Name: Rastgele Konik Tilt Yöntemiyle Exosome Kompleksi Tek Parçacık Elektron Mikroskobu İmar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Öğrenin, rastgele konik tilt yöntemiyle Saccharomyces cerevisiae exosome kompleksinin negatif boyama elektron mikroskobu kullanılarak üç boyutlu yapısının nasıl yeniden oluşturulacağını. Bu protokol, biyolojik makromoleküllerin orta çözünürlükte görselleştirilmesine yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar tam protokolleri kurmak için onların yardımına Yale Üniversitesi&#39;nde ilk protokolleri ve Wang laboratuar kurmak yardımcı UC-Berkeley Nogales laboratuar üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca, verdikleri destek için Yale Tıp Okulu&#39;nda cryo-EM tesis ve Yüksek Başarımlı Hesaplama Merkezi değnek kabul etmiş oluyorsunuz. HW Smith Aile Awardee.

<ol><li>van Heel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angular+reconstitution%3A+a+posteriori+assignment+of+projection+directions+for+3D+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Angular reconstitution: a posteriori assignment of projection directions for 3D reconstruction.</a> Ultramicroscopy. 21, 111-123 (1987).</li>
<li>Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+single+particles+from+random+and+nonrandom+tilt+series%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electron+Microsc+Tech%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of single particles from random and nonrandom tilt series.</a> J Electron Microsc Tech. 9, 359-394 (1988).</li>
<li>Penczek, P. A., Grassucci, R. A., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+at+improved+resolution%3A+new+techniques+for+merging+and+orientation+refinement+in+3D+cryo-electron+microscopy+of+biological+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">The ribosome at improved resolution: new techniques for merging and orientation refinement in 3D cryo-electron microscopy of biological particles.</a> Ultramicroscopy. 53, 251-270 (1994).</li>
<li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+staining+and+image+classification+-+powerful+tools+in+modern+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">Negative staining and image classification - powerful tools in modern electron microscopy.</a> Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).</li>
<li>Frank, J., Radermacher, M., Penczek, P., Zhu, J., Li, Y., Ladjadj, M., Leith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+and+WEB%3A+processing+and+visualization+of+images+in+3D+electron+microscopy+and+related+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields.</a> J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).</li>
<li>Shaikh, T. R., Gao, H., Baxter, W. T., Asturias, F. J., Boisset, N., Leith, A., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+image+processing+for+single+particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">SPIDER image processing for single particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nat Protoc. 3, 1941-1974 (2008).</li>
<li>Heel, M. van, Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> J Struct Biol. 116, 17-24 (1996).</li>
<li>Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMAN%3A+semiautomated+software+for+high-resolution+single-particle+reconstructions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions.</a> J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).</li>
<li>Pettersen, E. F., Goddard, T. D., Huang, C. C., Couch, G. S., Greenblatt, D. M., Meng, E. C., Ferrin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comput+Chem%22%5BJournal%5D)">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> J Comput Chem. 25, 1605-1612 (2004).</li>
<li>Wang, H. W., Wang, J., Ding, F., Callahan, K., Bratkowski, M. A., Buttler, J. S., Nogales, E., Ke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+yeast+Rrp44+exosome+complex+suggests+routes+of+RNA+recruitment+for+3%27+end+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Architecture of the yeast Rrp44 exosome complex suggests routes of RNA recruitment for 3' end processing.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 16844-16849 (2007).</li>
<li>Scheres, S. H., Nunez-Ramirez, R., Sorzano, C. O., Carazo, J. M., Marabini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+for+electron+microscopy+single-particle+analysis+using+Xmipp%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Image processing for electron microscopy single-particle analysis using Xmipp.</a> Nat Protoc. 3, 977-990 (2008).</li>
<li>Yoshioka, C., Pulokas, J., Fellmann, D., Potter, C. S., Milligan, R. A., Carragher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation+of+random+conical+tilt+and+orthogonal+tilt+data+collection+using+feature-based+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Automation of random conical tilt and orthogonal tilt data collection using feature-based correlation.</a> J Struct Biol. 159, 335-346 (2007).</li>
</ol>

Bu yazıda, numune hazırlama, ayrıntılı protokol ve negatif boyama elektron mikroskobu kullanarak exosome kompleks üç boyutlu rekonstrüksiyon sunuyoruz. Bu yöntemi kullanarak, yapının herhangi bir ön bilgi olmadan rastgele konik eğim yöntemi kullanarak 3 boyutlu rekonstrüksiyon aldı. Rastgele konik eğim yöntemi mutlaka homojen bir örnek gerektirmez, ancak aşağıdaki projeksiyon eşleşen arıtma adım yüksek çözünürlük elde etmek için homojen bir numune gerekir. Olumsuz vitray örnekleri için, leke...

<table><tbody><tr><td>Polivinil Formal Reçine</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63450-15-7</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl Format</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22451</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Mikroskop Lamları</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>4951F-001</td><td></td></tr><tr><td>400 mesh standart ızgara</td><td>SPI Supplies</td><td>3040C</td><td></td></tr><tr><td>Karbon kaplama cihazı Auto 306</td><td>Edwards Lifesciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnai-12 Elektron Mikroskobu</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glow Discharger</td><td>BAL-TEC</td><td></td><td>Sputter Coater SCD 005</td></tr></tbody></table>

rastgele konik tilt yöntemiyle exosome kompleksi tek parçacık elektron mikroskobu İmar

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Tek parçacık elektron mikroskobu (EM) yeniden yapılanma büyük makromoleküler kompleksleri, üç boyutlu (3D) bir yapı elde etmek için son zamanlarda popüler bir araç haline gelmiştir. X-ışını kristalografisi ile karşılaştırıldığında, bazı benzersiz avantajlar vardır. İlk olarak, tek bir parçacık EM yeniden yapılanma, özellikle büyük makromoleküler kompleksleri için X-ışını kristalografisi darboğaz protein örnek, kristalize değildir. İkincisi, büyük miktarda protein örneklerinin gerek yoktur. Kristalizasyon için gerekli proteinlerin miligram ile karşılaştırıldığında, tek parçacık EM yeniden yapılanma sadece negatif boyama EM yöntemi kullanarak nano-molar konsantrasyonlarda protein çözüm çeşitli mikro-litre ihtiyacı var. Ancak, yüksek simetri birkaç makromoleküler meclisleri olmasına rağmen, tek bir parçacık EM özellikle de simetri olmadan birçok örnekler için (1 nm den daha düşük çözünürlük) nispeten düşük çözünürlükte sınırlıdır. Bu teknik, aynı zamanda çalışmanın altında moleküllerin büyüklüğü ile sınırlıdır, yani genel olarak dondurulmuş sulu numuneler için olumsuz lekeli örnekleri ve 300 kDa 100 kDa. Yapısı bilinmeyen yeni bir örnek için, genelde negatif boyama ile moleküller gömmek için bir heavy metal çözümü kullanın. Daha sonra örnek moleküllerin iki boyutlu (2D) mikrograflar almak için bir transmisyon elektron mikroskopta incelenir. İdeal olarak, protein molekülleri, homojen bir 3D yapıya sahip ancak farklı yönelimleri mikrograflar gösterirler. Bu mikrograflar &quot;tek parçacıklar&quot; olarak sayısallaştırılmış ve bilgisayarlara işlenir. Iki boyutlu bir uyum ve sınıflandırma teknikleri kullanarak, aynı görüşleri homojen moleküllerin sınıfa kümelenmiş. Onların ortalamalar molekülün 2D şekilleri sinyal artırır. Biz doğru bağıl yönelimi (Euler açıları) parçacıklar atadıktan sonra, biz, 2 boyutlu, 3 boyutlu bir sanal hacmin içine parçacık görüntüleri yeniden inşa etmek mümkün olacak. Tek parçacık 3D rekonstrüksiyon, önemli bir adım, tek tek her parçacığın uygun yönlendirmeyi doğru atamak. Açısal sulandırıldıktan 1 ve rastgele konik tenteli (RCT) yöntem 2 de dahil olmak üzere, her parçacık görünümü atamak için çeşitli yöntemler vardır. Bu protokol, maya exosome kompleksi negatif boyama EM ve RCT kullanarak 3 boyutlu rekonstrüksiyon almak bizim uygulama açıklar. Elektron mikroskobu ve görüntü işleme protokol RCT temel prensibi izler ama yöntemi gerçekleştirmek için tek yol olduğunu belirtmek gerekir. Önce, sürekli ince bir karbon film tabakası ile kaplı bir holey karbon ızgarası kullanılarak, uranil-biçimleri protein boyutu ile karşılaştırılabilir bir kalınlığında bir tabaka haline protein örnek gömmek nasıl açıklar. Sonra örnek toplamak için bir transmisyon elektron mikroskobu eklenir untilted (0 derece) ve işleme ve maya exosome bir ilk 3D model elde etmek için daha sonra kullanılabilir olacak mikrograflar eğimli (55 derece) çifti. Bu amaçla, biz RCT gerçekleştirmek ve daha sonra arıtma yöntemini 3 uyan projeksiyon kullanarak ilk 3D model rafine .

Bu makale, negatif boyama elektron mikroskobu (EM) kullanarak biyolojik makromoleküllerin üç boyutlu (3B) rekonstrüksiyonu almak için standart bir yöntem açıklanır. Bu protokolde, rasgele konik eğim rekonstrüksiyon yöntemi (RCT) ile orta çözünürlükte Saccharomyces cerevisiae exosome kompleks 3D yapısı nasıl açıklayabilir.

Rastgele Konik Tilt Yöntemiyle Exosome Kompleksi Tek Parçacık Elektron Mikroskobu İmar

Tek parçacık elektron mikroskopisi (EM) rekonstrüksiyonu, son zamanlarda büyük ... yapıların üç boyutlu (3B) yapısını elde etmek için popüler bir araç haline gelmiştir.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, rastgele konik eğme yöntemini kullanarak ekzozom kompleksinin üç boyutlu yapısını elde etmektir. Bu işlem, öncelikle protein kompleksi için destek substratı oluşturmak amacıyla delikli karbon ızgara üzerine ince bir karbon film tabakası kaplanarak ve ikinci adımda boyama yapılarak gerçekleştirilir. Numune ve boya ızgara üzerine uygulanır, böylece numune ağır metal tuzları içine gömülür.Ardından, numunenin eğim çifti mikrograflarını elde etmek için elektron mikroskobu uygulanır. Son olarak, rastgele konik eğim yöntemi kullanılarak yapılan görüntü analizi ile eksozom kompleksinin üç boyutlu yapısını gösteren sonuçlar elde edilir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, bazen rastgele konik eğim yöntemi için numunenin iyi hazırlanmasının zor olması ve ardından gelen görüntü işleme prosedürü nedeniyle zorluk yaşayacaklardır.Örnek değerlendirmesinin görselleştirilmesi olmadan derecelendirme ve numune hazırlama adımlarını öğrenmek zor olduğundan, bu yöntemin gösterilmesi kritik öneme sahiptir. Rastgele konik eğme yönteminin prensibi, elektron mikroskobu içindeki bir numunenin aynı bölgesinden bir çift mikrograf alınmasını gerektirir. Fotoğraflardan bir

single-particle-electron-microscopy-reconstruction-exosome-complex

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, gömülü eksozomların ince bir kesitini hazırlama tekniği açıklanmaktadır. Bu bölümler, eksozomların yapısal özelliklerini incelemek için transmisyon elektron mikroskobu veya TEM kullanılarak daha fazla boyanabilir ve görüntülenebilir.

Gömülü Eksozomların Kesitlendirilmesi, Boyanması ve TEM Görüntülemesi: TEM Kullanarak Eksozomların Yapısal Özelliklerini Görselleştirmek İçin Bir Protokol

Safra sıvısı, potansiyel olarak önemli biyobelirteçler içeren hücre dışı veziküller/eksozomlar için değerli bir kaynaktır. Bu protokol, miRNA profillemesi de dahil olmak üzere daha ileri analizler için eksozomları insan safrasından izole etmek için sağlam bir yöntemi temsil eder.

İzolasyon ve profil MicroRNA içeren İnsan Bile dan ekzozomlar

Bu makale SPHIRE yazılım paketini kullanarak cryo-EM görüntüleri işlemek için bir protokol sunmaktadır. Mevcut protokol, neredeyse atomik çözünürlüğü hedefleyen hemen hemen tüm tek parçacılı EM projeleri için uygulanabilir.

SPHIRE Kullanılarak Elektron Kriyo-mikroskopi Görüntülerinden Yüksek Çözünürlüklü Tek Parçacık Analizi

Bu iletişim kuralı gerekli transmisyon elektron mikroskobu negatif boyama, ayrıntılı yapısı ve IMMUNO-altın spesifik proteinlerin konumlarda exosomes belirlemek için etiketleme için ultrathin kesit dahil olmak üzere için çeşitli teknikler açıklanır.

Numune hazırlama ve transmisyon elektron mikroskobu tarafından Exosomes görüntüleme

Kriyo-elektron mikroskopisinde tek parçacık analizi, biyolojik toplulukların yapısını yüksek çözünürlükte belirlemek için kullanılan ana tekniklerden biridir. Scipion, mikroskop tarafından elde edilen bilgileri işlemek ve biyolojik numunenin 3D yeniden yapılandırılmasını sağlamak için tüm boru hattını oluşturmak için araçlar sağlar.

Scipion ile Kriyo-EM ve Tek Parçacık Analizi

CryoEM kullanılarak makromoleküler komplekslerin yapı tespiti, belirli protein ve kompleks sınıfları için rutin hale gelmiştir. Burada, bu işlem hattı özetlenmiştir (numune hazırlama, tarama, veri toplama ve işleme) ve okuyucular daha zorlu numuneler durumunda değiştirilebilecek daha ayrıntılı kaynaklara ve değişkenlere yönlendirilir.

Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskopisi: Numuneden Yapıya

Doğrudan stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskopisi (dSTORM), ışık mikroskopisinin tipik kırınım sınırını atlamak ve ekzomları nanometre ölçeğinde görüntülemek için kullanılır. Eksozomları karakterize etmek için hem iki hem de üç boyutta kullanılabilir.

Hücre Dışı Veziküllerin Üç Boyutlu Doğrudan Stokastik Optik Rekonstrüksiyon Mikroskopisi

Bu makalede, yüksek çözünürlüklü yapı belirleme için çeşitli tek parçacıklı veri kümelerine uygulanabilir tek ve sağlam bir iş akışı oluşturmak için üç kriyo-EM işleme platformunun, yani cryoSPARC v3, RELION-3 ve Scipion 3'ün etkili bir şekilde nasıl kullanılacağı açıklanmaktadır.

CryoSPARC, RELION ve Scipion ile Sağlam Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskobu (cryo-EM) İşleme İş Akışı

Septinler sitoiskelet proteinleridir. Lipid membranlarla etkileşime girerler ve mikron ölçeğinde membran eğriliğini algılayabilir ancak aynı zamanda üretebilirler. Bu protokolde membran deformasyonlarını, eğriliğe duyarlı septin bağlanmasını ve septin filament ultrayapısını analiz etmek için aşağıdan yukarıya in vitro metodolojileri tanımladık.

Septinlerin Ultrayapısal Organizasyonunu, Membran Yeniden Şekillendirmesini ve Eğrilik Duyarlılığı Davranışını Analiz Etmek için Aşağıdan Yukarıya In Vitro Yöntemler

Mevcut protokol, kriyo-EM deneylerinde eğimli tek parçacıklı veri toplama için genelleştirilmiş ve uygulanması kolay bir şemayı açıklamaktadır. Böyle bir prosedür, hava-su arayüzüne bağlılık nedeniyle tercihli oryantasyon yanlılığından muzdarip numuneler için yüksek kaliteli bir EM haritası elde etmek için özellikle yararlıdır.

Leginon kullanarak Stage Tilt ile Tek Parçacıklı Cryo-EM Veri Toplama

Öğrenin, rastgele konik tilt yöntemiyle Saccharomyces cerevisiae exosome kompleksinin negatif boyama elektron mikroskobu kullanılarak üç boyutlu yapısının nasıl yeniden oluşturulacağını. Bu protokol, biyolojik makromoleküllerin orta çözünürlükte görselleştirilmesine yardımcı olur.

Rastgele Konik Tilt Yöntemiyle Exosome Kompleksi Tek Parçacık Elektron Mikroskobu İmar

Daha fazla video keşfet