Name: Pre-implantasyon Genetik Tanı için FISH (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-23T18:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Öğrenin, pre-implantasyon genetik tanı için FISH tekniğini kullanarak insan embriyolarından tek hücre biyopsilerini analiz etmeyi. Bu yöntem, kromozomal anormallikleri tespit ederek üreme teknolojilerinde embriyo seçimini geliştirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Parçalama ve biyopsi blastomer Nucleus Yayılma <ol><li> Yayılan hücreleri (% 0.2 Tween20 0,01 M HCl, pH 2.0) için hücre lizis tamponu 24 saat önceden hazırlanan ve -20 ° C'de saklanan olmalıdır 20 ml steril bir şırınga ve şırınga filtresi kullanarak 30 ml steril evrensel konteyner içine 100 ml ve 20 ml filtre hazırlayın. 10-15 1.7 ml steril mikrosantrifüj tüpler içine 1 ml alikotları koyun, kapatın ve önce donmaya karşı tüpler etiket. Bu, yeni bir toplu iş tatmin edici olup olmadığını test edilmiş ve kullanılabilir kullanımı iki farklı gruplar halinde, yeni bir parti ve bir önceki toplu, olması tavsiye edilir. </li><li> Defrost biyopsi işlemi 30 dakika önce oda sıcaklığında lizis tamponu. Pratik amaçlar için çalışma sıcaklığı, oda sıcaklığı ve el sıcaklık arasında olacaktır. </li><li> Bir elmas kalem ve ön-etiket durumunda numarası, benzersiz slayt numarası ve biyopsi tarihinden ile slayt kullanarak bir amin kaplı slayt (örneğin Genetix) alt kısmında küçük bir daire (yaklaşık 5 mm çapında) Puan. Ayrı bir sayısal sırayla her blastomer slayt ve embriyo sayısı ile etiket kullanın. Slaytlar gibi 4H gibi sert bir kalemle etiketli ve herhangi bir grafit toz kaldırmak için bir lateks eldiven ile "lekelenen" olmalıdır. </li><li> Daire içinde küçük bir hacim lizis tamponu yerleştirin. </li><li> Biyopsi blastomer lizis tamponu içine aktarın. Hücre lyse başlayıncaya kadar gerekli daire içinde lizis tamponu eklerseniz; hücre tamamen lyse ve sitoplazma tampon kurumadan dağıtmak. </li><li> Daire içinde kalır ve kayıp olduğunu sağlamak için çekirdeğin dikkat edin; hücre çekirdeğinde veya çoklu çekirdeklerin yoksa, başka bir hücreye biyopsi. </li><li> Slayt oda sıcaklığında kurumaya bırakın. </li></ol> 2 Tek bir blastomer Nucleus Situ Hibridizasyon <ol><li> Steril distile su içinde yapılan etanol serisi (70, 90 ve% 100) hazırlayın. </li><li> Açın ve 75 için sıcak bloğu (örneğin Hybaid Omnislide veya Vysis Hybrite) ° C </li><li> Defrost probları, vorteks, santrifüj ve. Reaktifler tanık ve prob karışımı yapmadan önce doğru bir şekilde kontrol edilmelidir. Pipet 0.65 mL steril mikrosantrifüj tüp ve kullanımdan önce vorteks ve santrifüj prob karışımı telafi etmek için üretici tarafından belirtilen birimleri. Sondası karışımın toplam hacmi çekirdeği başına 2 mcL test ve bir güvenlik marjı izin için en yakın 10 mcL kadar yuvarlanır için yeterli olmalıdır. </li><li> Coplin kavanozlarda oda sıcaklığında 5 dakika. Kullanarak fosfat tamponlu salin (PBS) (0.14 M NaCl, 3 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4 pH 7.0) Ön yıkama slaytlar </li><li> Slaytları iki kez steril distile su ile durulayın. </li><li> Etanol serisi (70, 90, ve% 100) ile oda sıcaklığı ve hava-kuru her biri 2 dakika için slaytlar dehydrate. Emin olun slaytlar tam dalmış ve eğer herhangi bir yüzeye grafit toz yüzer, temiz bir mendil ile ıslatın. </li><li> Bir faz kontrast mikroskop ile görselleştirme daire içinde çekirdeğin konumunu kaydedin. </li><li> Oda sıcaklığında ve kuru hava az 2 dakika süreyle% 100 etanol ile dehydrate. </li><li> 2 mcL prob karışımı uygulayın ve 9 x 9 mm lamel (18 x 18 mm no.1 lamel dörtte biri) ile kaplayın. </li><li> Kauçuk çimento (İnek Prova örneğin İnek Sakız) ile lamel kenarlarında Seal. </li><li> 75 sıcak bir blok slaytlar Codenature ° C, daha sonra 5 dakika ve 37 nemlendirilmiş bir odasında (16-20 saat) bir gecede slayt melezleşme ° C. Sentromer probları (cinsiyete bağlı durumlar için yani) tamamen oluşur Probe karışımları melezleşme 60 dakika sonra tatmin edici bir sonuç verecektir. </li><li> 71 ile yeterli coplin kavanoz ve ısı ° C olan bir su banyosu hazırlayın </li><li> 0.4x standart tuzlu sitrat (SSC) sıkı bir yıkama çözeltisi (pH 7.0 az 71 ° C, 0.06 M NaCl, 6 mM C 6 H 5 Na 3 O 7 .2 H 2 O) ve ısı su banyosu hazırlayın . </li><li> Coplin kavanoz başına sıkı yıkama 50 ml Uygulama ve sıcaklık 71 olup olmadığını kontrol edin ° C hemen temiz bir termometre kullanarak kullanmadan önce. </li><li> Her bir slayt kauçuk çimento dikkatlice çıkartın ve oda sıcaklığında% 4x SSC/0.05 Tween20 (pH 7.0) kullanarak lamel durulayın. </li><li> 71 0.4x SSC sıkı yıkama slaytlar yıkayın ° C, 5 dk. Coplin kavanoz başına fazla 6 slayt yıkayın. </li><li> 4x SSC/0.05% Tween20 slaytlar, oda sıcaklığında 2 dakika süreyle yıkayın. </li><li> Prob karışımı dolaylı etiketli prob (ler) varsa, aşırı sıvı kaydırağı boşaltma ve Parafilm bir 20 x 20 mm kare altında floresan konjuge antikor 20 mcL uygulayın. </li><li> 37 nemlendirilmiş bir odasında ° C'de 15 dk. </li><li> Parafilm çıkartın ve oda sıcaklığında 2 dakika süreyle% 4x SSC/0.05 Tween20 kez yıkayın. </li><li> 2 dakika süreyle PBS bir iki kez yıkayınt oda sıcaklığında ve slaytlar drenaj. </li><li> Hayır, 22 x 22 mm DAPI / Vectashield (4 160 ng ',6-diamidino-2-phenylindole dihidroklorür Vectashield montaj orta, Vector Laboratuvarlar 1 ml) 6 mcL uygulayın. 0 lamel ve lamel üzerinde slayt ters. </li><li> Leke ve şeffaf tırnak cilası ile lamel kenarlarında mühür. </li></ol> 3. Floresan Mikroskobu kullanılarak analiz uygun Kullanılan Problar için uygun filtreler ile donatılmıştır. <ol><li> Bir floresan mikroskop ve tahlil her florokrom için tek bant-geçiren filtreler kullanılarak doğrudan görselleştirme Puan sinyaller. Her çekirdeğinde iki analistler tarafından atılırsa olmalıdır. Genel bir kural iki yakın aralıklı sinyaller daha az bir etki alanı dışında (sinyal genişliği) tek bir sinyal puanlama yol; ancak, deneyime dayalı kararı büyüklük, yoğunluk, değişik sinyaller ve ayırma yorumlamak olunması gerekmektedir. </li><li> Görüntüleme yazılımı kullanın (örneğin, İsis, MetaSystems, Altlussheim, Almanya; CytoVision, Genetix) görsel tanı onay için çekirdek bir görüntü yakalamak için, bir laboratuvar kalite güvencesi planının bir parçası olarak görüntü arşivleme için. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: Metafaz ve interfaz çekirdekleri kültürlü periferik kan lenfositleri seçilen probları (subtelomere probları transloke segment ve sentromer probu (ler) merkezli sadece melezleşme kesmenoktaları için bilgilendirici, translokasyon kromozom için özel olduğunu onaylamak için muayene edilmelidir segment (ler)) ve interfaz çekirdekleri sinyalleri parlak ve ayrık olmalıdır. 100 interfaz çekirdeği her sonda her bir ortak işaretlerinin sayısı, puanlama testinin etkinliğini değerlendirmek için tavsiye edilir. Bu durumda 2 sinyal 95% -99% çekirdeğinin her sonda skorlandı. Şekil 1 kromozom 5 ve 9 kısa kolları arasında karşılıklı translokasyon için bir hazırlık metafaz ve interfaz çekirdeğinde gösterir. Embriyonun blastomer interfaz çekirdekleri sinyaller parlak ve ayrık olmak ve kullanılan renkler için ayrı bir bant geçiren filtreler kullanılarak attı. Şekil 2 blastomer kromozom 5 ve 9 için normal ya da dengeli bir kromozom normal sinyal tutarlı bir deseni (test edilen tüm lokuslar için 2 kopya) ve anormal bir sinyal deseni ile translokasyon dengesiz bir ürün ile tutarlı bir çekirdek ile çekirdeği gösterir kromozom 5 ve kromozom 9 transloke segment için trizomi (3 nüsha) transloke segment için monozomi (bir nüsha). <img src="/files/ftp_upload/2570/2570fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 A metafaz yayıldı ve kısa kromozom 5 silah ve 5p14.3 ve 9p24.1 kesme noktaları ile 9 arasında bir karşılıklı translokasyon taşıyıcısı kültürlü periferik kan lenfositleri hazırlanan bir interfaz çekirdeğinde: 46, XY, t (5 9) (p14.3; p24.1) ish t (5, 9) (5ptel48-9ptel30 +; 9ptel30, 5ptel48 + 9cen +). FISH probları hem transloke segmentleri için seçilmiştir (5p14.3 → 5pter, kırmızı Cytocell subtelomere5ptel48 TexasRed; 9p24.1 → 9pter, yeşil Cytocell subtelomere 9ptel30 FITC) ve kromozom 9 merkezli segment (9p24.1 → 9qter, mavi Abbott CEP 9 alfa uydu SpectrumAqua). <img src="/files/ftp_upload/2570/2570fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 gün-3 embriyolar interfaz blastomer çekirdekleri. Sinyaller her florokrom ve kompozit bir görüntü oluşturmak için birleşti için farklı bir filtre kullanılarak ele geçirdi. (A), normal ya da dengeli translokasyon kromozomlar için bir tamamlayıcı ile tutarlı her lokus, iki nüsha gösteren her sonda için iki sinyal. (B) Bir kırmızı sinyal, üç yeşil sinyalleri ve 5. kromozomun transloke segmentinde bir kopyasını, komşu ile tutarlı kromozom 9 transloke segmentinde üç nüsha ve iki nüsha kromozom 9, merkezli segmentinde gösteren iki mavi sinyal 9p24.1 → 9pter 5p14.3 → 5pter ve trizomi monozomi dengesiz bir ürün olarak ortaya çıkan translokasyonu -1 segregasyon.

<ol><li>Scriven, P. N., Handyside, A. H., Ogilvie, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+translocations%3A+segregation+modes+and+strategies+for+preimplantation+genetic+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Prenat.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Chromosome translocations: segregation modes and strategies for preimplantation genetic diagnosis.</a> Prenat. Diagn. 18, 1437-1449 (1998).</li>
<li>Harper, J. C. Preimplantation genetic diagnosis for chromosome rearrangements. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMackie+Ogilvie%2C+C+%22Preimplantation+Genetic+Diagnosis%22">Preimplantation Genetic Diagnosis</a>. , 2nd Ed, Cambridge University Press. 194-201 (2009).</li>
<li>Harper, J. C., Coonen, E., Ramaekers, F. C. S., Delhanty, J. D. A., Handyside, A. H., Winston, R. M. L., Hopman, A. H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+sex+of+human+preimplantation+embryos+in+two+hours+using+an+improved+spreading+method+and+fluorescent+in+situ+hybridisation+using+directly+labelled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Identification of the sex of human preimplantation embryos in two hours using an improved spreading method and fluorescent in situ hybridisation using directly labelled probes.</a> Hum. Reprod. 9, 721-724 (1994).</li>
<li>Harper, J. C. Preimplantation genetic diagnosis for sex-linked diseases and sex-selection for non-medical reasons. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMackie+Ogilvie%2C+C+%22Preimplantation+Genetic+Diagnosis%22">Preimplantation Genetic Diagnosis</a>. , 2nd Ed, Cambridge University Press. 230-235 (2009).</li>
<li>Munné, S., Lee, A., Rosenwaks, Z., Grifo, J., Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+major+chromosome+aneuploidies+in+human+preimplantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of major chromosome aneuploidies in human preimplantation embryos.</a> Hum. Reprod. 8, 2185-2192 (1993).</li>
<li>Harper, J. C. Preimplantation genetic diagnosis for infertility (preimplantation genetic screening). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMackie+Ogilvie%2C+C+%22Preimplantation+Genetic+Diagnosis%22">Preimplantation Genetic Diagnosis</a>. , 2nd Ed, Cambridge University Press. 203-229 (2009).</li>
<li>Scriven, P. N., Bossuyt, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+accuracy%3A+theoretical+models+for+preimplantation+genetic+testing+of+a+single+nucleus+using+the+fluorescence+in+situ+hybridization+technique.+Hum+Reprod%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetics%22%5BJournal%5D)">Diagnostic accuracy: theoretical models for preimplantation genetic testing of a single nucleus using the fluorescence in situ hybridization technique. Hum Reprod.</a> Cytogenetics. 5, 394-400 (2010).</li>
<li>Coonen, E., Dumoulin, J. C., Ramaekers, F. C., Hopman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+preparation+of+preimplantation+embryo+interphase+nuclei+for+analysis+by+fluorescence+in-situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Optimal preparation of preimplantation embryo interphase nuclei for analysis by fluorescence in-situ hybridization.</a> Hum. Reprod. 9, 533-537 (1994).</li>
<li>Dozortsev, D. I., McGinnis, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+fixation+technique+for+fluorescence+in+situ+hybridization+for+preimplantation+genetic+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">An improved fixation technique for fluorescence in situ hybridization for preimplantation genetic diagnosis.</a> Fertil. Steril. 76, 186-188 (2001).</li>
<li>Hsu, L. Y., Benn, P. A., Tannenbaum, H. L., Perlis, T., Carlson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+polymorphisms+of+1%2C+9%2C+16%2C+and+Y+in+4+major+ethnic+groups%3A+a+large+prenatal+study%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromosomal polymorphisms of 1, 9, 16, and Y in 4 major ethnic groups: a large prenatal study.</a> Am. J. Med. Genet. 26, 95-101 (1987).</li>
<li>Shim, S. H., Pan, A., Huang, X. L., Tonk, V. S., Varma, S. K., Milunsky, J. M., Wyandt, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISH+variants+with+D15Z1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Genet.+Technol%22%5BJournal%5D)">FISH variants with D15Z1.</a> J. Assoc. Genet. Technol. 29, 146-151 (2003).</li>
<li>Knight, S. J., Flint, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfect+endings%3A+a+review+of+subtelomeric+probes+and+their+use+in+clinical+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Perfect endings: a review of subtelomeric probes and their use in clinical diagnosis.</a> J. Med. Genet. 37, 401-409 (2000).</li>
<li>Thornhill, A. R., de Die-Smulders, C. E., Geraedts, J. P., Harper, J. C., Harton, G. L., Lavery, S. A., Moutou, C., Robinson, M. D., Schmutzler, A. G., Scriven, P. N., Sermon, K. D., Wilton, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESHRE+PGD+Consortium+%28PGS%29+ESHRE+PGD+Consortium+%27Best+practice+guidelines+for+clinical+preimplantation+genetic+diagnosis+%28PGD%29+and+preimplantation+genetic+screening+%28PGS%29%27%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">ESHRE PGD Consortium (PGS) ESHRE PGD Consortium 'Best practice guidelines for clinical preimplantation genetic diagnosis (PGD) and preimplantation genetic screening (PGS)'.</a> Hum. Reprod. 20, 35-48 (2005).</li>
<li>Munné, S., Wells, D., Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technology+requirements+for+preimplantation+genetic+diagnosis+to+improve+assisted+reproduction+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Technology requirements for preimplantation genetic diagnosis to improve assisted reproduction outcomes.</a> Fertil. Steril. 94, 408-430 (2010).</li>
<li>Wilton, L., Williamson, R., McBain, J., Edgar, D., Voullaire, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth+of+a+healthy+infant+after+preimplantation+confirmation+of+euploidy+by+comparative+genomic+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Birth of a healthy infant after preimplantation confirmation of euploidy by comparative genomic hybridization.</a> N. Engl. J. Med. 345, 1537-1541 (2001).</li>
<li>Wells, D., Alfarawati, S., Fragouli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+comprehensive+chromosomal+screening+for+embryo+assessment%3A+microarrays+and+CGH%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Use of comprehensive chromosomal screening for embryo assessment: microarrays and CGH.</a> Mol. Hum. Reprod. 14, 703-710 (2008).</li>
<li>Handyside, A. H., Harton, G. L., Mariani, B., Thornhill, A. R., Affara, N., Shaw, M. A., Griffin, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Karyomapping%2C+a+universal+method+for+genome+wide+analysis+of+genetic+disease+based+on+mapping+crossovers+between+parental+haplotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Karyomapping, a universal method for genome wide analysis of genetic disease based on mapping crossovers between parental haplotypes.</a> J. Med. Genet. 47, 651-658 (2010).</li>
</ol>

Tek bir embriyo hücresi (blastomer) in situ hibridizasyon (FISH) floresan uygulama, pratik ve sinyal paterni yorumlanması hem de özel zorluklar sunulur . Biyopsi hücre slayt, yerelleştirme aşağıdaki BALIK kolaylaştırmak için önceden tanımlanmış bir alan içinde yayılır; hücre sitoplazmasında dağınık olduğunu, parçalanmış olduğunu sağlanmasında çok dikkatli alınması gerekir, ve bu çekirdeğin Tanı bu tek hücre, sıkı puanlama ve yorumlama kurallar uygulanmalıdır sonuçlarına bağlı olarak, görünür ve bozulmamış. Ancak, deneyimli ellerde, BALIK pre-implantasyon genetik tanı (PGD) klinik uygulamada sağlam bir tekniktir. FISH ile PGT prensibi farklı fluorochromes veya hapten etiketli hedef-spesifik DNA probları özel lokusların kopya sayısı tespit etmek için kullanılan olabilir ve böylece Robertsonian kromozom düzenlerinde mayotik segregasyon (1) ile ilişkili kromozom dengesizliği, algılamak için translokasyonlar, karşılıklı translokasyonlar, inversiyon ve karmaşık düzenlenmeleri (2). BALIK da herhangi bir mutasyon-spesifik bir test (3, 4) olduğu, X-bağlantılı hastalığı olan ailelerde kadın embriyolar seçmek için kullanılabilir. Daha tartışmalı BALIK da yardımlı üreme (5, 6) etkinliğini denemek ve geliştirmek için sporadik kromozom anöploidi ekrana kullanılır olmuştur vardır; Ancak, FSIH kullanarak bu testi prediktif değer olarak kabul edilemeyecek kadar düşük olması için muhtemel olan çoğu kişinin elleri ve rutin klinik kullanımı (7) için tavsiye edilmez. Bu makale, klinik, tek hücreli tanı uygulanan FISH teknik yönlerini ve sınırlamalar üzerinde yoğunlaşmaktadır. Tek blastomer yayma ve düzeltme yöntemleri, metanol / asetik asit (5, 8), Tween / HCl (9) ve Tween / HCl ve metanol / asetik asit (10) bir kombinasyonu içerir. Çeşitlemeler fiksasyon sonra ve / veya pepsin ve paraformaldehid tedavisi yayılıyor önce hücre hipotonik tedavi içerir. Bu yöntem uygun laboratuar (14) için kontrol edilmelidir. Tween / HCl yöntemi bu makalede ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Tween / HCl yöntemi farklı laboratuvarlarda teknik olarak basit ve son derece tekrarlanabilir. Bu yöntem, kabul edilebilir bir tanısal doğruluk (7) ile cinsiyet tayini ve kromozom düzenlenmeleri FISH tanı için tek çekirdekleri hazırlamak için kullanılabilir. Probe karışımları, farklı üreticilerin, doğrudan etiketli ve dolaylı olarak etiketlenmiş probları, ve problar birleştirebilirsiniz. Hem üreme ortakları önceden test PGT için özel ve uygun olduğu gösterildiği takdirde kullanılabilir olsa da bilinen polimorfik kromozom bölgeleri için sondalar (11, 12), ya da bilinen diğer kromozom (13) ile anlamlı bir çapraz melezleşme kaçınılmalıdır . Ayrımcı problar için kullanılabilir fluorochromes / hapten ve stratejileri şunlardır: Texas Kırmızı (TR), floresein izotiyosiyanat (FITC) SpectrumGreen (Vysis), SpectrumOrange (Vysis), SpectrumAqua, TR-avidin ile tespit biotinlenmiş probları, FITC avidin, ya da Cy-5 streptavidin (bir FarRed filtre kullanılarak görüntülendi), sarı renkli bir sinyal üretmek için, bir melezleşme ikinci) TexasRed ve SpectrumGold filtre kullanarak SpectrumOrange sıralı yakalama tarafından oluşturulan yuvarlak ve üçüncü bir renk, kırmızı ve yeşil probları bir karışımı. , X ve Y kromozomları ve autosome bir sentromer bölgeler için özel üç probları, içeren bir prob seti, cinsiyet tayini (14) için tavsiye edilir; otozomal prob (2n, 47, trizomi X ayırt ploidi ve böylece kurmak için kullanılır XXX) ve triploidi (3n, 69, XXX) ve tetrazomi X (48, XXXX) ve tetraploidy (4n, 92, XXXX) arasında. Bu prob seti, çok düşük polimorfizm oranı olduğu gösterilmiştir ve bu nedenle tedavi öncesi çalışma üreme ortakları; tipik bir prob seti bu ayarı uygulanan alfa-uydu, X, Y ve 18 içeren Abbott AneuVysion karışımı (14) gerekli değildir. Herhangi bir özel düzenlenmesi için prob karışımı gerekir: İdeal olarak, kromozom dengesizlik ile düzenlenmesi beklenen tüm ürünleri tespit etmek için en azından yeterli probları içerir. Bu mümkün değilse, prob tanınabilir bir gebelik cansız undetected dengesiz ürünler değerlendirilecek ve çok düşük prevalansı (14) kabul edilebilir olması muhtemel olduğu karıştırır. Hem de üreme ortaklarından kültürlü lenfosit metafaz üzerinde test edilecek. En az on metafaz yayılır prob özgüllük, polimorfizmleri ve çapraz hibridizasyon probları olarak yeniden düzenlenmesi farklı kesimleri bekleniyor melezleşme sağlamak için incelenir ve kromozom taşıyıcı için, olmalıdır. Buna ek olarak, bu hazırlıkların en az 100 interfaz çekirdekleri sinyal özgüllük, parlaklık ve Bağımsızlık (14) değerlendirmek için atılır gerekir. Commercial PGS prob setleri mevcuttur (örneğin Abbott MultiVysion PB veya PGT), en sık anlayışının ürünleri anöploidi olarak bulundu kromozom hedefleme ve tek başına bir hedef kromozom prob oluşan. Genellikle çekirdeğin kromozom 13, 15, 16, 18, 21, 22, ve XY (14) için bir test sağlayan ek kromozomlar için ikinci bir hibridizasyon probları ile olabilir. Yayılması ve burada açıklanan FISH tekniği kullanarak bu testin prediktif değeri çoğu kişinin elinde kabul edilemeyecek kadar düşük olması muhtemeldir ve bu, rutin klinik kullanım (7, 15) için tavsiye edilmez. Gibi tek hücrelere uygulanan karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH) gibi teknikler (2001. Wilton ve ark) her kromozom kopya sayısı için test edebilmek ve tek nükleotid polimorfizmleri (SNP) diziler ve kantitatif analiz (Wells ve ark. 2008) ya da &quot;karyomapping&quot; genotipleme (Handyside ve ark 2009) kromozom anöploidi tespit etmek için alternatif teknikler umut vericidir . Ancak, segmenti dengesizlik için çözünürlük sınırı ve doğruluğu belirsiz ve FISH tekniği küçük segmentleri içeren kromozom düzenlerinde tercih olmaya devam edecektir muhtemeldir.

<table><tbody><tr><td>Hidroklorik Asit, 2.5L</td><td>VWR international</td><td>101254H</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür, 5 kg</td><td>VWR international</td><td>443827W</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Klorür, 250g</td><td>VWR international</td><td>26764.232</td><td></td></tr><tr><td>Susuz disodyum hidrojen ortofosfat, 500g</td><td>VWR International</td><td>102494C</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Diyedrojen Ortofosfat, 500g</td><td>VWR international</td><td>10203 4B</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Hidroksit Peletleri, 500g</td><td>VWR international</td><td>28245.265</td><td></td></tr><tr><td>Tween20, 500mL</td><td>VWR international</td><td>663684B</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 2,5L</td><td>VWR international</td><td>8.18760.2500</td><td>Gümrük Vergisi Ödenmiş</td></tr><tr><td>Tri-Sodyum Sitrat, 5Kg</td><td>VWR International</td><td>27833.363</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Sakızı, 250 mL</td><td>Cow Proofings Ltd.</td><td>Artık mevcut değil</td><td>Eski stoklar hala sanat malzemeleri mağazalarında bulunabilir</td></tr><tr><td>DAPI/Antifade ES, 0,125&amp;mu;g/mL, 500ul</td><td>Cytocell Ltd.</td><td>DES500L</td><td>150&amp;#x03BC;flakon kapama&amp;rsquo;her bir Cytocell TEL Probu ile birlikte sağlanır</td></tr><tr><td>Tırnak Cilası, 12 mL</td><td>Botlar</td><td>10088316001</td><td></td></tr><tr><td>Amin Kaplı Lamlar, 25</td><td>Genetix</td><td>K2615</td><td></td></tr><tr><td>DAPI, 0,1 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-9542</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield, 10mL</td><td>Vector Laboratories</td><td>H1000</td><td></td></tr><tr><td>Texas-Red-avidin, 0,001 mL</td><td>Vector Laboratories</td><td>A-2016</td><td></td></tr><tr><td>FITC-avidin, 0,001 mL</td><td>Vector Laboratories</td><td>A-2011</td><td></td></tr><tr><td>Cy-5 Streptavidin, 0,001 mL</td><td>GE Healthcare</td><td>PA45001</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj Tüpleri, 1,75 mL, 500'lü kutu</td><td>Thistle Scientific</td><td>AX-MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj Tüpleri, 0,6 mL, 1000'li kutu</td><td>Thistle Scientific</td><td>AX-MCT-060-C-CS</td><td></td></tr><tr><td>30 ml Üniversal Kaplar, 400'lü paket</td><td>Steril olan</td><td>128B</td><td>NHS Supply Chain'den temin edilebilir, Kat No. KCP053</td></tr><tr><td>Isıtıcı Blok</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>İspirto Ocağı İspirto Ocağı Yuvası İspirto Ocağı Fitili</td><td>VWR international</td><td>451-0107 451-3112 451-3111</td><td></td></tr><tr><td>Tıpalı Cam Pipetler</td><td>Fisher Scientific</td><td>PMK-300-052R</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon Mikroskobu</td><td>Wild Heerbrugg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kağıt mendil, 100 kutu</td><td>NHS TEDARİK ZİNCİRİ</td><td>MJT058</td><td></td></tr><tr><td>Metal Kültür Tepsileri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastik Melamin Tepsiler</td><td>VWR international</td><td>682-009</td><td></td></tr><tr><td>Fırın</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ağız Pipeti Ağızlığı</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>HAE3700</td><td></td></tr><tr><td>Tüpler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Şırınga Filtresi, 0,2 µm&amp;mu;m gözenek boyutu, 25 mm çap</td><td>Fisher Scientific</td><td>FDM-340-010U</td><td></td></tr><tr><td>Elmas Kalem</td><td>VWR international</td><td>818-0021</td><td></td></tr><tr><td>Lamlar için Isıtma Bloğu</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>HBOSBB</td><td></td></tr><tr><td>Hibridizasyon Odası</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Doku Rulosu</td><td>NHS TEDARİK ZİNCİRİ</td><td>MJT004</td><td></td></tr><tr><td>Schieferdecker Kavanozu</td><td>VWR international</td><td>631-9313</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Kavanozu</td><td>VWR international</td><td>631-9331</td><td></td></tr><tr><td>İnce uçlu pens (Forceps, Fine)</td><td>VWR International</td><td>232-2123</td><td></td></tr><tr><td>Küt uçlu penset</td><td>VWR international</td><td>232-2113</td><td></td></tr><tr><td>1000 mL Beher</td><td>VWR international</td><td>213-1642</td><td></td></tr><tr><td>Faz Kontrast Mikroskobu</td><td>Nikon Instruments</td><td>E200</td><td></td></tr><tr><td>Lif içermeyen Blotlama Kartları, 100'lü kutu</td><td>Fisher Scientific</td><td>SDE1</td><td></td></tr><tr><td>Mavi Buzlu Mikroskop Lamı, 100'lü kutu</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>MIC3022</td><td></td></tr><tr><td>Lamel, 18x18mm, No. 1, 200'lü kutu</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>MIC3110</td><td></td></tr><tr><td> Lameller, 22x22mm, No. 0, 200'lü kutu</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>MIC3104</td><td></td></tr><tr><td>Lamel, 22x50mm, No. 0, 100'lü kutu</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>MIC3206</td><td></td></tr><tr><td>1 mL şırınga, 100'lü kutu</td><td>NHS Tedarik Zinciri</td><td>FWC045</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Pipet Ucu, 1000'li 10 rak</td><td>Thistle Scientific</td><td>AX-T-1000-C-L-R</td><td></td></tr><tr><td>İnkübatör</td><td>LEEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benmari</td><td>Hibe Ekipmanları</td><td>W22</td><td></td></tr><tr><td>Alkol Termometresi</td><td></td><td></td><td>Kullanılabilir çeşitli kaynaklar</td></tr><tr><td>pH Metre</td><td>Jenway</td><td>3305</td><td></td></tr><tr><td>pH Elektrodu</td><td>VWR international</td><td>662-1759</td><td>Jenway pH metre 3305'e uygun BNC Konnektör</td></tr><tr><td>Isıtıcılı Karıştırıcı</td><td>Bibby</td><td>HC502</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Pasteur Pipetleri, 500'lü kutu</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>PIP4202</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm, 50mm x 75m</td><td>VWR international</td><td>291-1214</td><td></td></tr></tbody></table>

pre-implantasyon genetik tanı için fish

FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis 

Pre-implantasyon genetik tanı (PGD), doğum öncesi tanı için kurulmuş bir alternatif ve Yardımla üreme teknolojileri (ART) tarafından oluşturulan bir kohort pre-implantasyon embriyoların seçiminde içerir. Bu seçim, çünkü ailevi monogenik hastalığı (örneğin, kistik fibrozis), veya bir ortak bir kromozom taşır, çünkü (örneğin iki yönlü karşılıklı translokasyon) olabilir. PGT kromozom düzenlerinde, tekrarlayan düşükler, kısırlık durumunda önceki etkilenen çocuklar ve / veya çiftler için kullanılabilir. Oosit aşağıdaki over stimülasyonu semen (IVF), in vitro daldırma veya intrasitoplazmik enjeksiyonu (ICSI) bireysel bir spermatozoa tarafından döllenir aspire. Pre-implantasyon bölünme-dönem embriyoların genellikle 3. gün sonrası döllenme tek bir hücrenin kaldırılması suretiyle, biyopsi, biyopsi hücre, embriyonun genetik durum kurmak için test edilir. Floresan in situ hibridizasyon (FISH) sabit hedef spesifik DNA probları ile biyopsi hücrelerinin çekirdekleri X&#39;e bağlı bir hastalık olduğu kromozom düzenlerinde ile ilişkili kromozom dengesizliği tespit etmek ve aile içinde kadın embriyolar seçmek için tercih edilen bir tekniktir mutasyon-özel test. BALIK Yardımla üreme etkinliğini denemek ve geliştirmek amacıyla da spontan kromozom anöploidi (PGS veya PGD-AS olarak bilinen) için ekran embriyolar kullanılır olmuştur, ancak, yayma ve FISH tekniği kullanarak bu testin prediktif değeri burada açıklanan çoğu kişinin elinde kabul edilemeyecek kadar düşük olması muhtemeldir ve bu rutin klinik kullanım için tavsiye edilmez. Biz tek hücreli FISH, blastomer çekirdeklerinin yayılmasını teknikleri, in situ hibridizasyon ve klinik bir ortamda PGT uygulanan sinyal puanlama için uygun probların seçim açıklar.

Bu makale, tek hücreli FISH, blastomer çekirdeklerinin yayılmasını teknikleri, in situ hibridizasyon ve klinik bir ortamda pre-implantasyon genetik tanı (PGD) uygulanan sinyal puanlama için uygun probların seçim açıklamaktadır.

Pre-implantasyon Genetik Tanı için FISH

İmplantasyon öncesi genetik tanı (PGD), prenatal tanıya yerleşik bir alternatif olup, ...dan implantasyon öncesi embriyoların seçilmesini içerir.

Bu prosedürün amacı, genetik anomali riski taşıyan in vitro insan embriyolarının seks kromozomu veya translokasyon durumunu belirlemek için floresan in situ hibridizasyon tekniğini kullanmaktır. Bu işlem, üçüncü gün embriyosundan biyopsi ile alınan tek bir hücrenin lam üzerine lizlenmesi ve çekirdeğin havada kurutulmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, hedef çekirdek DNA'sının denatüre edilmesi ve farklı renklerde florokromlarla işaretlenmiş DNA probları ile hibridize edilmesidir.Ardından, fazla prob stringent bir yıkama ile uzaklaştırılır ve çekirdek DNA'ya özgü floresan bir boya ile boyanır. Son adım, çekirdeğin bir floresan mikroskop kullanılarak incelenmesi ve dijital görüntülerin yakalanmasıdır. Nihayetinde, floresan mikroskopi aracılığıyla hedeflenen kromozom bölgelerinin kopya sayısını gösteren sonuçlar elde edilebilir.Genellikle, bu tekniği ilk kez uygulayan kişiler, yöntem floresan yerinde hibridizasyon tekniğinin sınırlarını zorladığı için zorluk yaşayabilirler. Hücrelerin yayılması için kullanılacak hücre lizis tamponunu 24 saat önceden hazırlayın. Çözeltiyi filtreleyin ve 1 ml'lik alikotları 10 ila 15 adet, 1,7 ml'lik steril mikro santrifüj tüpüne paylaştırın; biyopsi işleminden hemen önce -20 °C'de dondurmadan önce tüpleri kapatın ve etiketleyin.Lizis tamponunu oda sıcaklığında çözdürün. Amin kaplı bir lamın alt kısmına elmas kalem kullanarak çapı yaklaşık beş milimetre olan küçük bir daire çizin ve ardından sert bir 4H kurşun kalemle, lateks eldiven kullanarak lama BLO şeklinde ön etiketleme yapın. Herhangi bir grafit tozunu temizlemek için, her bir blaster aynası için sayısal sıraya göre ayrı bir lam kullanın.Şimdi dairenin içine küçük bir hacimde lizis tamponu ekleyin. Biyopsi blaster'ını lizis tamponuna aktarın. Hücreyi liz etmek için gerektiği kadar lizis tamponu ekleyin.Çekirdeğin daire içerisinde kaldığından ve kaybolmadığından emin olmak için çekirdeği gözlemleyin. Hücrenin çekirdeği yoksa veya birden fazla çekirdeğe sahipse, başka bir hücreden biyopsi yapın. Lamın oda sıcaklığında hava ile kurumasını bekleyin.Öncelikle, örnekleri coplan kavanozlarında fosfat tamponlu salin kullanarak oda sıcaklığında beş dakika boyunca ön yıkamadan geçirin. Ardından steril distile su ile iki kez durulayın, oda sıcaklığında her biri iki dakika sürecek şekilde bir etanol serisi ile dehidre edin ve havada kurutun. Lamların tamamen daldığından emin olun ve yüzeye herhangi bir grafit tozu çıkarsa temiz bir mendil ile emdirin.Faz kontrast mikroskobu ile görüntüleme yaparak çekirdeğin daire içindeki konumunu kaydedin. Ardından numuneleri oda sıcaklığında iki dakika boyunca %100 etanol ileye dehidre edin ve havada kurutun. Şimdi iki µL prob karışımı uygulayın ve dokuz x dokuz milimetrelik bir lamel ile kapatın.Lamelin kenarlarını kauçuk yapıştırıcı ile mühürleyin. Kodlanmış doğallaştırma işlemini gerçekleştirin. Her bir eşleştirme kabı için ısı bloğunda 75 °C'de beş dakika bekletin ve ardından nemlendirilmiş bir oda içerisinde 37 °C'de gece boyunca hibridizasyon yapın.50 mililitre 0,4 kat SSC stringent yıkama çözeltisini 71 derece Celsius'lik bir su banyosunda dengeleyin. Stringent yıkama şişesini ve boş eşleme kavanozunu su banyosuna yerleştirip oda sıcaklığından 71 derece Celsius'ye ısıtın; stringent yıkama çözeltisinin pH değerini ayarlayın ve cochin kavanozlarına boşaltın. Ardından, her bir lamdaki kauçuk çimentoyu dikkatlice çıkarın ve lamelini oda sıcaklığında 4 kat SSC %0,05 tween 20 pH yedi kullanarak durulayın.Numuneleri 71 °C'de beş dakika boyunca 0,4 kat SSC sıkı yıkama ile, ardından oda sıcaklığında iki dakika boyunca 4 kat SSC %0,05 Tween 20 ile yıkayın. İndirekt olarak işaretlenmiş problar için, lamlardaki fazla sıvıyı süzün ve 20 x 20 mm'lik bir paraform karesi altında 20 µL floresan konjuge antikor uygulayın. Nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.Parafilmi çıkarın ve aşağıdaki yıkama işlemlerini oda sıcaklığında iki dakika boyunca gerçekleştirin. Bir kez dört kat SSC %0,05 tween 20 ile ve iki kez iki dakika boyunca PBS ile yıkayın. Lamları süzdükten sonra, 22 x 22 milimetrelik lam üzerine DPI içeren altı µL vector shield montaj medyumu uygulayın.Sıfır numaralı lamelle kapatın ve lamı lamelin üzerine ters çevirin. Fazlalıkları silin ve lamelin kenarlarını şeffaf tırnak cilası ile mühürleyin. Son olarak, örnekleri floresan mikroskopisi ile analiz edin.Her bir çekirdeği iki bağımsız analizci puanlayın. Ayrıca, görsel tanının doğrulanması ve laboratuvar kalite güvencesinin bir parçası olarak görüntü arşivlemesi için görüntüleme yazılımı kullanarak çekirdeğin bir görüntüsünü kaydedin. Burada, periferik kan lenfositlerinden hazırlanan bir metafaz yayılımı ve bir interfaz çekirdeği; kırılma noktaları 5p14.3 ve 9p24.1 olan, beş ve dokuz numaralı kromozomların kısa kolları arasındaki karşılıklı bir translokasyon taşıyıcısını göstermektedir.FISH probları, hem transloke olmuş segmentleri hem de dokuzuncu kromozomun sentrik segment sinyallerini aydınlatır. Üçüncü gündeki interfaz blastomer çekirdekleri yakalanabilir ve ardından kompozit bir görüntü oluşturmak için birleştirilebilir. Her prob için iki sinyal, her lokusun iki kopyasının olduğunu gösterir ki bu durum normal veya dengeli bir tamamlayıcı ile uyumludur.Translokasyon kromozomları için renkli sinyaller; kromozom 5'in transloke segmentinin bir kopyasını, kromozom 9'un transloke segmentinin üç kopyasını ve kromozom 9'un sentrik segmentinin iki kopyasını göstermektedir. Bu veriler, 5p14.3'ten 5pt'ye kadar monosomi ve 9p24.1'den 9pt'ye kadar trisomi ile karakterize dengesiz bir ürün ile uyumludur. Bu videoyu izledikten sonra, insan embriyosundan alınan tek hücre biyopsisinin nasıl analiz edileceği ve floresan in situ hibridizasyon tekniği kullanılarak tek bir çekirdeğin nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Bu durum, bir embriyonun eşey kromozom tamamlayıcılığını veya translokasyon durumunu belirlemek için tekrarlanabilir ve optimum test sonuçları elde etmek açısından önemlidir.

fish-for-pre-implantation-genetic-diagnosis

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Gen fonksiyonu, başka bir gen tarafından tazminat varsa, fonksiyon kaybı-deneylerde gizlenmiş olabilir. Zebrafish modeli canlı embriyolarının gibi fonksiyonel fazlalık ortaya çıkarmak için nispeten yüksek bir verimlilik anlamına gelir sağlar.

Embriyo sırasında Fonksiyonel Artıklık Test Ters Genetik Yaklaşım

Bu protokol Zebrafish ikincil muhabir olarak birincil ve GFP raportör / RFP olarak Gal4-VP16 kullanılarak gen trap girmeyle mutagenez yöntemini anlatır. Yaklaşık bir yüksek ifade F0 balık verim gen trap döl GFP ve RFP co-ifade on. Tarama prosedürü kolayca sokma mutajenez ekranını performans laboratuvar boyutuna uyum ölçekli olabilir.

Zebra balığı Gal4 kullanma Gene Yakalama

Zebra balığı, daha yüksek omurgalılarla genetik benzerlikleri nedeniyle gelişimsel biyoloji ve insan hastalıkları araştırmaları için güçlü bir model sistemdir. Bu protokol, erken embriyogenez için gerekli olan genlerdeki resesif mutasyonları tanımlamak için ileri tarama stratejileri için kullanılabilecek haploid zebra balığı embriyoları oluşturmak için bir metodolojiyi açıklar.

Haploit Zebra balığı Embriyolar üretimi ile<em&gt; In Vitro</em&gt; Gübreleme

Transgenik manipülasyonlar ve genom düzenleme işlevsel genler ve sis -regulatory unsurların rollerini test etmek için kritik öneme sahiptir. Burada (Tol2 aracılı flüoresan raportör transgen yapıları, Talens ve CRISPRs dahil) genomik değişiklik üretimi için ayrıntılı bir mikroenjeksiyon protokolü acil modeli balık, threespine dikenli balıkgil sunulmuştur.

Threespine Sticklebacks içinde Transgenesis ve Genom Kurgu Mikroenjeksiyon

Gen kanal yayın balığı embriyo CRISPR/Cas9 sistemini kullanarak düzenleme için basit ve etkili mikroenjeksiyon protokol sunulmuştur. Bu protokol için RNA'ların rehberlik ve Cas9 protein tek hücreli embriyo sarısı microinjected. Bu protokol iki kanal yayın balığı bağışıklık ile ilgili genlerin knocking tarafından doğrulandı.

CRISPR/Cas9 Protein gen düzenleme için mikroenjeksiyon kanal yayın balığı, Ictalurus yılan, embriyo içine

Hedeflenen genom modeli sistemi Danio rerio (zebra balığı) düzenleme büyük ölçüde CRISPR tabanlı yaklaşımlar ortaya çıkması tarafından kolaylaştırdı. Burada, akıcı, sağlam bir iletişim kuralı üretimi ve heteroduplex hareketlilik tahlil birleştirmek CRISPR elde edilen saçma allelleri tanımlaması ve yeni nesil sıralama kullanarak mutasyonlar tanımlaması için açıklar.

Verimli üretim ve Model sistem Danio rerio kimlik CRISPR/Cas9 tarafından oluşturulan Gene altını gizleme

Zebra balığı güvenilir genetik canlılar arasında gen düzenleme teknolojileri advent ile özellikle Biyomedikal araştırma olarak kullanılmıştır. Larva fenotipleri bekleniyor, DNA ekstraksiyon ve genotip kimlik zor olabilir. Burada, biz bir verimli Genotipleme zebra balığı larva için kuyruk, 72-h sonrası döllenme gibi erken kırpma tarafından açıklayınız.

Yüksek işlem hacmi DNA ekstraksiyon ve 3dpf zebra balığı larva Fin kırpma tarafından Genotipleme

Burada, kısa dönüş süresi, düşük maliyet ve yüksek iş elde etme avantajları ile aneuploidy (PGT-A) için preimplantasyon genetik test için bir yarı iletken sıralama yöntemi sokulmaktadır.

Aneuploidi için Preimplantasyon Genetik Test için Yarı iletken Sıralama

Erken gelişim, maternal kalıtsal ürünlere bağlıdır ve bu ürünlerin çoğunun rolü şu anda bilinmemektedir. Burada, tek bir nesilde anne-etki fenotiplerini tanımlamak için CRISPR-Cas9 kullanan bir protokol tanımladık.

Maternal Crispantlarla Erken Gelişimde Annelik İfade Edilen Genlerin Rolünün Belirlenmesi

Protokol, yarı iletken tabanlı yeni nesil dizileme platformunda anöploidi için implantasyon öncesi genetik testlerde gerekli olan genel laboratuvar içi prosedürleri sunar. Burada tüm genom amplifikasyonunun, DNA fragmanı seçiminin, kütüphane yapımının, şablon hazırlamanın ve dizileme çalışma akışının ayrıntılı adımlarını temsili sonuçlarla sunuyoruz.

Yarı İletken Tabanlı Yeni Nesil Dizileme Platformunda Anöploidi için İmplantasyon Öncesi Genetik Test

CRISPR-Cas teknolojileri, genom düzenleme alanında devrim yarattı. Bununla birlikte, istenen germline düzenlemesini bulmak ve izole etmek büyük bir darboğaz olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, bu protokol, standart PCR, kısıtlama sindirimi ve jel elektroforezi tekniklerini kullanarak germline düzenlemeleri için F0 CRISPR enjekte edilen zebra balığı spermini hızlı bir şekilde taramak için sağlam bir yöntem açıklamaktadır.

Zebra balıklarında germline düzenlemelerinin hızlı izolasyonu için sperm taraması

Öğrenin, pre-implantasyon genetik tanı için FISH tekniğini kullanarak insan embriyolarından tek hücre biyopsilerini analiz etmeyi. Bu yöntem, kromozomal anormallikleri tespit ederek üreme teknolojilerinde embriyo seçimini geliştirir.

Pre-implantasyon Genetik Tanı için FISH

Daha fazla video keşfet