Pre-implantasyon Genetik Tanı için FISH

Bu makale, tek hücreli FISH, blastomer çekirdeklerinin yayılmasını teknikleri, in situ hibridizasyon ve klinik bir ortamda pre-implantasyon genetik tanı (PGD) uygulanan sinyal puanlama için uygun probların seçim açıklamaktadır.

Bu işlemin amacı, genetik anormallik riski taşıyan in vitro insan embriyolarının cinsiyet, kromozom veya translokasyon durumunu belirlemek için floresan in situ iki hibridizasyon tekniğini kullanmaktır. Bu, üçüncü gün embriyosundan bir cam slayt üzerine biyopsi yapılan tek bir hücrenin parçalanması ve çekirdeğin havayla kurutulmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, D doğasını kodlamak ve hedef çekirdek DNA'sını farklı renklerde florokromlarla etiketlenmiş DNA probları ile hibritleştirmektir.

Daha sonra fazla prob sıkı bir yıkama kullanılarak çıkarılır ve çekirdek DNA'ya özgü bir floresan boyası ile boyanır. Son adım, çekirdeği bir floresan mikroskobu kullanarak görüntülemek ve dijital görüntüleri yakalamaktır. Sonuçta, floresan mikroskobu ile hedeflenen kromozom bölgelerinin kopya sayısını gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Genel olarak, bu tekniğe yeni olan kişiler, floresan in situ hibridizasyon tekniğinin en sınırında olduğu için mücadele edeceklerdir. 24 saat önceden, hücrelerin yayılması için hücre lizis tamponunu hazırlayın. Solüsyonu süzün ve bir mililitrelik alikotları 10 ila 15, 1.7 mililitrelik steril mikro santrifüj tüplerine dağıtın, biyopsi işleminden hemen önce eksi 20 santigrat derecede donmadan önce tüpleri kapatın ve etiketleyin.

Lizis tamponunu oda sıcaklığında çözdürün. Bir elmas kalem kullanarak amin kaplı bir slaytın alt tarafında yaklaşık beş milimetre çapında küçük bir daire çizin ve ardından slayt BLO'yu bir lateks eldivenle önceden etiketlenmiş sert bir dört H kalem kullanın. Grafit tozunu temizlemek için, her blaster aynası için sayısal sırayla ayrı bir sürgü kullanın.

Şimdi dairenin içine küçük bir hacimde lizis tamponu yerleştirin. Biyopsi blasterini lizis tamponuna aktarın. Hücreyi parçalamak için gerektiği kadar lizis tamponu ekleyin.

Çember içinde kaldığından ve kaybolmadığından emin olmak için çekirdeği gözlemleyin. Hücrenin çekirdeği yoksa veya birden fazla çekirdeğe sahipse, başka bir hücreye biyopsi yapın. Slaytı oda sıcaklığında kurumaya bırakın.

İlk olarak, numuneleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca fosfat tamponlu salin kullanarak coplan kavanozlarında önceden yıkayın. Daha sonra steril damıtılmış suda iki kez durulayın, her biri oda sıcaklığında iki dakika boyunca bir etanol serisi ile kurutun ve havayla kurutun. Slaytların tamamen daldırıldığından emin olun ve herhangi bir grafit tozu yüzeye çıkarsa, temiz bir mendille ıslatın.

Bir faz kontrast mikroskobu ile görselleştirerek çekirdeğin daire içindeki konumunu kaydedin. Daha sonra numuneleri oda sıcaklığında iki dakika boyunca %100 etanol ile kurutun ve havayla kurutun. Şimdi iki mikrolitre prob karışımı uygulayın ve dokuza dokuz milimetrelik bir kapak kayması ile örtün.

Kapak kaymasının kenarlarını kauçuk çimento ile kapatın. Kodlanmış natürasyonu gerçekleştirin. Beş dakika boyunca 75 santigrat derecede bir ısı bloğuna basın ve ardından her bir bağlantı kavanozu için 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir odada gece boyunca hibridleyin.

71 santigrat derece su banyosunda 50 mililitre 0,4 kez SSC katı yıkama solüsyonunu dengeleyin. Sıkı yıkama şişesini ve boş bağlantı kavanozunu oda sıcaklığında su banyosuna yerleştirin, pH 71 santigrat dereceye kadar ısıtın, sıkı yıkama yapın ve kokin kavanozlarına boşaltın. Kauçuk çimentoyu her slayttan dikkatlice çıkarmaya devam edin ve oda sıcaklığında dört kez SSC %0,05 ile 20 pH yedi kullanarak kapak kızağını durulayın.

Numuneleri 0.4 kez SSC sıkı yıkamada 71 santigrat derecede beş dakika boyunca yıkayın, ardından dört kez SSC 0.05% Tween 20'yi oda sıcaklığında iki dakika boyunca yıkayın. Dolaylı olarak etiketlenmiş problar için, fazla sıvının slaytlarını boşaltın ve 20 x 20 milimetre karelik bir paraform altında 20 mikrolitre floresan konjuge antikor uygulayın. Nemlendirilmiş bir odada 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin.

Para filmi çıkarın ve aşağıdaki yıkamaları oda sıcaklığında iki dakika boyunca gerçekleştirin. Dört kez SSC %0.05 ile 20 arasında ve PBS'de iki dakika boyunca iki kez. Slaytları boşalttıktan sonra, 22 x 22 milimetreye DPI içeren altı mikrolitre vektör kalkanı montaj ortamı uygulayın.

Sıfır numara kapak kayması ve sürgüyü kapağın üzerine ters çevirin. Kapak astarının kenarlarını şeffaf tırnak cilası ile kaydırın, lekeleyin ve kapatın. Son olarak, numuneleri floresan mikroskobu ile analiz edin.

Her çekirdeği iki bağımsız analist tarafından puanlayın. Ayrıca, görsel tanının doğrulanması ve laboratuvar kalite güvencesinin bir parçası olarak görüntü arşivleme için çekirdeğin bir görüntüsünü yakalamak için görüntüleme yazılımı kullanın. Burada, bir metafaz yayılımı ve periferik kan lenfositlerinden hazırlanan bir interfaz çekirdeği, beş ve dokuzuncu kromozomların kısa kolları arasında, beş P 14.3 ve dokuz P iki, 4.1'de kırılma noktaları olan karşılıklı bir translokasyon taşıyıcısını gösterir.

Balık probları, hem trans yerleşimli segmentleri hem de kromozom dokuzuncu sinyallerin merkezi segmentini aydınlatır. Üçüncü günden itibaren sadece çekirdekleri patlatmak için, embriyolar yakalanabilir ve daha sonra kompozit bir görüntü oluşturmak için birleştirilebilir. Her prob için iki sinyal, normal veya dengeli bir tamamlayıcı ile tutarlı olan her lokusun iki kopyasını gösterir.

Translokasyon kromozomları için renkli sinyaller, kromozomun trans yerleşimli segmentinin bir kopyasını, kromozom dokuzunun trans yerleşimli segmentinin üç kopyasını ve CH kromozomu dokuzunun merkez segmentinin iki kopyasını gösterir. Bu veriler, beş P 14.3 ila beş PT için man somi ve dokuz P için trizomi, 4.1 ila dokuz pt için dengesiz bir ürün ile tutarlıdır. Bu videoyu izledikten sonra, bir insan embriyosundan biyopsi alınan tek bir hücrenin nasıl analiz edileceğini ve floresan in situ hibridizasyon tekniğini kullanarak tek bir çekirdeğin nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız.

Bu, bir embriyonun cinsiyet, kromozom tamamlayıcısı veya translokasyon durumunu belirlemek için tekrarlanabilir ve optimum test sonuçları elde etmek için önemlidir.