Clonogenic Testi: yapışkan Hücreler

Merhaba, benim adım Lum ve şu anda Epigenomik Tıp Laboratuvarı başkanı Dr.Tom Carianne'nin gözetiminde BE IDI Kalp ve Diyabet Enstitüsü'nde doktoramı yapıyorum. Bu videoda, Clon Genic Survival Assay olarak bilinen prosedürü göstereceğim. Bu, radyasyona veya kimyasal ajanlara maruz kalma gibi farklı tedavilerin hücresel üreme canlılığı üzerindeki etkisinin değerlendirilmesini sağlayan 50 yıllık bir tekniktir.

Konjenik sağkalım testi, radyasyon biyolojisinde farklı hücre hatlarının radyasyon duyarlılığını değerlendirmek ve farklı radyo koruyucu veya radyo duyarlılaştırıcı bileşiklerin etkinliğini test etmek için merkezi bir tekniktir. A yapışık bir hücre hattı kullanıldığında, kriyojenik sağkalım testi üç aşamadan oluşur. İlk olarak, yapışık bir hücrenin mono tabakasının işlenmesi.

İkincisi, tek bir hücre süspansiyonunun hazırlanması ve bilinen sayıda hücrenin ve boyalı kapların kaplanması ve üçüncüsü, bir inkübasyon döneminden sonra oluşan boyama, sayma ve koloniler. Bu videoda, doğal antioksidanın radyo koruma özelliklerini belirlemek için poligenik İncil testinin nasıl kullanılabileceğini göstermek için ölümsüzleştirilmiş, insan cino bölgesi hücrelerini kullanacağım. 1225 M flas, önceden beş mil besiyerine hücre tohumlanır, böylece deney gününde şişe başına 1 milyon hücre olur.

İlacın 50 mikrolitresi, gerekli konsantrasyonu elde etmek için uygun şekilde etiketlenmiş her bir şişedeki beş mil ortama farklı konsantrasyonlarda eklenir, bu durumda bir araç kontrolünün yanı sıra beş konsantrasyon kullanılır, PBS. İlaç eklendikten sonra hücreler inkübasyon sonrası kullanılan hücre hattına uygun koşullarda bir saat inkübe edilir. Kontrol grubu hariç akı, seçilen dozajda ışınlanır, bu durumda gama ışını yayan bir sezyum kaynağı tarafından üretilen dört gridir.

Işınlamadan sonra, ortamlar döküldü ve her bir şişe beş dakika boyunca iki mil PBS ile yıkandı. PBS'yi döktükten sonra, A yapışkan hücrelerini şişeden ayırmak için her bir şişeye iki mil% 0.05 tripsin eklenir. % 10 fetal sığır serumu içeren alt beş mililitre DMEM daha sonra tripsini devre dışı bırakmak için her şişeye eklenir.

Fasc'ın tüm içeriği daha sonra etiketli 10 mililitrelik şahin tüplerine aktarılır. Tamamlandıktan sonra, bu tüpler beş dakika boyunca santrifüjlenir, daha sonra supinatör damağı bozmadan dikkatlice atılır ve her tüpe beş mil krep ortamı eklenir. Her bir numune için hücre konsantrasyonu ENC olarak hesaplanır ve her bir numunenin nihai hücre konsantrasyonunu elde etmek için gereken hacim, her biri beş mililitre ortam içeren numune başına beş Petri kabına bölünür.

Örneğin, kontrol grubu için, tabak başına 100 hücre kaplanır, bu nedenle 25 mililitrede 500 hücre elde etmek için gereken hacim hesaplanır, daha konsantre numuneler için hesaplanır, 100 mikrolitreden daha az hacimler kullanıldığında ortaya çıkan hatayı en aza indirmek için 10 kez seyreltme veya 100 kez seri seyreltme gerçekleştirin. Şimdi daha önce hesaplanan hacim, her numune için 25 mililitre ortam içeren bir Falcon tüpüne hazırlanır. Numuneler artık daha önce etiketlenmiş bulaşıklara aktarılabilir ve daha kolay kullanım ve taşıma için her bir yemeğe beş mililitre eklenebilir.

Bulaşıkları büyük, steril veya dezenfekte edilmiş bir kapta saklayın. Bulaşıklar daha sonra uygun koşullarda nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirilir ve sekiz gün boyunca inkübe edilir. Sekiz gün sonra keratinositler kullanılıyorsa, bulaşıkları inkübatörden dikkatlice çıkarın ve hepsini birer birer çeker ocak içine koyun.

Oluşan kolonilerin rahatsız edilmemesi için yeri nazikçe tutmaya dikkat edin. Kapakları çıkarın ve yıkamak için her tabağa beş ml% 0.9 salin ekleyin. Hazırlama ucunu tabağın köşesine doğrultun ve herhangi bir koloninin yanlışlıkla kazınmaması için tabağın dibine dokunmaktan kaçının.

Beş dakika sonra, tuzlu suyu dikkatlice aspire edin. Şimdi, koloniler üç mililitre% 4'lük formülle sabitlenir ve buharlaşmayı önlemek için uçların değiştirilmesi gerekir. 15 dakika ila yarım saat sonra, formül aspire edilir ve uygun şekilde atılır.

Koloniler artık %0,1 Kristal menekşe ile lekelenmeye hazırdır, her yemeğe beş mililitre eklenir ve kapaklar yarım saat ila bir saat sonra değiştirilir. Boya daha sonra damıtılmış su ile yıkanır ve bulaşıklar ters çevrilir ve gece boyunca kurumaya bırakılır. Koloniler artık sayılmaya hazırdır.

Koloniler, bir diseksiyon mikroskobu kullanılarak manuel olarak sayılabilir. 50 veya daha fazla hücre içeren herhangi bir hücre kümesi bir koloni olarak kabul edilir. Ve bu, Konjenik hayatta kalma testinin gösterimini sonlandırıyor.

Bu testin diğer tekniklere göre en büyük avantajı, inanılmaz derecede hassas olması ve altı hücre öldürme kaydından sonra bile geniş bir aralıkta sağkalımı tespit edebilmesidir. Bu, bu hassasiyet daha büyük hücre numaralarının kaplanmasıyla elde edilir. Bu makale, sitotoksisiteyi test etmek gibi test gibi başka amaçlar için kolayca kullanılabilir.

İzlediğiniz için teşekkürler.