Name: Odaklı İyon Işın Freze ve Beyin Dokusu Taramalı Elektron Mikroskobu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Öğrenin, odaklı iyon ışın taramalı elektron mikroskobu kullanarak reçine gömülü beyin dokusunun üç boyutlu görüntülenmesini. Bu yöntem, yüksek çözünürlüklü seri görüntüleme ve detaylı yapısal analiz sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Örnek fiksasyon ve reçine gömme <ol><li> , Taze doku ve hücreler örnekleri% 2 paraformaldehid en az 2 saat süreyle sabit ve% 2.5, 7.4 pH 0,1 M fosfat tamponu glutaraldehid. Örneklem büyüklüğü yeterli penetrasyon veya sabitleştirici izin 0.150 mm kalınlığında geçmemesi gerektiğini ve düzeltmenin 12 saatten daha uzun süre bırakılmamalıdır. </li><li> Örnekleri, 20ml cam sintilasyon şişeleri yerleştirin ve onları 0.1M cacodylate tampon üç kez, her biri 5 dakika yıkayın. </li><li> % 1.5 (w / v) 30 dakika için 0.1 M cacodylate tamponu (0.1 M, pH 7.4), potasyum ferrosiyanat ve% 1 (w / v) osmiyum tetroksit Leke. </li><li> 30 dakika boyunca% 1.0 (w / v) 0.1M cacodylate tampon osmiyum tetroksit Leke. </li><li> 3 dakika boyunca bir kez çift distile su ile durulayın. </li><li> % 1 (w / v) 30 dakika çift distile su uranil asetat ile Leke. </li><li> Çift distile su ile 5 dakika için bölümler durulayın ve kademeli alkol serisi her değişikliği (1 x% 50, 1 x% 70, 1 x% 90, 1 x% 95, 2 x% 100), 2 dakika sonra kurutmak. </li><li> % 70,% 90,% 95 ve% 100:% 50 etanol içinde Durcupan başlayan etanol ile karışık Durcupan reçine her değişiklik, 30 dakika, artan konsantrasyonlarda göm, daha sonra takip. </li><li> Taze Durcupan ile değiştirin ve 4 saat boyunca yavaş yavaş tahrik. </li><li> Yeri bölümleri, kalıp ayırma maddesi ile kaplı ve 65 yer, cam mikroskoplar, ahşap, kokteyl çubukları slaytlar kullanarak 24 saat boyunca ° C fırın. </li></ol> 2. FIB / SEM için numune hazırlama <ol start="11"><li> Örnekleri içeren, iki cam mikroskop slaytlar arasında, reçine katmanı ayrı ve ayırıcı herhangi bir kalıp çıkarmak için iyice yıkayın. </li><li> Düşük güç hedefleri ile bulaşan bir ışık mikroskobu kullanılarak, ya da reçine dilim içinde ilgi bölgeyi tanımlamak için, iletilen aydınlatma ile mikroskop diseksiyon. </li><li> Jilet kullanarak ilgi bölge etrafında kare (3 mm x 3 mm) Kesme ve akrilik tutkal ile boş reçine blok (Şekil 1) üst sopa. Sertleşmesine tutkal için 5 dakika bekleyin ve sonra bir sonraki adıma devam. </li><li> Ulramicrotome sahibi blok Kelepçe ve ekli stereomikroskopta kullanarak, bir jilet ile ilgi bölgenin çevresinde maddi kalıntıların sadece küçük bir piramit kadar kırpın. </li><li> Ayrıca, ilgi bölgede tam saygı ile blok yüzeyinin (Şekil 1) boyutları bulunan, böylece ultramicrotome içine sabit bir cam bıçak kullanarak, blok kırpın. Bir kenarı blok kesme, dik bir adım örnek üzerinden kesilir (Şekil 1 ve 2), böylece ilgi bölgeye yakın. Bu adım, görüntüleme yüz (Şekil 2) oluşturur. </li><li> Iletilen bir ışık mikroskobu kullanılarak, ultramicrotome ve fotoğraf blok içinde ilgi bölge blok çıkarın. </li><li> Uzak kalan reçine saplama kesilmiş blok kesin. Bu bir kuyumcuya testere kullanılarak yapılan ve sadece küçük bir blok FIB / SEM içine yerleştirilmiş olmasını sağlar. Bu blokta toplam yüksekliği 5 mm'den fazla olmamalıdır. </li><li> Tutkal Görüntülenecek tarafındaki en dış kenarına (Şekil 1) olmasını sağlamak karbon macun ile bir alüminyum saplama blok. </li><li> Tutkal kuruduktan sonra, blok (&gt; 20 nm; Cressington vakum evaporasyon sistemi) altın ince bir tabaka ile kaplayın. </li></ol> 3. FIB / SEM görüntüleme <ol start="20"><li> Düşük bir büyütme, ilgi ve blok tarafında seçtiğiniz bölge görüntülü böylece ikincil elektron görüntüleme (5 kV, 0.5 nAmp), şark blok kullanarak (Şekil 2 c, d) operatör karşı karşıya. </li><li> Orient yüze görüntülü böylece blok freze ışınına paralel yatıyor. Bu, elektron ışını, bu yüz ila 54 ° (Şekil 2 b) yönelik anlamına gelecektir. </li><li> 13 iyon demeti akımı kullanma - 30 kV 27 nAmps Görüntülenecek bölgenin ön reçine dar bir bant çıkarın. </li><li> Ilgi bölge üzerine, öğütülmüş yüz görüntülemek için saçılmış görüntüleme moduna geçin. </li><li> (Şekil 2) öğütülür ve yansıması blok tam bir bölge bulmak ışık mikroskobu referans görüntü (adım 16 yaşında çekilmiş) ve öğütülmüş yüz görüntü kullanma. </li><li> Mevduat faiz bölge (Şekil 2) Yukarıdaki blok yüzeyine, mikroskop gaz enjeksiyon sistemi kullanarak karbon (veya metal) bir koruyucu tabaka (yaklaşık 1 mikron kalınlığında). </li><li> 700 picoAmps, ince değirmen son görüntüler alınacaktır blok içinde bölgede bir akım kullanılması. </li><li> Freze ışın tamamen değirmen bu görüntü yüzü hiç freze eserler karşısında görülebilir kadar bırakın. Yüz tam bir değirmen tüm görüş alanı genelinde sonraki her görüntü değişiklikleri gözlemleyerek kontrol edilir. Yetersiz freze vertica görünen beyaz çizgiler veya 'perde' olarak görülmektedir.lly görüntü. </li><li> Mikroskop dağıtmak için herhangi bir termal değişiklikler için en az 2 saat bekletin. Bu blok yüz hizalanmamıs görüntüler sonuçlanan görüntüleme sırasında sürüklenme riskini azaltır. </li><li> Yüz seri görüntüleme için mikroskop parametreleri seçin. Elektron ışını blok karşısında malzemenin bir çok sığ bir derinliğe sadece görüntü için yeterince düşük bir gerilim olduğundan emin olun. Bu aynı zamanda kaldırılacak yüz kalınlığı daha çok sığ olmalıdır. Görüntüleme için tipik parametreler 1.2 arasında gerilimleri - 2,0 kV arasındaki piksel boyutları ile 4 - 20 nm. Piksel değirmen yüzü ve tek bir görüntü elde toplam süre (Şekil 3) 2 dakika altında tutulur, böylece yaklaşık 10 μsecs tutulmalıdır zamana ihtiyacı yaşamak. </li></ol> 4. Başarının sırları Adım 1) numuneleri 150 mikrondan daha kalın olmadığından emin olun. Bu malzemenin içine farklı lekeleri ve reçine yeterli penetrasyon sağlayacaktır. Bu fiksasyonun hemen sonra bir vibratome örnekleri kesit elde edilebilir. Bu kalınlığı, beyin dokusu için uygun . Diğer dokulara yeterli fiksasyon ve boyama sağlamak için test edilmesi gerekir. Adım 3) Numuneler çözüm boyunca özgürce dağıtılan ve bu ikincil fiksatif tanıtıldı flakon bir parçası birlikte clumped olmalıdır. Bu örnek maksimum penetrasyon sağlamak ve bu tespit işlemi sırasında bozuk olma örnek azaltacaktır. Bu örnekleri çözüm eklenir hemen sonra flakon içinde yavaşça dönen elde edilir. Adım 15) ilgi bölgesi (&lt;30 mikron) altında hemen blok yüzeyinde yer olduğundan emin olun. Bu görüntü toplama aşamasında, iyon ışını tarafından freze miktarını azaltır . Adım 22) iyon demeti tarama süresi, tüm görüntüleme yüzü tamamen öğütülmüş olduğundan emin olmak için adequte olması gerekiyor . Yetersiz freze görüntüleme yüz aşağı dikey olarak görünen beyaz çizgiler ya da 'perde' olarak gösterilir . Adım 26) son öğütülmüş yüze görüntülü bir yüz daha büyük olmalıdır. Bu öğütülmüş reçine, blok ve blok yüzeyine yakın çevresinde redeposits atılır çünkü . Bu redeposition görüntüleme sahaya tecavüz ve görüntülü olan daha bir çok geniş bir alana öğütülmesi ile önlenmiş olur. 20 mikron genişliğinde bir görüntü penceresi için, öğütülmüş blok yüz 30 mikron genişliğinde daha büyüktür. Adım 29), elektron ışını parametreleri görüntü blok yüzeyinin yalnızca ilk birkaç nanometre çıkan elektronlar tarafından oluşturulan bu tür kritik . Bu acheved 2'nin altında kV gerilim en aza indirmek ve hiçbir elektron çok uzak nüfuz sağlamak. Bu aynı zamanda en yüksek enerjiler ile sadece elektron nihai görüntü katkıda bulunmak, böylece dedektör üzerinde bir ızgara gerilimi kullanarak katkıda bulunuyor. Tipik olarak, bir ızgara gerilimi 1,3 kV, 1,5 kV bir görüntüleme gerilim için kullanılır . 5. Temsilcisi Sonuçlar: <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 reçine blok hazırlanması a) Reçine bir steromicroscope görüntülenen bir yetişkin sıçan beyin ile koronal bölümünde (80 mikron kalınlığında) gömülü. Görüntü net bir neşter bıçak kullanarak bölümünde (b) kesilebilir farklı beyin bölgeleri gösterir. Burada, korteks 1 mm kare kaldırılır ve (c), d) Daha sonra reçine blok, bir ultramicrotome monte edilmiş bir cam bıçakla kesilmiş ve bir kez blok sadece terk etmek düşürüldü boş bir reçine blok yapışmış ilgi bölgesi (e), bir adım f) gömülü malzemenin ön yüzeyine dik kesilmiş kesilmiş Bu tüm bölge daha sonra reçine geri kalanından kesilir ve bir alüminyum metal kaplama için hazır saplama ve görüntüleme üzerine monte taramalı elektron mikroskobu. <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2). FIB / SEM görüntüleme blok yüz hazırlanması ve b) blok ve görüntüleme yüz (siyah çift başlı bir ok ile gösterilen) oluşturmak için öğütülmüş kenarına resimler göstermek. Iyon demeti (beyaz) konumunu görüntüleme yüze paralel olarak gösterilir ve elektron ışını (gri), 54 ° iyon demeti yüz isabet gösterilir. C), elektron ışını ile çekilen blok bir görünümdür. ve ikincil elektronlar ile görüntülenmiş. Bu yan blok boyunca koyu kabaca öğütülmüş yüz bölgesi (noktalı beyaz bir kutu ile gösterilir) bir kısmını gösterir (çift kafalı gösterilened siyah ok) altta yatan bir örnek ortaya çıkarmak için d) bu bölgede sadece saçılmış elektron kullanarak görüntülü gömülü doku görülebilmektedir . Burada gömülü doku bölümün tam genişliğinde çift başlı bir beyaz ok ile gösterilir. C scale bar), 100 mikron . <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 görüntülenmesi izotropik vokseller ile beyin dokusunun hacmi. A) sıçan beyin bir bölge içinde ultrastrüktür gösteren blok yüz kontrast saçılmış görüntü Ters. Tüm membranlar görünür yanı sıra büyük makromoleküler yapıları vardır. B) 1600 görüntülerin toplam 5 nm aralığı izotropik vokseller c) Bu yığın aynı çözünürlüğe sahip herhangi bir düzlemde yansıması ile sonuçlanan bir görüntü yığını toplanmıştır . Bu görüntü, xy düzlemi ve yz düzleminde görüntülü tek sinaptik bağlantı gösterir.

<ol><li>Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+section+scanning+electron+microscopy+of+adult+brain+tissue+using+focused+ion+beam+milling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling.</a> J Neurosci. 28, 2959-2964 (2008).</li>
<li>Hekking, L. H., Lebbink, M. N., De Winter, D. A., Schneijdenberg, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ion+beam-scanning+electron+microscope%3A+exploring+large+volumes+of+atherosclerotic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Focused ion beam-scanning electron microscope: exploring large volumes of atherosclerotic tissue.</a> J Microsc. 235, 336-347 (2009).</li>
<li>Armer, H. E., Mariggi, G., Png, K. M., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+transient+blood+vessel+fusion+events+in+zebrafish+by+correlative+volume+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Imaging transient blood vessel fusion events in zebrafish by correlative volume electron microscopy.</a> PLoS One. 4, e7716-e7716 (2009).</li>
</ol>

Ilgi bölgede çok büyük değilken FIB / SEM tekniği en iyi şekilde çalışır. Görüntülü bir hacim için üst limit iyon ışını ve alana bağlı olduğunu, uzun çalışma saatleri boyunca tekrar tekrar sürekli değirmen. Şimdiye kadar bu alanlarda yaklaşık 60 x 60 mikron yapıldı, ancak, görüntüleme tüm bu alanda, uygun bir görüntü çözünürlüğü ile böyle büyük bir görüntü toplama zaman faktörü nedeniyle mümkün değildir. Bir örnek olarak, bir pikselin ile 4 kx k 4 görüntü 10 mikrosaniye zaman 2 dakika ve 40 saniye kazanmak için alacağını ve 60 mikron bakış bir alan için bu sadece bir piksel boyutu 15 nm verecek yaşamak. Ultrastrüktür hücre ve doku görüntüleme için daha küçük bir piksel boyutu daha uygundur; genellikle 4 ve 10 nm / piksel arasında. Mikroskop bu yeteneği olsa bile görüntü 60 x 60 mikron bir alan için, 10 saat içinde kazanılmış olacaktır. Bu nedenlerden dolayı, mikroskop, görüntü birimleri için 10 x 10 x 10 mikron, ya da bütün hücrelerinin önemli bölgelerinde sırasını ideal bir araçtır. Bu, 48 saatlik bir süre içinde bu yordamı ile tezat örnekler üzerinde kolayca yapılabilir. Şimdiye kadar ağırlıklı olarak beyin dokusu lamelleri için kalarak kültür memeli hücrelerinin yanı sıra, çeşitli türleri ile protokol olmuştur. Ancak, fiksasyon ve boyama işlemi eşit derecede iyi kontrastlı görüntü yığınları üretmek için bitki materyali de dahil olmak üzere diğer birçok türde, biyolojik madde ile birlikte kullanılabilir. Bu nedenle bu tekniğin ana avantajı izotropik vokseller ile görüntü birimleri için kapasitesini. Bu tür görüntü yığınları, yığın içinde herhangi bir düzlemde alınan görüntüleri kullanarak 3d bir hacim analizleri için izin verir. Bu yarar, herhangi bir yönden gelen görüntü serisi ve daha büyük bir görüntü ayrıntısı (Şekil 3) sağlayan görüntü özellikleri gözlemci izin vermektir.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th></tr><tr><td> Siyanoakrilat yapıştırıcı </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Diseksiyon mikroskobu: Leica MZ8 </td><td> Leica Microsystems, Almanya </td><td></td></tr><tr><td> Durcupan reçine </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, İsviçre </td><td></td></tr><tr><td> FIB / SEM mikroskobu (Zeiss, Nvision 40) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bardak histoloji slaytlar </td><td> Menzel-Gläser, Almanya </td><td> AA00008032E </td></tr><tr><td> Cam bıçak üreticisi Leica EM KMR2 </td><td> Leica Microsystems, Almanya </td><td></td></tr><tr><td> Cam sintilasyon şişeleri (20ml) </td><td> EMS, ABD </td><td> 72634 </td></tr><tr><td> Glutaraldehyde </td><td> EMS, ABD </td><td> 16222 </td></tr><tr><td> Mücevherci gördüm </td><td> EMS, ABD </td><td> 72010 </td></tr><tr><td> Kalıp ayırma maddesi </td><td> Glorex, İsviçre </td><td> 62407445 </td></tr><tr><td> Osmium tetroksit </td><td> EMS, ABD </td><td> 19110 </td></tr><tr><td> Paraformaldehit </td><td> EMS, ABD </td><td> RT 19.208 </td></tr><tr><td> Fosfat tuzları fosfat tamponu </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, İsviçre </td><td> 71.642 ve 71.496 </td></tr><tr><td> Sodyum cacodylate </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, İsviçre </td><td> 20840 </td></tr><tr><td> Altın hedef Kaplayıcı&#39;ya Sputter </td><td> Cressington, ABD </td><td></td></tr><tr><td> Tris tabanı (TBS) </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, İsviçre </td><td> T1378 </td></tr><tr><td> Ultramicrotome: Leica UCT </td><td> Leica Microsystems, Almanya </td><td></td></tr><tr><td> Uranil asetat </td><td> EMS, ABD </td><td> RT 22451 </td></tr></tbody></table>

odaklı İyon işın freze ve beyin dokusu taramalı elektron mikroskobu

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

Bu protokol, ne biyolojik örnekler, beyin dokusu gibi, odaklanmış iyon demeti / taramalı elektron mikroskobu (FIB / SEM) kullanarak üç boyutlu olarak görüntülenmiş olabilir açıklar. Osmiyum tetroksit ve uranil asetat kullanarak aldehitler, ağır metal vitray örnekleri ile sabitlenir. Sonra alkol ile kurutulmuş ve daha sonra sertleşmiş reçine ile sızmış. Işık mikroskobu ve cam bıçak ile ultramicrotome kullanarak, yüzeye yakın bölgede faiz içeren küçük bir blok yapılır. Blok sonra FIB / SEM içine yerleştirilir ve iyon demeti, bu bölgeye yakın bloğunun bir tarafı boyunca kabaca değirmen dikey bir yüz için kullanılır. Saçılmış elektron temel yapıları görüntü kullanarak, daha küçük bir yüzü daha ince bir iyon demeti ile öğütülmüş ve yüzey görüntülü ve öğütülmüş tam yüz alanı belirlemek için daha yakından incelenmektedir. Daha sonra mikroskop parametreleri karşısında arka arkaya seri görüntüler blok hacmi ile toplanır, böylece öğütülmüş ve görüntülü şekilde ayarlanır. Görüntü yığını genellikle her yönde küçük bir 4 mil olarak boyutları ile izotropik vokseller içerecektir. Herhangi bir görüntü düzlemi Bu görüntü kalitesi, kullanıcı görüntü yığını içinde herhangi bir görüş açısı hücre ultrastrüktür analiz sağlar.

Bu protokol, taramalı elektron mikroskobu, reçine gömülü beyin dokusu, odaklanmış iyon demeti üç boyutlu olarak hazırlanmış ve yansıması nasıl açıklamaktadır.

Odaklı İyon Işın Freze ve Beyin Dokusu Taramalı Elektron Mikroskobu

Bu protokol, beyin dokusu gibi biyolojik örneklerin odaklanmış iyon demeti/taramalı elektron... kullanılarak nasıl üç boyutlu olarak görüntülenebileceğini açıklamaktadır.

Bu prosedürün amacı, odaklanmış iyon demeti ve taramalı elektron mikroskobu kullanarak beyin dokusunun belirli bir bölgesinden seri görüntüler toplamaktır. Bu işlem, öncelikle beynin boyanan ve ardından reçineye gömülen dilimler halinde kesilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, gömülü beyin kesitinden ilgilenilen bölgenin kesilip boş bir reçine bloğuna monte edilmesidir.Üçüncü adım, reçine bloğun bir ultra mikrotom ile düzeltilmesi ve sadece görüntülenmesi istenen bölgeyi izole etmek için mikroskobun iyon demetinin kullanılmasıdır. Son adım, her görüntü alınmadan önce ince tabakaların tekrar tekrar kaldırılması için iyon demeti kullanılarak reçine bloğun bir yüzeyinin seri şekilde görüntülenmesidir. Nihayetinde, bir ilgi alanı boyunca seri görüntülerin yer aldığı sonuçlar elde edilebilir.Görüntü serisi otomatik olarak toplanır ve veri kümesi genellikle izotropik voksellere sahiptir, böylece görüntü yapıları yığındaki herhangi bir açıdan görüntülenebilir. Bu tekniğin seri kesit transmisyon elektron mikroskopisi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, çok daha yüksek Z çözünürlüğü sağlayabilmesidir. Elektron tomografisi ile karşılaştırıldığında ise, reçineye gömülmüş örnekler için optimal bir çözünürlükte çok daha büyük hacimleri görüntüleyebilmektedir.Prosedür, anestezi uygulanmış ve perfüze edilmiş bir sıçanın fikse edilmiş beyninin diseke edilmesiyle başlar. Beyni, plastik bir kalıba sıcak %5 aeros içerisine gömün; aeros donmadan önce beyni doğru açıya getirin, ardından içinde beyin bulunan aeros bloğunu bir vibratom dilimleyici kullanarak örnek tutucuya monte edin. 80 mikron kalınlığında koronal kesitler alın ve ilgi bölgesini kapsayacak kadar kesit kesin.Ardından numuneleri 20 mililitrelik cam izolasyon tüplerine yerleştirin. Her tüpe 10 adede kadar kesit yerleştirin. Numuneleri 0,1 molar K coate tamponu ile her biri beş dakika sürecek şekilde üç kez yıkayın.Ardından numuneleri 0.1 molar K coate tamponunda %1,5 potasyum siyanür ve %1 osmiyum tetroksit ile 30 dakika boyunca boyayın. Numunelerin boyanmasına 0.1 molar K coate tamponunda %1 osmiyum tetroksit ile 30 dakika daha devam edin. Bunu takiben, numuneleri çift distile su ile üç dakika boyunca bir kez durulayın, ardından çift distile suda %1 al asetat ile 30 dakika boyunca boyayın.Ardından, kesitleri beş dakika boyunca çift distile su ile durulayın ve ardından her değişim için iki dakika ayırarak dereceli bir alkol serisinde dehidre edin. Bir sonraki adım, kesitleri alkol ile karıştırılmış artan konsantrasyonlardaki Duran reçinesine gömmektir; değişimler arasında 30 dakika bekleyin. %50 etanol ve %50 reçine ile başlayın, ardından %30'a %70, sonra %10'a %90 ve son olarak kesitleri 30 dakika boyunca %100 reçinede tutun.Ardından besiyerini %100 taze duran reçine ile değiştirin. Roller karıştırıcıda bir saat boyunca yavaşça çalkalayın. Gömme işleminin ardından, kesitleri önceden kalıp ayırıcı ajanlarla kaplanmış cam mikroskop lamlarına yerleştirmek için ahşap bir kokteyl çubuğu kullanın.Slaytlara mümkün olduğunca fazla kesit yerleştirin, ancak slaytları aşırı doldurmamaya dikkat edin. Mikroskop lamları arasına bir kimlik etiketi yerleştirildiğinden emin olun. Lamları 24 saat boyunca 65 °C'lik bir fırında bekletin.Ertesi gün, örnekleri fırından çıkarın. Cam mikroskop lamlarının arasına nazikçe bir jilet itin ve örnekleri içeren reçine tabakasını, parmaklarınızla tutarak lamların arasından çıkarın. Örneği akan su altında nazikçe yıkayın.Kalıp ayırıcı maddeleri temizlemek için, numuneyi düşük güçlü bir objektif kullanarak iletimli aydınlatmaya sahip bir diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin. İlgilenilen bölgeyi ince bir iğne ile işaretleyin. İlgilenilen bölgenin etrafında üç milimetreye üç milimetrelik küçük bir kare kesmek için bir ustura bıçağı kullanın.Küçük reçine bloğu boş bir reçine bloğunun üst kısmına yapıştırmak için akrilik yapıştırıcı kullanın. Ardından, bloğu ultra mikrotom tutucusuna sabitleyin. Bağlı olan stereo mikroskop üzerinden bakarak, sadece küçük bir malzeme piramidi kalana kadar ilgi bölgesinin etrafını jiletle kırpın.Ultra mikrotoma sabitlenmiş bir cam bıçak kullanarak, bloğun kenarını ilgi bölgesine yakın bir noktadan ve bloğun üst yüzeyine açılı olacak şekilde kesin. İlgi bölgesinin, blok yüzeyinin boyutlarına göre hassas bir şekilde konumlandırılabilmesi için bloğu daha fazla tıraşlayın. Bloğu ultra mikrotomdan çıkarın ve bir geçirimli ışık mikroskobunun altına yerleştirin.İlgi bölgesini fotoğraflayın. Budanmış bloğu, karbon boya ile kalan reçine sapından ayırmak için bir kuyumcu testeresi kullanın. SA'yı bloktan ayırıp bir SEM numune tutucuya sabitleyin ve görüntülenecek taraf en dış kenara bakacak şekilde yönlendirin.Yapıştırıcı kuruduktan sonra, preparatı bir püskürtme ve vakumlu evaporasyon sistemine aktarın ve bloğu 20 nanometreden daha kalın ince bir altın tabakasıyla kaplayın. Reçineye gömülmüş doku bloğu, odaklanmış iyon demeti taramalı elektron mikroskobunda görüntülenmeye hazırdır. Numuneyi tutucusuyla birlikte düşük büyütmede mikroskoba yerleştirin ve ikincil elektron görüntüleme kullanarak bloğu, ilgi bölgesi ve görüntülenecek blok yüzeyi karşı karşıya gelecek şekilde yönlendirin.Operatör, görüntülenecek yüzey frezeleme demetine paralel olacak şekilde bloğu yönlendirir. Bu işlem, 13 ila 27 nano amps iyon demeti akımı ve 30 kilovolts gerilim kullanılarak, elektron demetinin bu yüzeye 54 derece açıyla yönlendirilmesini sağlar.Görüntülenecek bölgenin ön kısmından dar bir reçine şeridini kaldırın. Ardından, ilgi bölgesinin üzerinde yer alan frezelenmiş yüzeyi görüntülemek için geri yansıtmalı görüntüleme moduna geçin. Daha önce alınmış olan ışık mikroskobu referans görüntüsünü ve frezelenmiş yüzeyin görüntüsünü kullanarak, mikroskobun gaz enjeksiyon sistemini kullanarak blok üzerinde frezelenecek ve görüntülenecek olan kesin bölgeyi belirleyin.700 picoamps akım kullanarak, ilgi bölgesinin üzerindeki blok yüzeyine yaklaşık bir mikron kalınlığında karbon veya metalden oluşan koruyucu bir tabaka kaplayın. Son olarak, blok üzerinde nihai görüntülerin alınacağı bölgeyi frezeleyin. Frezeleme ışınının, yüzeyde hiçbir frezeleme artefaktı görülmeyene kadar bu görüntü yüzeyini tamamen frezelemesine izin verin.Yüzeyin seri görüntülemesi için mikroskop parametrelerini seçin. Tipik parametreler, 1.2 ile 2 kV arası voltajlar ve 4 ile 20 nm arası piksel boyutlarıdır. Yüzeyi işlemenin ve bir görüntü elde etmenin toplam süresinin iki dakikanın altında olması için piksel bekleme süresi yaklaşık 10 µs olmalıdır.Termal değişikliklerin dengelenmesi için mikroskobu en az iki saat dinlendirin. Ardından, ilgi bölgesinden seri görüntüler elde etmek için frezeleme ve görüntüleme işlemini başlatın. Bu şekil, wrap brain içindeki ultra yapıyı gösteren blok yüzeyinin ters kontrastlı geri saçılma görüntüsünü göstermektedir.Tüm membranların yanı sıra büyük makromoleküler yapılar da görünür durumdadır. Bu şekil, beş nanometre aralıklarla toplanan toplam 1.600 görüntüden oluşmakta olup, izotropik voksellere sahip bir görüntü yığını meydana getirmektedir. Bu yığın, herhangi bir düzlemde aynı çözünürlükle görüntülenebilir.Böylece bu videoyu izledikten sonra, odaklanmış demet taramalı elektron mikroskobu ile seri görüntüleme için beyin dokusunun nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

focussed-ion-beam-milling-scanning-electron-microscopy-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Nöronal aksonlar ve dendritler sergileyen fare kortikal beyin dokusunun sabit bir bölümünü alın. Dendritler, aksonlarla sinapslar oluşturan dendritik dikenler olarak bilinen çıkıntılara sahiptir. Dokuyu lipitlere bağlanan osmiyum-ferrosiyanür ile inkübe edin, ardından görüntüleme için yapısal kontrastı artıran başka bir osmiyum uygulaması yapın. Makromoleküllere bağlanan ve kontrastı artıran ağır bir metal bileşiği ile boyayın. Reçine gömmek için artan alkol konsantrasyonları kullanarak...

Sinaptik Bağlı Nöronların 3D Rekonstrüksiyonu için Odaklanmış İyon Işını Taramalı Elektron Mikroskobu

Bu videoda, yüksek çözünürlüklü görüntüler üretmek için hem taramalı elektron mikroskobu (SEM) hem de transmisyon elektron mikroskobu (TEM) unsurlarını birleştiren bir teknik olan büyük ölçekli taramalı transmisyon elektron mikroskobu (STEM) kullanarak zebra balığı larva beyin hasarını araştırmak için bir yöntem gösterilmektedir. Beyin hasarını tanımlamak için numunelerin hazırlanması ve yüksek çözünürlüklü STEM görüntülerinin elde edilmesiyle ilgili adımları ana hatlarıyla belirtir.

Zebra Balığı Larva Beyin Hasarının Büyük Ölçekli Taramalı Transmisyon Elektron Mikroskobu Kullanılarak İncelenmesi

Büyük ölçekli 2D elektron mikroskobu (EM) veya nanotomi, nano ölçekli çözünürlüklü EM'nin doku çapında uygulamasıdır. Burada, zebra balığı larva beynini sağlıkta ve non-invaziv beyin hasarı üzerine araştırmak için uygulanan nanotomi için evrensel bir yöntemi açıklıyoruz.

Sağlıklı ve Yaralı Zebra balığı Beyin büyük ölçekli Tarama Transmisyon Elektron Mikroskobu (Nanotomy)

Memeli beyin dokusundan mitokondriyal görselleştirme ve analiz zorlu bir iştir. Burada, bu kritik enerji üreten organelin morfolojik ve hacimsel analizi hakkında bilgi edinmek için seri blok yüz taramalı elektron mikroskobundan (SBFSEM) elde edilen üç boyutlu (3D) rekonstrüksiyon analizinin nasıl kullanılabileceğini açıklıyoruz.

Seri Blok-Yüz Taramalı Elektron Mikroskop Kullanarak Beyin Mitokondri Analizi

Bu makalede küçük hayvan beyin mikro-CT görüntüleme, hangi lezyonlar sayılabilir ve tüm beyin bağlamında yüksek hassasiyetle yer alan elektrotlar hazırlamak için basit bir yöntem.

Lezyonlar karakterize ve küçük hayvan beyinlerinde elektrot bulmak için bir mikro-CT-esaslı Yöntem

Burada, seri blok yüz ve odaklanmış iyon ışını tarama elektron mikroskobu ile ilgi alanını hedefleyen bir protokolü etkin bir şekilde birleştirmek için bir protokol sıyoruz. Bu, üç boyutlu olarak verimli arama yapılmasına ve geniş bir görüş alanında nadir olayları bulmanızı sağlar.

Seri Blok Yüz ve Odaklanmış Iyon ışını Scan Elektron Mikroskobu Kullanılarak Yapılan Hedefli Çalışmalar

Nano-mimarinin intrakortikal mikroelektrot cihazlarına aşındırmalarının inflamatuar yanıtı azaltabileceğini ve elektrofizyolojik kayıtları iyileştirme potansiyeline sahip olduğunu gösterdik. Burada açıklanan yöntemler, nano-mimarileri işlevsel olmayan ve fonksiyonel tek saplı silikon intrakortikal mikroelektrotların yüzeyine aşındırmak için bir yaklaşımı ortaya çıkarmaktadır.

Etch Nano mimarilerine mikroelektrotlara odaklanmış iyon ışını Litografisi

Burada, kriyo-elektron tomografisi için hücresel numunelerin hazırlanmasına rehberlik etmek için 3D bağıntılı odaklanmış iyon ışını frezeleme için bir boru hattı sunuyoruz. İlgilenilen floresan etiketli proteinlerin 3 boyutlu konumu önce kriyo-floresan mikroskobu ile belirlenir ve daha sonra öğütme için hedeflenir. Protokol memeli, maya ve bakteri hücreleri için uygundur.

Yüksek Çözünürlüklü Kriyo-Elektron Tomografisi için 3D Korbağıntılı Odaklanmış İyon Işını Frezeleme ile Numune Hazırlama

Bu iş akışı, kriyojenik üç tesadüfi görüntüleme platformu kullanarak küçük (eksenel kapsamda &lt;1 μm) ve nadir (hücre başına 1 kopya) floresan etiketli biyolojik yapıları hedefleyen lamel üretimini mümkün kılar. Bu platform, floresan mikroskobu, odaklanmış iyon ışını frezeleme ve taramalı elektron mikroskobunu tek bir odak konumunda birleştirir ve frezeleme sırasında eş zamanlı floresan mikroskobuna olanak tanır.

Hücrelerin Hedeflenen Frezelenmesi için Kriyojenik Tesadüfi Floresan, Elektron ve İyon Işını Mikroskobu Kullanan İş Akışı

Beyin örneklerindeki tüm hücrelerin mezoscale olarak tarafsız görüntülenmesini sağlayan ve aynı örnekte bant tabanlı seri taramalı elektron mikroskopisinin görüntüleme iş akışına sorunsuz entegre edilebilen Optik Çok Katmanlı Girişim Tomografisi (OMLIT) adlı yeni bir görüntüleme tekniği tanıttık.

Mezoskopik Tüm Hücreli Beyin Haritalama İçin Taramalı Elektron Mikroskopi Uyumlu Optik Görüntüleme Yöntemi

Öğrenin, odaklı iyon ışın taramalı elektron mikroskobu kullanarak reçine gömülü beyin dokusunun üç boyutlu görüntülenmesini. Bu yöntem, yüksek çözünürlüklü seri görüntüleme ve detaylı yapısal analiz sağlar.

Odaklı İyon Işın Freze ve Beyin Dokusu Taramalı Elektron Mikroskobu

Daha fazla video keşfet