Rastgele Konik Tilt Yöntemiyle Exosome Kompleksi Tek Parçacık Elektron Mikroskobu İmar

Aşağıdaki deneyin genel amacı, rastgele konik eğim yöntemini kullanarak eksozom kompleksinin üç boyutlu yapısını elde etmektir. Bu, protein kompleksi için destek substratını ve ikinci adım olarak lekeyi yapmak için önce kutsal karbon ızgara üzerine ince bir karbon film tabakası bırakılarak elde edilir. Numune ve leke, numuneyi ağır metal tuzlarına gömen ızgara üzerine uygulanır.

Elektron mikroskobu daha sonra numunenin eğim mikrograf çiftlerini elde etmek için gerçekleştirilir. Son olarak, rastgele konik eğim yöntemi kullanılarak yapılan görüntü analizine dayalı olarak eksozom kompleksinin üç boyutlu yapısını gösteren sonuçlar elde edilmiştir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler mücadele edecektir, çünkü bazen rastgele konik eğim yöntemi için numunenin iyi bir şekilde hazırlanması ve ardından Görünüm'ü takip eden görüntü işleme prosedürü zordur.

Bu yöntemin gösterilmesi çok önemlidir, çünkü kalite ve numune hazırlama adımlarının numune değerlendirmesinin bir örneği olmadan öğrenilmesi zordur. Rastgele konik eğim yönteminin prensibi, elektron mikroskobu içinde bir numunenin aynı bölgesinin bir çift mikrografının alınmasını gerektirir. Numunenin eğik olmayan bir pozisyonda bir resmi çekilir ve diğer resim 50 ila 70 derece arasında bir açıyla eğilmiş numunenin resmi alınır Bilgisayar kullanılarak, sayısallaştırılmış mikrograf çifti yan yana getirilir ve bu çizimde aynı parçacıklardan görüntüler seçilir.

Bu görüntüler üç boyutlu koordinatlarda sayılarla işaretlenir. Eğilmemiş parçacıkların ve bunların eğik ortaklarının görüntüleri, eğim ekseninin yönü ve eğim açısı ile birbiriyle ilişkilendirilir. Eğik olmayan parçacık görüntülerinin hizalanması, azimut boşluğunu dolduran eğik parçacıkların çoklu görüntülerini kullanarak eğik parçacıkların görüntülerini, aMule konumları olarak karşılık gelen konumlarına getirir, molekülün üç boyutlu yapısı, önce ızgaraları imal etmek için bir geri projeksiyon algoritması kullanılarak yeniden yapılandırılabilir, 0.45 gram poli vinil biçimsel reçine ekleyerek% 0.5 formda bir VAR çözeltisi hazırlayın, ve 100 mililitrelik bir cam behere 90 mililitre kloroform.

Çeker ocakta, kabı alüminyum folyo ile örtün ve var reçine formunu çözün. Küçük bir karıştırma çubuğunun sekizi ve manyetik bir karıştırma ile reçinenin çözünmesi yaklaşık 15 dakika sürer. Bu arada, önceden temizlenmiş mikroskopi cam slaytlarını metanol ve Kim mendilleriyle temizleyin.

Form var olduktan sonra reçine tamamen çözülür. Kloroformda, çözeltinin yüzeyine bir mililitre% 50 gliserol ekleyin. Eklenen gliserolün hacminin ayarlanması, kutsal karbondaki deliklerin yoğunluğunu etkiler.

Bir ultrasonik ucun ucunu çözeltiye koyun. Yaklaşık bir inç derinlikte, bir dakika boyunca sonikasyon yapmak için maksimum güç kullanın, bu da çözeltimiz şeklinde bir gliserol damlacıkları emülsiyonu yapacaktır. Daha uzun sonikasyon, kutsal karbonda daha küçük boyutlarda deliklere neden olacaktır.

Bu adımdan sonra çözelti sütlü hale gelir. Sonikasyon daldırmasından hemen sonra, temiz cam emülsiyonun içine dikey olarak kayar. Bir saniye boyunca onları çıkarın ve slaytların yüzeyi üzerinde ince bir plastik film oluşturmak için filtre kağıdı kullanarak slaytların altını kurulayın.

Kloroform buharlaştıktan sonra, ışık mikroskobu altında filmdeki deliklerin yoğunluğunu ve boyutunu kontrol edin. Burada açıklanan hazırlama koşulu, çapları üç ila dört mikrometre arasında olan 400 gözenekli bir ızgaranın her karesinde 10 ila 20 delik üretmelidir. Cam slaytlar kuruduktan sonra, slayt yüzeyindeki plastik filmin kenarını kesin.

Slaytı dikey olarak suya batırarak filmi damıtılmış su yüzeyinde yüzdürün. Su yüzeyindeki ince film, ışık yansımasına karşı bir bakış açısıyla gözlemlenebilir. Filmin üzerine 400 gözenekli bakır ızgarayı, ızgara pürüzsüz yüzeyi aşağı bakacak şekilde birer birer yerleştirin.

Bir parça kağıt kullanarak üzerinde ızgaralar bulunan plastik filmi alın. Kağıdı çevirin ve kurumasını bekleyin. Bir Petri kabında, deliklerde kalan gliserolü çıkarmak için kağıdı metanole batırın ve kağıdın kurumasını bekleyin.

Izgaraları yaklaşık 20 nanometre kalınlığa kadar bir karbon tabakası ile kaplamak için bir karbon buharlaştırıcı kullanın. İstenilen kalınlığı kontrol etmek için buharlaşma süresinin kullanılması. Kalınlık, bilinen bir kalınlıktaki karbon tabakasının gri rengi ile karşılaştırıldığında karbonun gri rengi ile belirlenebilir.

Karbon katmanlı ızgaraları kloroform ile bir cam petri kabında yarım saat bekletin, böylece var form var çıkarılmasını sağlayın, ardından ızgaraların kurutulması ev yapımı kutsal karbon ızgaraları ile sonuçlanır. Daha sonra, yaklaşık beş nanometre kalınlığında ince bir karbon tabakasını yeni bölünmüş bir mika yüzeyine buharlaştırın. Daha sonra kutsal karbon ızgaraları dikkatlice damıtılmış suyun altındaki bir parça filtre kağıdına koyun.

Ev yapımı bir cihazda, ince karbonu mika yüzeyinden su yüzeyine yüzdürün ve yavaşça kutsal karbon ızgaralarının üzerine bırakın. Üzerinde ızgaralar bulunan filtre kağıdını alın ve kurumaya bırakın. Bir davlumbazda, taze bir %2'lik pisuar format çözeltisi yaparak eksozom kompleksinin negatif boyamasına başlayın.

Yazılı prosedürde açıklandığı gibi, çözelti tüpünü bir parça alüminyum folyo ile örtün Işığa maruz kalmayı önlemek için çözelti aynı şekilde kullanılmalıdır. Gündüz kızdırma deşarjı, bir kızdırma deşarj aparatı kullanarak tamamen karbon ızgara üzerinde ince bir karbon. Daha sonra, tezgahın üzerine bir parça temiz parfüm yerleştirin, perfilin üzerine üç adet 50 mikrolitrelik pisuar format leke solüsyonu pipetleyin, eksozom kompleksini yaklaşık 50 nanomolar konsantrasyona seyreltin, seyreltilmiş proteinin dört mikrolitresini pipetleyin, parıltı boşalana kadar ızgara.

Numunenin bir dakika boyunca ızgara üzerinde kalmasına izin verin, ardından kalan çözeltiyi cımbız kullanarak bir parça filtre kağıdı ile kurulayın. Izgarayı hemen ilk leke damlacığının üzerine çevirin ve ızgarayı yaklaşık 10 saniye boyunca birkaç kez ileri geri hareket ettirerek durulayın. Son durulamadan sonra üç leke damlacığının her biri için bu işlemi tekrarlayın, lekenin bir dakika daha ızgarada kalmasına izin verin.

Ardından lekeyi bir parça filtre kağıdı ile kurulayın. Izgara yüzeyinde ince bir tabaka leke solüsyonu tutun ve ızgaranın bir davlumbazda kurumasını bekleyin. Numune ızgarasını numune tutucuya yerleştirin ve ardından tutucuyu bir FEI TE dokuz 12 elektron mikroskobuna koyun.

En iyi lekeli kareleri bulmak için örnek ızgarayı düşük büyütmede kontrol edin. İyi bir kare, yaklaşık bir ila iki mikrometre boyutlarında bir düzine deliğe ve içlerinde koyu lekeli alanlara sahip gibi görünmektedir. FEI kullanıcı arayüzünün düşük doz modunu açın ve düşük doz modunda arama odağını ve pozlama konumunu hizalayın.

1,5 metre kamera uzunluğu ile aramayı kesir moduna ayarlayın. Odağı 150 K büyütmeye ayarlayın ve bir saniyelik ölçülen pozlama süresi ile maruz kalanı 50 K büyütmeye ayarlayın. Normalde, hizalamayı gerçekleştirmek için hem arama hem de pozlama modunda ızgara üzerinde tanınabilir bir özellik kullanılır.

Arama modunda iyi lekelenmeye sahip delikleri bulun ve konumları kaydedin. Meydanın CCD fotoğrafını çekin. Numuneyi 55 derece eğin ve başka bir resim çekin.

İki resmi karşılaştırın ve iki mikrograftaki eşleştirilmiş delikleri belirleyin. Sahneyi sıfır dereceye kadar eğin. Yaklaşık eksi 0,7 mikrometrelik bir odak bozukluğu ile yüksek büyütme oranında arama modunda tanımlanan her deliğin resimlerini çekmek için düşük doz kitini kullanın.

Tüm deliklerin resimleri çekildikten sonra, aynı büyütmeyi kullanarak sahneyi 55 dereceye kadar eğin. Yaklaşık eksi 1.2 mikrometrelik bir odak bozukluğu ile eğilmiş numunenin mikrograflarını alın. Ev yapımı kutsal karbon ızgaraların düzensiz desenini kullanarak düşük büyütmeli mikrograflardaki desenlere dayalı olarak karşılık gelen eğim mikrograf çiftini tanımlayın.

Korelasyona yardımcı olmak için, eşit dağılımlı parçacıklara sahip ve parçacıkların etrafında haleler olmayan mikrograf eğim çiftlerini seçin. Etraflarında belirgin leke haleleri olan mikrograflar, verileri işlemek için atılmalıdır. Prosedürde program kurulumu ile başlayın.

Görüntü işleme, Eman paketinde 2D işlemi kullanılarak gösterilecektir. Görüntü formatını değiştirmek için, 2D hizalamayı yapmak için iMagic beş paketi ve örümcek paketi. 3D rekonstrüksiyon ve iyileştirmeyi gerçekleştirmek için DM üç Gatan dijital görüntüsünü örümcek görüntü formatına dönüştürün.

Process 2D komutunu kullanarak parçacık çiftlerini seçin. Örümcek program paketinde dağıtılan web programını kullanarak, program otomatik olarak parçacıkların koordinatlarını kaydeder ve örümcek komut dosyasını kullanarak seçilen tüm parçacıkları kutulayın. Komut dosyası, eğilmiş ve eğilmemiş parçacık yığınlarını kaydeder.

UN eğimli parçacıkları IMAG beş formatına dönüştürün. EM iki EM programı bant geçişini kullanarak, IMAG beşteki InCorp hazırlık komutunu kullanarak UN eğimli parçacıkları filtreleyin ve maskeleyin ve center komutunu kullanarak bandı geçen maskelenmiş parçacıkları ortalayın. Beşinci resimde, IMAG beş programlarını otomatik olarak yürüten bir toplu komut dosyası kullanarak parçacıkları yinelemeli olarak homojen sınıflara hizalayın ve sınıflandırın.

Daha sonra, parçacıkların bir sınıfın arama tablosunu oluşturmak için IMAG beşteki sınıf komutundaki MSA adlarını kullanın, başlık komutunu kullanarak her parçacık için hizalamanın öteleme ve döndürme değerleri için bir çizim dosyası oluşturun. iMagic five'da, EM two EM programını kullanarak hizalanmış parçacıkları örümcek formatına dönüştürün. Ardından sınıf arama tablosunu örümcek belge dosyalarına dönüştürün.

Her parçacık için hizalamanın öteleme ve dönme değerleri aynı zamanda bir örümcek belge dosyasına dönüştürülür, bant geçiren filtreye dönüştürülür, tıpkı IMAG beşteki eğilmemiş parçacıklar için olduğu gibi eğik parçacıkları maskeler ve merkezler, merkez eğimli parçacıklar için yeni bir veri seti oluşturur. IMAG beşten oluşturulan çoklu referans hizalama belgelerinden ve web programı tarafından oluşturulan DCB dosyalarından açısal belge dosyaları oluşturun. Her sınıf ortalaması için bir başlangıç modeli elde etmek için örümcekte geri projeksiyon komut dosyasını kullanın.

Son olarak, RCT kullanarak son hacmi elde etmek için tüm eğilmemiş parçacıklara karşı örümcek komut dosyasını kullanarak ilk hacmin projeksiyon iyileştirmesini gerçekleştirin. Eksozomun yaklaşık 50 rekonstrüksiyonu elde edilmiştir. Hacimler, 50 eğik olmayan parçacık sınıfındaki her bir parçacığa karşılık gelen eğik parçacıklardan üretilir.

Örümcek paketinde uygulanan geri projeksiyon kullanılarak, projeksiyon eşleştirme iyileştirmesi daha sonra bu hacimleri ilk modeller olarak kullanarak gerçekleştirildi ve eksozomun görüntülenen 3D hacmi yaklaşık 18 ang ekstra çözünürlükte üretildi, daha sonra 3D haritada kompleksin farklı bölümlerinin atomik modellerine eğilebiliriz. Bu videoyu izledikten sonra, iyi bir anlatı ayakta numune ızgarası oluşturmaktan eşler arası mikrograflara kadar üç boyutlu rekonstrüksiyonlar elde etmek için RCT'nin nasıl kullanılacağını ve son olarak görüntü analiz tekniklerini kullanarak rekonstrüksiyonu elde etmeyi iyi anlamış olmalısınız. Burada anlattığımız protokolün yanı sıra, görüntü analizinde son rekonstrüksiyonları elde etmek için birkaç yöntem vardır.

Güvenilir ve doğru bir rekonstrüksiyon elde etmek için en kritik adım, iyi hazırlanmış bir numune ile çalışmaktır.