Odaklı İyon Işın Freze ve Beyin Dokusu Taramalı Elektron Mikroskobu

Bu prosedürün amacı, odaklanmış iyon demeti ve taramalı elektron mikroskobu kullanarak beyin dokusunun belirli bir bölgesinden seri görüntüler toplamaktır. Bu işlem, öncelikle beynin boyanmış ve ardından reçineye gömülmüş dilimlere ayrılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, gömülü beyin kesitinden ilgili bölgenin kesilip boş bir reçine bloğuna monte edilmesidir.

Üçüncü adım, reçine bloğun bir ultra mikrotom ile düzeltilmesi ve görüntülenecek bölgenin izole edilmesi için mikroskobun iyon ışınının kullanılmasıdır. Son adım, her görüntü alınmadan önce ince tabakaların tekrarlanan şekilde kaldırılması için iyon ışınının kullanılarak reçine bloğun bir yüzeyinin seri olarak görüntülenmesidir. Nihayetinde, ilgi duyulan bir bölge boyunca seri görüntülerin elde edildiği sonuçlar elde edilebilir.

Görüntü serisi otomatik olarak toplanır ve veri seti genellikle izotropik voksellere sahiptir, böylece görüntü yapıları yığındaki herhangi bir açıdan görüntülenebilir. Bu tekniğin seri kesit transmisyon elektron mikroskobisi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, çok daha yüksek Z çözünürlüğü sağlayabilmesidir. Elektron tomografisi ile karşılaştırıldığında ise, reçineye gömülmüş örnekler için optimal çözünürlükte çok daha büyük hacimleri görüntüleyebilmektedir.

Prosedür, anestezi uygulanmış ve perfüzyonu yapılmış bir sıçanın fikse edilmiş beyninin diseke edilmesiyle başlar. Beyni, plastik bir kalıba sıcak %5 aros içine gömün; aros donmadan önce beyni doğru açıya yönlendirin, ardından beyni içeren aros bloğunu bir vibrato slice kullanarak örnek tutucuya sabitleyin. 80 micron koronal kesitler alın ve ilgi bölgesini kapsayacak şekilde gerekli sayıda kesit kesin.

Ardından numuneleri 20 mililitrelik cam izolasyon viyallerine yerleştirin. Her viyale en fazla 10 kesit koyun. Numuneleri 0.1 molar K coate tamponu ile her biri beş dakika sürecek şekilde üç kez durulayın.

Ardından numuneleri 0,1 molar K coate tamponunda 1,5% potasyum siyanür ve 1% osmiyum tetroksit ile 30 dakika boyunca boyayın. Numunelerin boyanmasına 0,1 molar K coate tamponunda 1% osmiyum tetroksit ile 30 dakika daha devam edin. Bunun ardından, numuneleri çift distile su ile üç dakika boyunca bir kez durulayın ve ardından çift distile su içindeki 1% al asetat ile 30 dakika boyunca boyayın.

Ardından, kesitleri beş dakika boyunca çift distile su ile durulayın ve ardından her değişim için iki dakika süre tanıyarak dereceli bir alkol serisindeyine dehidrasyona tabi tutun. Bir sonraki adım, kesitleri alkol ile karıştırılmış artan konsantrasyonlardaki Duran reçinesi içine gömmektir; değişimler arasında 30 dakika bekleyin. %50 etanol ve %50 reçine ile başlayın, ardından %30'a %70, sonra %10'a %90 ve son olarak kesitleri 30 dakika boyunca %100 reçinede bekletin.

Ardından besiyerini %100 taze duran resin ile değiştirin. Roller karıştırıcıda bir saat boyunca yavaşça çalkalayın. Gömme işleminin ardından, kesitleri daha önceden kalıp ayırıcı ajanlarla kaplanmış cam mikroskop lamlarına yerleştirmek için ahşap bir kokteyl çubuğu kullanın.

Slaytlara mümkün olduğunca çok kesit yerleştirin, ancak slaytları aşırı doldurmamaya dikkat edin. Mikroskop lamları arasına bir kimlik etiketi yerleştirildiğinden emin olun. Lamları 24 saat boyunca 65 °C'lik bir fırında bekletin.

Ertesi gün, numuneleri fırından çıkarın. Cam mikroskop lamlarının arasına bir jiletle nazikçe bastırın ve numuneleri içeren reçine tabakasını parmaklarınızla tutarak lamların arasından çıkarın. Numuneyi akar su altında nazikçe yıkayın.

Kalıp ayırıcı maddeleri temizlemek için örneği, düşük büyütmeli objektif kullanarak geçirimli aydınlatmaya sahip bir diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin. İlgilenilen bölgeyi ince bir iğne ile işaretleyin. İlgilenilen bölgenin etrafından üç milimetreye üç milimetrelik küçük bir kare kesmek için bir jilet kullanın.

Küçük reçine bloğu, boş bir reçine bloğunun üst kısmına akrilik yapıştırıcı ile yapıştırın. Ardından, bloğu ultra mikrotom tutucusuna sabitleyin. Bağlı olan stereo mikroskop üzerinden bakarak, sadece küçük bir malzeme piramidi kalana kadar ilgi bölgesinin etrafını bir jilet yardımıyla tıraşlayın.

Ultramikrotoma sabitlenmiş bir cam bıçak kullanarak, bloğun kenarını ilgi bölgesine yakın bir noktadan, bloğun üst yüzeyine açılı olacak şekilde kesin. İlgi bölgesinin, blok yüzeyinin boyutlarına göre kesin olarak konumlandırılabilmesi için bloğu daha fazla tıraşlayın. Bloğu ultramikrotomdan çıkarın ve bir transmisyon ışık mikroskobunun altına yerleştirin.

İlgilenilen bölgenin fotoğrafını çekin. Karbon boyalı kalan reçine sapından budanmış bloğu ayırmak için bir kuyumcu testeresi kullanın. SA blok parçasını bir SEM numune tutucuya sabitleyin ve görüntülenecek tarafı en dış kenara bakacak şekilde yönlendirin.

Yapıştırıcı kuruduktan sonra, örneği bir crescent ve vakumlu evaporasyon sistemine aktarın ve bloğu 20 nanometreden daha kalın ince bir altın tabakasıyla kaplayın. Rezin gömülü doku bloğu artık odaklanmış iyon demeti taramalı elektron mikroskobunda görüntülenmeye hazırdır. Örneği tutucusuyla birlikte düşük büyütmede mikroskoba yerleştirin ve ikincil elektron görüntüleme kullanarak, ilgi alanı ve bloğun görüntülenecek yüzü karşı karşıya gelecek şekilde bloğu yönlendirin.

Operatör, görüntülenecek yüzey frezeleme demetine paralel olacak şekilde bloğu yönlendirir. Bu işlem sonucunda, 13 ile 27 nano amps arasındaki bir iyon demeti akımı ve 30 kilovolt gerilim kullanılarak elektron demetinin bu yüzeye 54 derece açıyla yönlendirilmesi sağlanır.

Görüntülenecek bölgenin ön kısmından dar bir reçine şeridini kaldırın. Ardından, ilgi bölgesinin üzerinde yer alan frezelenmiş yüzeyi görüntülemek için geri saçılımlı görüntüleme moduna geçin. Daha önce alınan ışık mikroskobu referans görüntüsünü ve frezelenmiş yüzeyin görüntüsünü kullanarak, mikroskobun gaz enjeksiyon sistemini yardımıyla blok üzerinde frezelenecek ve görüntülenecek tam bölgeyi belirleyin.

İlgilenilen bölgenin üzerindeki blok yüzeyine 700 picoamps akım kullanarak yaklaşık bir mikron kalınlığında karbon veya metalden oluşan koruyucu bir tabaka kaplayın. Son olarak, final görüntülerinin alınacağı blok bölgesini frezeleyin. Frezeleme ışınının, yüzeyde hiçbir frezeleme artefaktı görülmeyene kadar bu görüntü yüzeyini tamamen frezelemesini sağlayın.

Yüzeyin seri görüntülemesi için mikroskop parametrelerini seçin. Tipik parametreler, 1.2 ile iki kilovolt arası voltajlar ve dört ile 20 nanometre arası piksel boyutlarıdır. Yüzeyi frezelemek ve bir görüntü elde etmek için geçen toplam sürenin iki dakikanın altında olması için piksel kalış süresi yaklaşık 10 mikrosaniye olmalıdır.

Termal değişimlerin dengelenmesi için mikroskobu en az iki saat dinlendirin. Ardından, ilgi bölgesinden seri görüntüler elde etmek için frezeleme ve görüntüleme işlemini başlatın. Bu şekil, wrap beynin bir bölgesindeki ultrastrüktürü gösteren blok yüzeyinin ters kontrastlı geri saçılmalı görüntüsünü sunmaktadır.

Tüm membranların yanı sıra büyük makromoleküler yapılar da görünür durumdadır. Bu şekil, beş nanometrelik aralıklarla toplanan toplam 1.600 görüntüden oluşturulmuştur ve izotropik voksellere sahip bir görüntü yığınıyla sonuçlanmıştır. Bu yığın, aynı çözünürlükle herhangi bir düzlemde görüntülenebilir.

Böylece, bu videoyu izledikten sonra, odaklanmış ışın taramalı elektron mikroskobu ile seri görüntüleme için beyin dokusunun nasıl hazırlanacağına dair iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.