Rastgele Konik Tilt Yöntemiyle Exosome Kompleksi Tek Parçacık Elektron Mikroskobu İmar

Aşağıdaki deneyin genel amacı, rastgele konik eğim (random conical tilt) yöntemini kullanarak eksozom kompleksinin üç boyutlu yapısını elde etmektir. Bu işlem, öncelikle protein kompleksi için destek alt tabakası oluşturmak amacıyla delikli karbon ızgara üzerine ince bir karbon film tabakası kaplanarak ve ikinci adımda boyama yapılarak gerçekleştirilir. Numune ve boya ızgara üzerine uygulanır, bu işlem numunenin ağır metal tuzları ile gömülmesini sağlar.

Ardından, numunenin eğim çifti mikrograflarını elde etmek için elektron mikroskopisi uygulanır. Son olarak, rastgele konik eğim yöntemi kullanılarak yapılan görüntü analizi temelinde, ekzozom kompleksinin üç boyutlu yapısını gösteren sonuçlar elde edilir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, bazen rastgele konik eğim yöntemi için numunenin iyi hazırlanmasının zor olması ve ardından gelen görüntü işleme prosedürleri nedeniyle zorluk yaşayabilirler.

Numune değerlendirmesinin görsel bir anlatımı olmadan derecelendirme ve numune hazırlama adımlarının öğrenilmesi zor olduğundan, bu yöntemin gösterilmesi kritik öneme sahiptir. Rastgele konik eğme yönteminin prensibi, elektron mikroskobu içindeki bir numunenin aynı bölgesinden bir çift mikrograf alınmasını gerektirir. Resimlerden biri numunenin eğilmemiş konumundan, diğeri ise numunenin 50 ile 70 derece arasındaki bir açıyla eğilmiş konumundan alınır. Bilgisayar kullanılarak, dijitalleştirilmiş mikrograf çifti yan yana getirilir ve bu gösterimde aynı parçacıklardan gelen görüntüler seçilir.

Bu görüntüler, üç boyutlu koordinatlarda numaralarla işaretlenmiştir. Eğilmemiş partiküllerin görüntüleri ile bunların eğilmiş partnerlerinin görüntüleri, eğilme ekseninin yönü ve eğilme açısı ile birbirleriyle ilişkilendirilir. Eğilmemiş partikül görüntülerinin hizalanması, azimut boşluğunu dolduran eğilmiş partiküllerin birden fazla görüntüsünü kullanarak, eğilmiş partiküllerin görüntülerini karşılık gelen asMule konumlarına getirir; böylece molekülün üç boyutlu yapısı, bir geri projeksiyon algoritması kullanılarak yeniden kurgulanabilir. Izgaraları hazırlamak için öncelikle, 100 mililitrelik bir cam behere 0,45 gram polivinil formal reçine ve 90 mililitre kloroform ekleyerek %0,5'lik bir form VAR çözeltisi hazırlayın.

Bir çeker ocak içerisinde, beheri alüminyum folyo ile kapatın ve formvar reçinesini çözün. Küçük bir manyetik karıştırma çubuğu ve manyetik karıştırıcı ile reçinenin çözünmesi yaklaşık 15 dakika sürer. Bu sırada, önceden temizlenmiş mikroskopi cam lamlarını metanol ve Kim wipes ile temizleyin.

Formvar reçine kloroform içinde tamamen çözündükten sonra, çözeltinin yüzeyine bir mililitre %50 gliserol ekleyin. Eklenen gliserol hacminin ayarlanması, gözenekli karbonun delik yoğunluğunu etkiler.

Ultrasonik probun ucunu solüsyonun içine daldırın. Yaklaşık bir inç derinlikte, solüsyonumuz formunda gliserol damlacıklarıyla bir emülsiyon oluşturmak için maksimum güçle bir dakika boyunca sonikasyon uygulayın. Daha uzun süreli sonikasyon, delikli karbon üzerindeki gözeneklerin boyutunun küçülmesine neden olacaktır.

Bu adımdan sonra çözelti sütümsü bir görünüm alır. Sonikasyon işleminden hemen sonra, temiz cam lamlar dikey olarak emülsiyona daldırılır. Lamlar bir saniye boyunca bekletildikten sonra çıkarılır ve yüzeyde ince bir plastik film tabakası oluşturmak için lamların alt kısmı filtre kağıdıyla kurulanır.

Kloroform uçtuktan sonra, filmdeki deliklerin yoğunluğunu ve boyutunu bir ışık mikroskobu altında kontrol edin. Burada açıklanan hazırlama koşulu, 400 mesh'lik bir ızgaranın her karesinde, çapları üç ile dört mikrometre arasında olan 10 ila 20 delik oluşturmalıdır. Cam lamlar kuruduğunda, lam yüzeyindeki plastik filmin kenarını kesin.

Slaytı suya dikey olarak daldırarak filmile distile su yüzeyine çıkarın. Su yüzeyindeki ince film, ışık yansımasına karşı dar bir açıyla gözlemlenebilir. 400 mesh bakır ızgaraları, pürüzsüz yüzeyleri aşağı bakacak şekilde, birer birer filmin üzerine yerleştirin.

Üzerinde ızgaralar bulunan plastik filmi bir parça kağıt kullanarak kaldırın. Kağıdı ters çevirin ve kurumasını bekleyin. Deliklerdeki kalıntı gliserolü gidermek için kağıdı bir Petri kabı içerisinde metanolde bekletin ve ardından kağıdın havada kurumasını sağlayın.

Izgaraları yaklaşık 20 nanometre kalınlığında bir karbon tabakasıyla kaplamak için bir karbon evaporatörü kullanın. İstenen kalınlığı kontrol etmek için evaporasyon süresini kullanın. Kalınlık, karbonun gri renginin, kalınlığı bilinen bir karbon tabakasının gri rengiyle karşılaştırılmasıyla belirlenebilir.

Formvar'ı uzaklaştırmak için karbon katmanlı gridleri bir cam petri kabında yarım saat boyunca kloroformda bekletin; ardından gridlerin kurutulması sonucunda ev yapımı delikli karbon gridler elde edilir. Sonraki adımda, taze olarak cleavage edilmiş bir mika yüzeyine yaklaşık 5 nm kalınlığında ince bir karbon katmanı buharlaştırın. Ardından, delikli karbon gridleri dikkatlice distile su altındaki bir filtre kağıdı parçasına yerleştirin.

Ev yapımı bir düzenekte, ince karbonu mika yüzeyinden su yüzeyine yüzdürün ve yavaşça delikli karbon ızgaraların üzerine çöktürün. Üzerinde ızgaralar bulunan filtre kağıdını alın ve kurumasını bekleyin. Bir çeker ocakta, taze %2 uranil format çözeltisi hazırlayarak ekzozom kompleksinin negatif boyama işlemine başlayın.

Yazılı prosedürde açıklandığı üzere, ışığa maruz kalmayı önlemek için çözelti tüpünü bir parça alüminyum folyo ile kapatın; çözelti aynı gün içerisinde kullanılmalıdır. Bir akkor boşalma cihazı kullanarak, karbon ızgaranın tamamı üzerinde ince bir karbon tabakası oluşturmak için akkor boşalma işlemi gerçekleştirin. Ardından, tezgaha temiz bir parafilm parçası yerleştirin ve parafilmin üzerine 50 µL'lik üç damla uracil format boyama çözeltisi damlatın; ekzosom kompleksini dilüsyon tamponu kullanarak yaklaşık 50 nM konsantrasyona seyreltin. Seyreltilmiş proteinden 4 µL'yi akkor boşalma işlemine tabi tutulmuş ızgaranın üzerine pipetleyin.

Numuneyi bir dakika boyunca ızgara üzerinde bekletin, ardından cımbız yardımıyla bir filtre kağıdı parçası kullanarak kalıntı solüsyonu emdirin. Izgarayı hemen ilk boya damlasının üzerine ters çevirin ve ızgarayı yaklaşık 10 saniye boyunca birkaç kez ileri geri hareket ettirerek durulayın. Bu işlemi üç boya damlasının her biri için tekrarlayın ve son durulamadan sonra boyanın ızgara üzerinde bir dakika daha kalmasını sağlayın.

Ardından, boyayı bir parça filtre kağıdıyla tamponlayarak temizleyin. Izgara yüzeyinde ince bir boya çözeltisi tabakası bırakın ve ızgaranın bir çeker ocak içinde kurumasını bekleyin. Numune ızgarasını numune tutucuya yerleştirin ve ardından tutucuyu bir FEI TE nine 12 elektron mikroskobuna yerleştirin.

En iyi boyanmış kareleri bulmak için numune ızgarasını düşük büyütmede kontrol edin. İyi bir kare, boyutları yaklaşık bir ila iki mikrometre olan on küsur deliğe ve bunların içinde koyu boyanmış alanlara sahip görünmelidir. FEI kullanıcı arayüzünün düşük doz modunu açın; arama odağını ve pozlama konumunu düşük doz modunda hizalayın.

Aramayı 1,5 metre kamera uzunluğunda fraksiyon moduna ayarlayın. Odağı 150 K büyütmeye ve pozlamayı bir saniyelik ölçülen pozlama süresiyle 50 K büyütmeye ayarlayın. Normalde, hem arama hem de pozlama modunda ızgara üzerinde bulunan tanınabilir bir özellik hizalamayı gerçekleştirmek için kullanılır.

Arama modunda iyi boyanmış delikleri bulun ve konumları kaydedin. Karenin bir CCD fotoğrafını çekin. Numuneyi 55 dereceye eğin ve başka bir fotoğraf daha çekin.

İki resmi karşılaştırın ve iki mikrograftaki eşleşen delikleri belirleyin. Tablayı tekrar sıfır dereceye getirin. Arama modunda belirlenen her bir deliğin, yaklaşık eksi 0.7 µm defocus ile yüksek büyütmede fotoğraflarını çekmek için düşük doz kitini kullanın.

Tüm deliklerin fotoğrafları çekildikten sonra, aynı büyütmeyi kullanarak sahneyi 55 dereceye eğin. Eğilmiş numunenin yaklaşık eksi 1.2 micrometers defocus ile mikrograflarını çekin. Ev yapımı delikli karbon ızgaraların düzensiz desenlerini kullanarak, düşük büyütmeli mikrograflardaki desenlere dayanarak karşılık gelen eğim mikrograf çiftini belirleyin.

Korelasyona yardımcı olmak için, partiküllerin eşit dağıldığı ve partiküllerin etrafında halelerin bulunmadığı mikrograf eğim çiftlerini seçin. Verileri işlemek için, etraflarında belirgin boyama haleleri olan mikrograflar elenmelidir. Prosedürdeki program kurulumu ile başlayın.

Görüntü işleme, Eman paketindeki process 2D kullanılarak gösterilecektir. Görüntü formatını değiştirmek için iMagic five paketi kullanılarak 2D hizalama ve ardından spider paketi uygulanır. 3D rekonstrüksiyon ve rafinasyon işlemlerini gerçekleştirmek için, DM three Gatan dijital görüntüsünü spider görüntü formatına dönüştürün.

Process 2D komutunu kullanarak partikül çiftlerini seçin. Spider program paketiyle birlikte dağıtılan web programı, spider betiğini kullanarak seçilen tüm partikülleri kutucuğa çıkarır ve partiküllerin koordinatlarını otomatik olarak kaydeder. Betik, eğimli ve eğimli olmayan partikül yığınlarını kaydeder.

UN eğik parçacıkları IMAG five formatına dönüştürün. EM two EM programı band geçiren filtresini kullanarak, IMAG five'daki InCorp prep komutu ile UN eğik parçacıkları filtreleyin ve maskeleyin; ardından band geçiren filtreyle maskelenmiş parçacıkları center komutu ile merkezleyin. IMAG five'da, IMAG five programlarını otomatik olarak çalıştıran bir toplu işlem betiği (batch script) kullanarak parçacıkları yinelemeli olarak homojen sınıflara ayırın ve sınıflandırın.

Ardından, parçacıkların sınıf arama tablosunu oluşturmak için IMAG five'taki MSA isimleri sınıf komutunu kullanın ve header komutuyla her bir parçacığın hizalaması için translasyon ve rotasyon değerlerine ait bir grafik dosyası oluşturun. iMagic five'ta, EM iki EM programını kullanarak hizalanmış parçacıkları spider formatına dönüştürün. Daha sonra, sınıflar arama tablosunu spider belge dosyalarına dönüştürün.

Her bir partikül için hizalama çeviri ve rotasyon değerleri de bir spider belge dosyasına dönüştürülür; IMAG five'daki eğilmemiş partiküllerde olduğu gibi, eğilmiş partiküllere de bant geçiren filtre uygulayın, maskeleyin ve merkezleyin, ardından merkezlenmiş eğilmiş partiküller için yeni bir veri seti oluşturun. IMAG five'dan üretilen çoklu referans hizalama belgelerinden ve web programı tarafından üretilen DCB dosyalarından açısal belge dosyaları oluşturun. Her bir sınıf ortalaması için bir başlangıç model elde etmek amacıyla spider'daki geri projeksiyon script'ini kullanın.

Son olarak, RCT kullanarak nihai hacmi elde etmek için spider betiği ile eğilmemiş tüm partiküllere karşı başlangıç hacminin projeksiyon iyileştirmesini gerçekleştirin. Eksozomun yaklaşık 50 yeniden yapılandırması elde edilmiştir. Hacimler, eğilmemiş partiküllerin 50 sınıfındaki her bir partiküle karşılık gelen eğilmiş partiküllerden oluşturulur.

Spider paketinde uygulanan geri projeksiyon kullanılarak, bu hacimler başlangıç modelleri olarak kullanılmış ve projeksiyon eşleştirme iyileştirmesi gerçekleştirilmiştir; ardından ekzosomun yaklaşık 18 Å çözünürlüğündeki görüntülenen 3D hacmi oluşturulmuş ve böylece kompleksin farklı bölümlerine ait atomik modeller 3D haritaya yerleştirilebilmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, numunenin uygun bir kontrastla ızgaralanmasından mikroğrafların alınmasına ve nihayetinde görüntü analiz teknikleri kullanılarak rekonstrüksiyonun elde edilmesine kadar, üç boyutlu rekonstrüksiyonlar elde etmek için RCT'nin nasıl kullanılacağı konusunda kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız. Burada tanımladığımız protokolün yanı sıra, görüntü analizinde nihai rekonstrüksiyonları elde etmek için çeşitli yöntemler mevcuttur.

Güvenilir ve doğru bir rekonstrüksiyon elde etmek için en kritik adım, iyi hazırlanmış bir numune ile çalışmaktır.