ve tüm nükleik asit örneklerinin oda sıcaklığına gelmesi sağlanır. Floresan örnekler ışığa duyarlıdır ve kehribar rengi veya alüminyum folyoyla sarılmış tüplerde saklanmalıdır.Ölçülecek tüm standartlar ve örneklerin yanı sıra ihtiyaç duyulacak pico green çalışma çözeltisi için yeterli miktarda bir XTE tamponu hazırlayın. Üreticinin protokolüne uygun olarak, sağlanan 20 XTE tamponunu nükleaz içermeyen su ile seyrelterek bir XTE tamponu hazırlayın. Reaksiyon hacimleri 200 microliters ile 10 microliters kadar düşük değerler arasında değişebilir.Bu örnekte, 10 µL reaksiyon hacimleri hazırlayacağız. Ardından, bilinmeyen DNA örneklerinin beklenen konsantrasyon aralığını kapsayacak şekilde, seri dilüsyona uğratılmış çift zincirli DNA standartları ve nükleaz içermeyen flakonlar veya tüpler hazırlayın.Seyreltilmiş çift zincirli DNA standartlarının her birinden beş µL'yi, ayrı ayrı etiketlenmiş nükleaz içermeyen kehribar renkli veya folyo ile kaplanmış tüplere aktarın. Ardından, ilgilenilen her bir çift zincirli DNA örneğinden beş µL'yi uygun şekilde ışık korumalı tüplere paylaştırın. Pico Green Çalışma çözeltisini üreticinin protokolüne göre hazırladıktan sonra, çift zincirli DNA standardı veya çift zincirli DNA örneği içeren her bir tüpe, bu durumda beş µL olacak şekilde, çözeltiden eşit hacimde aktarın.Eşit hacimlerde XTE tamponu ve Pico Green çalışma çözeltisini birleştirin. Referans çözelti görevi görecek olan negatif kontrolü hazırlayın. Her tüpün içeriğini nazikçe pipetleyerek iyice karıştırın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin.Floresan sinyali sıcaklıktan etkilendiği için tüm standartlar ve örnekler ölçümden önce aynı sıcaklıkta dengelenmelidir. Cihazı hazırlamak ve ölçümleri gerçekleştirmek için öncelikle örnek tutma sisteminin alt ve üst yüzeylerini temizleyin, alt optik yüzeyin yakınına iki ila üç µL deiyonize su pipetleyin. Ardından kolu açın ve alt ve üst kaideleri temiz, hav bırakmayan bir laboratuvar mendiliyle kurulayın.İşleme geçmeden önce yüzeylerin tüyden arındırılmış olduğundan emin olun. Tüy, bir eksitasyon kaynağının varlığında floresans sergileyebilir ve ölçümü etkileyebilir. Cihaz yazılımını açın.Nükleik asit uygulamasını ve pico green çift sarmallı DNA seçeneğini seçin; alt kaideye 2 µL 1X TE pipetleyin. Kaldıraç kolunu kapatın ve cihaz yazılımı alanından blank seçeneğini belirleyin. Blank işlemi tamamlandığında, numune tutma sisteminin her iki yüzeyindeki blank çözeltisini silerek temizleyin.Ardından, düşük tutulumlu uçlar kullanarak nazikçe pipetleme yaparak referans çözeltiyi karıştırın. Alt kaideye iki mikrolitre referans çözelti pipetleyin ve kaldıraç kolunu kapatın. Standartlar sekmesi altından referansı seçin ve istenen birimleri belirleyin.Ölçüm döngüsünü başlatmak için measure düğmesine tıklayın. Ölçüm döngüsü tamamlandığında, manivela kolunu açın ve örnek tutma sistemi yüzeylerini iyice kurulayın. Her tekrar için yeni bir Eloqua kullanarak referansın beş tekrara kadar ölçümünü yapın.Standart eğrisi oluşturmak için işlemi diğer standartlar için tekrarlayın. Yedi standarta kadar kullanılabilir. Yazılım, her bir standart için beş tekrara kadar veri depolayacak şekilde tasarlanmıştır.Örnek konsantrasyonlarının otomatik olarak belirlenmesini sağlayan bir standart eğri oluşturmak için standartların tekrarlarının ortalaması alınır. Standart eğri tamamlandığında, örnekler sekmesini seçin, ilgili örnek kimliği bilgilerini girin ve her bir bilinmeyen örneği ölçün. Geçerli bir eğri, minimum standart sayısının karşılandığını gösterir.DNA konsantrasyonu, standart eğriye göre otomatik olarak belirlenir. NanoDrop mikro hacim cihazları, nükleik asit konsantrasyonunu doğrudan A₂₆₀ ölçümleriyle veya dolaylı florometrik yöntemlerle tespit edebilir. NanoDrop spektrofotometreleri ayrıca, doğrudan A₂₈₀ absorbansı veya protein kolorimetrik assay'leri kullanılarak proteinlerin miktarını belirlemek için de kullanılabilir.

nanodrop-microvolume-quantitation-of-nucleic-acids

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video metillenmiş DNA immunoprecipitation (MeDIP) için protokol göstermektedir. MeDIP seçici (anti-5 mC) 5-methylcytosine özgüllüğü antikorlar kullanılarak genomik DNA örneği metillenmiş DNA parçaları ayıklar iki günlük bir işlemdir.

Metillenmiş DNA Immunoprecipitation

Microvolume örnekleri doğal yüzey gerilimi, küvet ya da kılcal damarların kullanmadan örnekleri korumak için kullanan bir spektrofotometre sistem tarafından sayısal. Ölçülebilir olan protein konsantrasyonları ve hız dinamik aralık, bu yöntem büyük ölçüde artmıştır.

NanoDrop 2000c Spektrofotometre kullanılarak Microvolume Protein Konsantrasyonu Tayini

Bu iletişim, doğruluk ve tekrarlanabilirlik dsDNA ve protein kantitatif BioSpec-nano UV-VIS spektrofotometre veri sunmaktadır. Ultra-küçük birimler bile otomatik silme fonksiyonu, hacmi ve daha kesin sonuçlar için en az taşınmasını sonuçları artırıyor (1 ila 2 L), tekrarlanabilirlik, mükemmel.

Konsantrasyon belirlenmesi Micro hacimli Bio-spec Nano Spektrofotometre Nükleik Asitler ve Proteinler

Bu video, DNA örneklerindeki tek nükleotid varyasyonlarının tespiti için tüp içinde çip formatında dijital PCR'nin faydasını göstermektedir. Tek bir PCR reaksiyonu, bağımsız PCR reaksiyonları olarak işlev gören odalara bölünür ve odalardaki güçlendirilmiş hedeflerden gelen floresan sinyallerinin tespiti, numunedeki varyant alelin frekansını hesaplamak için kullanılır.

Tek nükleotid varyantlarının miktar tayini için tüp içinde çip tabanlı dijital PCR

MicroRNA'lar (miRNA'lar), yaygın olarak korunan bir düzenleyici molekül sınıfıdır. Burada, iki güçlü ligasyon adımına ve ardından yüksek verimli dizilemeye dayanan bir miRNA klonlama yöntemini açıklıyoruz. Yöntemimiz, miRNA'ların genom çapında doğru bir şekilde kantitasyonuna izin verir.

Yüksek Verim Dizilimine tarafından MicroRNA ölçümü için Küçük RNA molekülleri, yüksek Verimli ligasyonu

Basitleştirilmiş (analog) bir okuma ile nükleik asitleri ölçmek için bir uç nokta dijital testi tanımlıyoruz. Damlacık bazlı dijital tahlillerin toplu floresansını özel enstrümantasyon yerine standart bir qPCR makinesi kullanarak ölçüyoruz ve sonuçlarımızı mikroskopi ile doğruluyoruz.

Dijital Nükleik Asit Kantifikasyon Tahliller Basit Toplu Saati

Boya bazlı bir kimya ve damlacık dijital PCR teknolojisi kullanılarak hücresiz mikroRNA'ların miktar tayini için hassas ve doğru bir yöntem açıklanmaktadır.

MicroRNA Niceleme DNA bağlayıcı Boya Kimya ve Damlacık Dijital PCR kullanarak Sirkülasyon

Semiflexible polimerler canlı sistemler tarafından yaygın olarak uygulanan benzersiz mekanik özellikler görüntüler. Ancak, polimer sertlik gibi özellikleri erişilemez olduğundan biyopolimer sistematik çalışmalar sınırlıdır. Bu müsvedde filaman sertlik etkisi üzerinde deneysel çalışmalar etkinleştirme programlanabilir DNA nanotüpler tarafından bu sınırlama nasıl hile açıklar.

DNA nanotüpler Semiflexible polimerler eğitim için çok yönlü bir araç olarak

Burada, tek hücrelerde mutlak mitokondriyal (mt) DNA kopya sayısını ve mtDNA delesyon heteroplazmi seviyelerini ölçmek için bir protokol sunuyoruz.

Dijital Damlacık Polimeraz Zincir Reaksiyonu Kullanarak Tek Hücreli Mitokondriyal DNA Kopya Sayısını ve Heteroplazmiyi Ölçme

DNAzyme tabanlı nanomakineler, nükleik asitlerin son derece seçici ve hassas tespiti için kullanılabilir. Bu makale, özgür yazılım kullanılarak 10-23 çekirdekli DNAzyme tabanlı nanomakinelerin tasarımı için ayrıntılı bir protokolü ve örnek olarak bir Epstein-Barr virüs parçasının tespitinde uygulanmasını açıklamaktadır.

DNAzyme 10-23 - Nükleik Asit Tanıma için Tabanlı Nanomakineler

Bu protokol, fare oküler lens epiteli ile fiber hücre yığın kütlesinin ayrılmasını, ardından RNA izolasyonunu ve qPCR analizini detaylandırır. Bu yöntem, epitel hücrelerinde ve farklılaşmış lif hücrelerinde transkriptom ve biyolojik süreçlerin daha ayrıntılı bir analizi için lens hücresi bölmelerinin ayrılmasına izin verir.

Fare Oküler Lens Epitelinden ve Fiber Hücre Yığın Kitlelerinden RNA İzolasyonu

Öğrenin, NanoDrop mikrohacim sistemleriyle nükleik asit kantitasyonu için doğrudan ve floresan ölçüm protokollerini. Bu yöntemler, moleküler biyoloji laboratuvarlarında hızlı ve hassas analiz sağlar.

Nükleik Asitlerin NanoDrop Microvolume kantitasyonu

Daha fazla video keşfet