Optik Şeffaf indiyum kalay oksit Elektrotlar Desenlendirme Hücreler

Merhaba, ben Isha. Dr.Zen'in laboratuvarında ikinci sınıf yüksek lisans öğrencisiyim. California Davis Üniversitesi Biyomedikal Mühendisliği Bölümü'ndeyiz.

Bugün size Ian'ın doku mühendisliğinde mikro fabrikasyon optik olarak şeffaf İndiyum 10 oksit elektrotları üzerinde nasıl kontrol edildiğini ve organın mikro çevresini taklit etmek için rejenerasyon çabalarının yapıldığını göstereceğim. Bu mikro ortamı in vitro olarak oluşturmak için, hücreleri bir substrat üzerinde mekansal ve zamansal olarak izole etmek esastır. Farklı karaciğer hücresi tiplerinin konumunu kontrol edebileceğimiz yüzeyler tasarlamakla ilgileniyoruz.

Bugünün deneyinde, hücre yapışmazından hücre yapıştırıcısına geçirilebilecek bir yüzey oluşturmak için yüzey modifikasyonu, mikrofabrikasyon ve elektrokimya kullanacağız. İlk adım fotolitografidir. İşte bu sürecin nasıl işleyeceğine dair bir akış diyagramı.

Mavi cam ışıktır, yeşil ise cam ışığın üzerine kaplanmış indiyum 10 oksittir. İlk olarak, yapacağımız şey, burada İndiyum 10 oksit kaplı cam ışığın üzerinde gösterilen kırmızı foto direnci döndürmek. Daha sonra bunu bir fotoğraf maskesinden ultraviyole ışığa geçireceğiz ve maruz kalan bölgeler gelişmekte olan bir çözümde geliştirilecek.

Fotoğraf direnci ile korunmayan ITO bölgeleri IT oing'de kaldırılacaktır. Ve son olarak, kalan tüm foto direnç, ITO elektrotlarımızı oluşturmak için asetonda kaldırılacaktır. İşte kalan üç adımın akış diyagramı.

İlk olarak, tüm yüzeyi peg sylin ile değiştireceğiz. Bu, yüzeyin kirlenmemesini sağlayacak ve hiçbir hücre veya protein ona bağlanmayacaktır. Daha sonra, daha önce yaptığımız iki elektrottan peg silindiri spesifik olarak emmek için elektrokimyayı kullanacağız.

Ve son olarak, fibroblastları yüzeyin üstünde inkübe edeceğiz ve seçici olarak sadece şerit bölgelerine bağlanacaklar. Şimdi deneyimize başlamaya hazırız. İlk adım, temiz bir odada gerçekleştirilecek olan fotolitografiyi içerir.

Öyleyse devam edelim ve temiz odaya girelim. Şimdi burada temiz odamızdayız. Deneyimize başlamadan önce yapacağımız şey, indiyum kalay oksit veya ITO kaplı numunelerimizi fırınımızda 200 ° C'de pişirmek.

Bu şekilde tüm yüzeylerimizi kurutabiliriz. Ve 200 ° C'de pişirdikten sonra, onu döndürme teknolojimize yerleştireceğiz ve aslında fotoğraf direncini uygulayacağız. Bu yüzden, ITO substratımızı kuruttuktan sonra, onu alıp spin teknolojisinin aynasına yerleştireceğiz.

Bu ayna, çeyrek cam ışığı tutacak kadar büyük. Sonra gideceğiz, vakum uygulayacağız. Bundan sonra, alt tabakaya pozitif ton, foto direnç uygularız.

Fotoğraf direncinin uygulanmasından sonra, devam edip başlıyoruz. Bu iki adımdan oluşur. Birincisi yayma, ikincisi ise yayma adımındaki spin kaplamadır.

Mandren 800 RPM'de döner ve bu, fotoğraf direncini tüm yüzeye eşit şekilde yayar. Bununla birlikte, bir sonraki 4.000 RPN'de olan ve 4.000 RPM'de gerçekten ince bir tabaka oluşturan sıkma adımıdır. İnce derken, yaklaşık bir mikron demek istiyorum.

Fotoğraf kelimesini kırarsanız direnir, fotoğraf olur ve direnir. Işıkla aktive edilir. Bu nedenle, temiz odada çalışıyoruz ve filtrelenmiş ışık kullanıyoruz, böylece fotoğraflı kapı rezistansımız ışık tarafından aktive olmuyor ve daha sonra gravür yaptığımızda kullanacağımız mülk olan varlıklara karşı dayanıklı.

Şimdi spin kaplama, yüzeyde foto direnç ile işimiz bitti ve sadece onu çıkarıp bir sonraki adımımıza geçeceğiz. Bu yüzden numuneyi bir dakika 45 saniye pişirdikten sonra, onu sıcak plakadan alıp top maskesi astarımıza taşıyacağız. Burada ihtiyacımız olan bir maskeyi alıyoruz ve daha sonra maskeyi alt tabakamızın üstüne yerleştiriyoruz, böylece port dirençli alt tabakamız ile maske arasında bir temas baskısı elde etmek için, sadece ağırlık eklemek için dört inçlik bir cam gofret ile yerleştiriyoruz.

Ve bununla işimiz bittiğinde, deklanşörü tekrar takıyoruz ve ardından numuneyi UV ışığına maruz bırakıyoruz. Pozlama tamamlandıktan sonra, kapağı ters sırada hareket ettiriyoruz. Cam gofretimizi çıkarıyoruz, maskemizi çıkarıyoruz ve sonra alt tabakamızı çıkarıyoruz ve geliştirme için devralıyoruz.

Örneği kullanıma sunduktan sonra bir geliştirici çözümüne yerleştiririz. Numune UV ışığına maruz kaldığında, baz ve geliştirici çözelti ile nötralize olan ve aslında yüzeyden uzaklaştırılan hidrojen iyonu formu vardı. Artık numuneyi hazırlarken alt tabakayı sürekli olarak saptırdığınızdan emin olmak istiyorsunuz.

Ve bunu yaptığınızda, yaklaşık ilk dakika veya bir buçuk dakika içinde, açığa çıkan bölgelerin aslında geliştiğini ve yüzeyden uzaklaştırıldığını görebilirsiniz. Ancak tam geliştirmenin gerçekleşmesi için, geliştirici çözümünde yaklaşık beş dakika beklettik. Geliştirme tamamlandıktan sonra, onu çıkaracağız, yıkayıp suyunu çıkaracağız ve ardından bir nitrojen tabancası kullanarak kurutacağız.

Örneğimizi kuruttuktan sonra, onu ele alacağız ve mikroskobumuz altında görselleştireceğiz. Burada örneğe mikroskop altında bakıyoruz. Beş dakika boyunca geliştirdikten sonra çıkardık.

Burada görebileceğiniz iki bölge var, fotoğraf direncinin kapsadığı daha koyu bir bölge ve fotoğraf direncinin kaldırıldığı daha açık bölge. Daha önce kullandığımız maske ile ilgili olarak, maske üzerindeki daha koyu bölgeler şu anda mikroskop altında gördüğümüz daha koyu bölgelerdi, oysa burada gördüğümüz şeffaf bölgeler maske üzerinde şeffaftı. Burada gösterilen tasarımlardan biri, 500 mikrondan 50 mikrona kadar uzanan farklı boyutlardaki dizilerdir, diğer tasarım ise sadece birbirine bağlı 1000 mikronluk dairelerdir.

Yani burada aynı prosedür kullanılarak yapılmış farklı bir tasarımımız var. Burada ayrı ayrı adreslenebilir elektrotlarımız var. Bununla demek istediğim, ITO'nun farklı bölgelerinin birbirine bağlı olduğu ve farklı şekilde aktive edilebildiğidir.

Örneğin burada, merkezi dairesel bölgeler, burada bir elektrikli pede bağlanırken, en dıştaki dikdörtgen bölgeler farklı bir elektrikli pede bağlanırlar. Bu şekilde bu iki farklı yüzeyi farklı zaman noktalarında uyarabiliriz. Numunelerimize baktıktan sonra, geçeceğimiz bir sonraki adım numuneyi aşındırmaktır.

Fotoğraflar tarafından korunmayan bölgeler ne olursa olsun, bir ITO gravüründe kazınacaktır. Bunu yapmadan önce, ITO aşındırma asit içerdiğinden uygun giysiler giydiğimizden emin olmalıyız. Ve şimdi asit koruyucu önlüğümü giydikten, yüz siperliğimi taktıktan sonra, bir cam kabın içine biraz ITO aşındırması dökeceğim.

ITO aşındırma, %20 hidrojen klorür, %5 nitrik asitten oluşur ve geri kalanı DI sudur. Sonra numunemi getir ve aşındırmaya yerleştir. Mikroskopta daha önce, fotoğraf artışları tarafından korunmayan bazı bölgeler olduğunu gördük.

ITO aşındırmasındaki asitler bu bölgelere saldırdı ve bu bölgelerden ITO'nun kazınmasına neden oldu. ITO yüzeyden yavaşça bozuldukça renk değiştirir. Burada, başlangıçta sahip olduğu mavimsi bir değişimden bu morumsu değişime geçtiğini ve şimdi sarı borsaya geçtiğini görebilirsiniz.

Renkteki değişiklik, ITO'nun kazındığını gösterir. Şimdi 15 dakikadayız. Tüm ITO, tamamen kazınmış.

Ve şu anda ne görüyorsunuz, fotoğraflar ITO bölgeleri korunuyor. Bu nedenle, aşındırma tamamlandıktan sonra, yüzeyde kalan bazı asitler hala vardır. Bu asidi çıkarmak için, tüm asidi nötralize edecek bir sodyum karbonat çözeltisine yerleştireceğiz.

Asitleri nötralize ettikten sonra, onu çıkarıp DI su ile temizleyeceğiz ve ardından nitrojen ile kuruyacağız. Artık asitle aşındırma işlemini bitirdik. Artık asit yok, sıcak elbisemden çıktım.

Onu çıkaracağız ve aktaracağız ve mikroskobumuz altında görselleştireceğiz. Şimdi numuneyi mikroskop altında inceliyoruz. Bu, ITO aşındırmasını gerçekleştirdikten sonra.

Bu durumda, daha koyu bölgeler, ITO'nun kazındığı cam bölgelerdir. Ve daha hafif bölgeler, bu durumda foto direnç ile korunan ITO'dur. Bir kez daha, bunlar 500 ila 50 mikron arasındaki dizilerdir ve diğer durumda, her biri bin mikronluk birbirine bağlı dairelerimiz var.

Mikroskop altında baktık ve gördük ki cam bölgeler ve ITO bölgeleri vardı, ama ITO bölgeleri fotorezist ile korunuyordu. Şimdi bu fotorezisti çıkarmamız gerekiyor. Yani yapacağımız tek şey substratımızı almak, asetona koymak ve sonra bunu sonikatın içine yerleştirmek ve sadece 10 dakika boyunca sonikasyon.

Bu, tüm fotoğraf direncinin çıkarılmasını sağlar, kendi başına ton olarak kullanabilirsiniz, ancak vurmak için ses dalgalarını kullanan ve fotoğraf direncinin doğru şekilde çıkarılmasını sağlayan sonik vuruş ile. Sonik havadan çıkardıktan sonra DI suda yıkanır, tekrar nitrojen içinde kurutulur ve artık desenleri cam alt tabaka üzerinde net bir şekilde görebilirsiniz. Bunlar, başlangıçta fotoğraf direnci tarafından korunan desenlerdi.

Örneklerimize baktığımıza ve ITO kalıplarımızı bulduğumuza veya yaptığımıza göre, deneyin ikinci aşamasına başlayacağız. Bu aşama, yüzeyin kendi kendine monte edilmiş bir tek tabaka PEG siklin ile modifikasyonunu içerir. Ancak bunu yapmadan önce, yüzeyin reaktif olduğundan emin olmalıyız.

Bunu yapmak için bir plazma temizleyiciye yerleştiriyoruz. Bu, yüzeye hidroksil grupları ekler ve böylece onu reaktif hale getirir. Bunu yapmak için numunemizi plazma temizleyiciye yerleştiriyoruz ve ardından vakum pompamızı açıyoruz.

Oksijeni açıyoruz, ana gücü açıyoruz. Bu güç, oksijen gazını plazmaya dönüştürmek için kullanılır, bu daha sonra eklenir ve böylece hidroksil oluklarını oluşturur. Ve gücü açtığımızda, devam ediyoruz ve başlat düğmesine basıyoruz.

Şimdi işlem tamamlandıktan sonra, alt tabakamızı çıkarıyoruz, bir tabakta saklıyoruz ve temiz oda elbisesinin dışına çıkıyoruz ve bir sonraki adıma geçiyoruz. Artık temiz odadan çıktığımıza ve ideal desenlememizi tamamladığımıza göre, az önce polietilen glikol, CYLIN veya PEG Cylin ile desenlediğimiz yüzeyi değiştireceğiz. Peg silindirinin neme karşı reaktif olduğunu bilmek çok önemlidir.

Bu nedenle ahşap kullandığımız her şeyin nemsiz olması gerekir. Burada kullandığımız cam eşyalar, evcil hayvan tabakları, gece boyunca yüz ° C'de pişirildiler. Ve çözücü olarak kullanacağımız tun da susuzdur.

Nem içermez. Şimdi bu cam hoparlörlerin her ikisine de tun, susuz tolu dökeceğim, birinde bizim örneğimiz var. Şimdi iki petri kabı kullanmamız gerekiyor çünkü bunlardan biri modifikasyonu yapacağımız yer.

Ve diğerini daha sonra, modifikasyon bittiğinde alt tabakamızı gerçekten yıkamak için kullanacağız. Bu yüzden cam pizza tabaklarımızı koyduktan sonra, onu devralacağım ve torpido gözündeki hava kilidi odamıza aktaracağım. Hava kilidi haznesini kapattıktan sonra, hazneye nitrojen vereceğiz.

Şimdi buradaki ana oda zaten azotla dolu. Bu nedenle, nitrojenle doldurulmadıkça bu odayı açmak istemiyoruz. Her iki hazne de nitrojen olduğunda, tüm numunelerimizi bir pipetle birlikte aktaracağız.

Numuneleri aktarmak için daha sonra kullanacağımız mandalımız ve bir cımbızımız olacak. Bu yüzden eldivenlerimizi giyeceğiz, buradaki hazneyi açacağız ve hava kilidimizdeki her şeyi yavaş ve dikkatli bir şekilde çıkarıp ana hazneye yerleştireceğiz. Bu, alt tabakamızla birlikte Petri kabı ve yıkamak için kullanacağımız sadece toluenli Petri kabı.

Mevcut pxi nitrojen altında paketlenmiştir ve nitrojen ortamında olmadıkça bu şişeyi açmamalısınız. Bu nedenle, numuneyi çıkarmak istediğinizde bir kez çantaya geri koyarsınız. Yani silindiri çıkarıyorsunuz ve kullanacağımız konsantrasyon toluende %2 oluyor.

Yani siz çıkarın, içine uzun koyun, biz karıştırıyoruz. Ayrıca hazneye koyun ve iyice karıştırıldığından emin olun ve ardından numunenin Toin'de iki saat inkübe etmesine izin verin. Şimdi iki saat geçtiğine göre, numunemiz Pxi'deydi, numuneyi çıkaracağız ve kısa bir süre için yıkayacağız, etrafından çevireceğimiz ve hava kilidi odamıza taşıyacağımız taze bir toin solüsyonuna aktaracağız.

Hava kilidi odamıza girdikten sonra, sadece odamızı açacağız ve modifiye edilmiş yüzeyimizi çıkaracağız ve nitrojen tabancasını kullanarak sürebiliriz. Tekrar temiz, kuru bir Petri kabına koyuyoruz ve üzerinden geçip iki saat daha yüz derecede bir fırına koyuyoruz. Numuneler yüz C'deki fırında iki saat boyunca pişirildikten sonra, tellerimizi alıp hazırladığımız elektrotlara bağlayacağız.

Bunu, bire bir gümüş epoksi ve bir kürleme maddesi karışımı yaparak yapıyoruz. İşte bu gümüş epoksi, ve şimdi içine aynı miktarda kür ekliyoruz. İyice karıştırmak istiyoruz ve sonra bunu alıp tellerimizi takmak için kullanacağız.

Bu yüzden telimizi kullanmak istediğimiz elektrotların üzerine yerleştiriyoruz ve sonra kodluyoruz. Lehimleme ITO üzerinde çalışmaz, bu nedenle gümüş epoksi ve kürleme maddesi kullanmamız gerekir. Ve sonra, daha önce kullandığımız tüm sertleştirici maddenin çıkarılması ve sertleşmesi için pişiriyoruz ve bunu bir elektrot olarak kullanabiliyoruz.

Şimdi iki aşamayı tamamladığımıza göre, deneyin üçüncü aşamasına başlayacağız, bu da elektrokimya kısmını gerçekleştirmek. Bunu yapmak için bir örnek alacağız ve onu elektrokimyasal hücremize yerleştireceğiz. Onu elektrokimyasal hücremize yerleştirdikten sonra, üzerine bir O-ring yerleştireceğiz.

Bu, elektrokimyanın gerçekleşeceği bölgeyi izole edecek ve sonra sadece hücreyi mühürleyeceğiz. Bu yüzden numunemi telim bağlı olarak elektrokimyasal hücreye yerleştirdim. Artık voltajı uygulamak için potansiyel durumu kullanmaya hazırım.

Beyaz kabloyu tam burada referans elektroduna, kırmızı olanı, karşı elektroda takacağım ve son olarak yeşil olanı çalışma elektrodumuza takacağım. Tüm bu elektrotlar bağlandıktan sonra, elektrokimyasalın kendisine sadece bir x fosfat fosfat tampon salin veya PBS çözeltisi ekleyeceğim. Şimdi sadece bunu açıklığa kavuşturmak için, çalışma şekli şu an itibariyle tüm yüzeyin pxi ile değiştirilmiş olmasıdır.

Bu nedenle, çevreleyen cam bölgeler de dahil olmak üzere tüm elektrotlar pxi ile modifiye edilir. Voltajı ITO'nun bulunduğu her yere uyguladığımda, ki bunlar bizim yaptığımız elektrot tasarımlarıdır, peg adası sadece bu yüzeylerden çıkacak ve çevre bölgelerde hiçbir şey etkilenmeyecek. Bu nedenle, peg adasını alt tabakamızdan seçici olarak çıkarıyoruz.

Şimdi oynat düğmesine basacağım ve bu başlayacak ve çalışma elektrodumuza negatif 1.4 voltluk bir voltaj uygulayacak. Voltaj uygulandığında, elektrotlarda görebileceğiniz renkte bir değişiklik olur. Sahip olduğumuz şeffaf yeşilimsi mavi renkten kahverengiye dönüşür.

Elektrotlarda meydana gelebilecek ve kahverengiye dönmelerine neden olabilecek bir oksidasyon reaksiyonu olabileceğinden şüpheleniyoruz. Bu aynı zamanda yüzeyden pxi'nin gerçekten yüzeyden sıyrıldığının göstergelerinden biridir. Ve bir kez daha, nerede kahverengi görürseniz, Peg Adası'nın kaldırıldığı yer burasıdır.

Ve çevredeki cam bölgelerin üzerinde hala PXI var. Bu yüzden 60 saniye boyunca negatif 1.4 watt'lık bir voltaj uyguluyoruz. Bu, elektrotlarda bulunan tüm pxi'yi çıkarmak için yeterli zaman verir.

Bu yöntemi, ayrı ayrı ele alınan elektrotları soymak için de kullanabiliriz. Bu durumda, sıyrılacak üç sıra daire vardı. Üç farklı elektrotu da kullanarak neyi, hangilerini soymak istediğimizi seçebiliriz.

Şimdi, ITO elektrotlarımızdan PG silingini seçici olarak çıkardığımız elektrokimyanın üçüncü bölümünü başarıyla tamamladık. Kısa bir süre yıkadım, PBS ve DI suyla yıkadım, teli çıkardım ve numuneleri sadece normal altı kuyucuklu plakaya yerleştirdim. Şimdi bu elektrotlar üzerinde hücreleri kültüre alacağız.

İşte şimdi burada doku kültürü odasındayız. Deneyin son aşaması için, bugün fibroblastları kullanacağız, üç T üç hücreli. Hücreleri tohumlamak için kullandığımız konsantrasyon, mil başına 0,5 ila 1,5 milyon hücre arasındadır.

Hücreleri tohumladıktan sonra, hücreleri yaklaşık 20 dakika boyunca numunemize bıraktık. Bu, onu soyulmuş bölgelere tutturmak için yeterli zaman tanıyacaktır. Bu yüzden onu kuluçka makinesine yerleştireceğiz.

Şimdi 20 dakika oldu ve ITO'nun soyulmuş bölgelerinde, daha önce gördüğümüz kahverengi bölgelerde desenlenmiş hücrelere bakmaya hazırız ve bunlar sadece bu bölgelere özel olarak bağlanacaklar ve bu bölgelerin dışında hiçbir yere bağlanmayacaklar. Burada kahverengi bölgelerin pxi'den arındırılmış ITO bölgeleri olduğunu görebilirsiniz. Elektrokimya kullanılarak, hücreler sadece bu kahverengi bölgelere bağlanmış ve çevredeki cam bölgelere bağlanmamıştır.

Bu diğer karede, bir kez daha, seltz'in soyulmuş bölgelere yapıştığını görüyoruz. Bunlar kahverengi bölgelerdir, ancak bu kahverengi bölgelerin üzerinde zar zor görebilirsiniz ve ITO tasarımı PEG, bu ITO tasarımından çıkarılmamıştır, dolayısıyla ona bağlı hiçbir hücre yoktur. Tamam, bu kadar.

Protokolle işimiz bitti ve hücrelerin ITO elektrotlarında deseni var ve tam olarak istediğimiz şey buydu. Az önce size mikro fabrikasyon optik olarak şeffaf indiyum 10 oksit elektrotlar üzerindeki hücre yapışmasının kontrolünü gösterdim. Bugün size bu elektrotlar üzerinde THREET üç fibroblastı nasıl modelleyeceğinizi gösterdim.

Aynı prosedürü Hep G iki hücresini, uydu hücrelerini ve sıçan birincil hücrelerini modellemek için de kullandık. Mevcut hücre modelleme teknikleri, yüzeyde yalnızca iki hücre tipinin birleştirilmesine izin verir. Bu tekniğin esnekliği, gelecekte mekansal olarak izole edilen yüzeyde birden fazla hücre tipinin montajına izin verecektir.

Bu tekniği, in vivo mikroçevreyi taklit etmek için ITO substratı üzerinde üç farklı karaciğer hücresi tipini mekansal olarak izole etmek için kullanmayı planlıyoruz. Bunu yaparak, olgunlaşmamış hücreleri veya kök hücreleri olgun hücreler ve destekleyici hücrelerle birlikte mekansal olarak izole edebiliriz. Bu, olgunlaşmamış hücrelerin büyümesi ve farklılaşması için öğretici bir ortam yaratacaktır.