Optik Şeffaf indiyum kalay oksit Elektrotlar Desenlendirme Hücreler

Merhaba, ben Isha. Dr. Zen'in laboratuvarında ikinci yıl yüksek lisans öğrencisiyim. University of California Davis'teki Biyomedikal Mühendisliği Bölümü'ndeyiz.

Bugün size, doku mühendisliği ve rejenerasyon çalışmalarında organın mikroçevresini taklit etmek amacıyla mikro-fabrikasyonla üretilmiş optik olarak şeffaf İndiyum 10 oksit elektrotlar üzerinde iyon kontrolünü göstereceğim. Bu mikroçevrenin in vitro ortamda oluşturulabilmesi için, hücrelerin bir substrat üzerinde mekansal ve zamansal olarak izole edilmesi esastır. Bizler, farklı karaciğer hücresi tiplerinin konumlarını kontrol edebileceğimiz yüzeyler tasarlamakla ilgileniyoruz.

Bugünkü deneyde, hücre yapışmaz durumdan hücre yapışır duruma geçirilebilen bir yüzey oluşturmak için yüzey modifikasyonu, mikrofabrikasyon ve elektrokimya yöntemlerini kullanacağız. İlk adım fotolitografidir. Bu sürecin nasıl işleyeceğine dair akış şeması aşağıdadır.

Mavi olan cam ışık, yeşil olan ise cam ışığın üzerine kaplanmış olan indium 10 oksittir. İlk olarak, burada gösterilen fotoresist kırmızısını, indium 10 oksit kaplı cam ışığın üzerine spin kaplama yöntemiyle uygulayacağız. Ardından, bunu bir fotomaske aracılığıyla ultraviyole ışığa maruz bırakacağız ve maruz kalan bölgeler bir geliştirme çözeltisinde geliştirilecektir.

Fotoresist ile korunmayan ITO bölgeleri, ITO aşındırma işlemiyle uzaklaştırılacaktır. Ve son olarak, ITO elektrotlarımızı oluşturmak için kalan tüm fotoresist aseton ile temizlenecektir. Kalan üç adımın akış diyagramı burada yer almaktadır.

Öncelikle, tüm yüzeyi peg silan ile modifiye edeceğiz. Bu işlem yüzeyin kirlenmesini önleyecek ve böylece hiçbir hücre veya protein yüzeye bağlanmayacaktır. Ardından, daha önce hazırladığımız iki elektrottan spesifik olarak peg silan absorbe etmek için elektrokimya yöntemini kullanacağız.

Ve son olarak, fibroblastları yüzeyin üzerine inkübe edeceğiz ve bunlar seçici olarak sadece şerit bölgelerine bağlanacaklar. Böylece artık deneyimize başlamaya hazırız. İlk adım, temiz oda içerisinde gerçekleştirilecek olan fotolitografiyi içermektedir.

Şimdi temiz odaya geçelim. Şu an temiz odadayız. Deneyimize başlamadan önce, indyum kalay oksit veya ITO kaplı numunelerimizi fırında 200 °C'de pişireceğiz.

Bu sayede tüm yüzeylerimizi susuzlaştırabiliriz. 200 °C'de pişirdikten sonra, örneği spin tech cihazına yerleştirip fotoresist uygulayacağız. ITO substratımızı susuzlaştırdıktan sonra, onu alıp spin tech cihazının tutucusuna yerleştireceğiz.

Bu mandren, cam bir ışık kaynağının dörtte birini tutacak kadar büyüktür. Ardından vakum uygulayacağız. Sonrasında, substrat üzerine pozitif tonlu fotoresist uyguluyoruz.

Fotoresist uygulaması tamamlandıktan sonra işleme başlayabiliriz. Bu işlem iki adımdan oluşur. Birincisi yayma, ikincisi ise yayma adımındaki spin kaplamadır.

Mandren 800 RPM hızda dönerek fotoresistin tüm yüzeye homojen bir şekilde yayılmasını sağlar. Ardından gelen spin adımı ise 4.000 RPM hızda gerçekleşir ve bu hızda oldukça ince bir tabaka oluşur. İnce derken, yaklaşık bir mikronluk bir tabakayı kastediyorum.

Photoresist kelimesini ayrıştırdığınızda, "photo" (foto) ve "resist" (direnç/dayanım) şeklinde ayrılır. Işıkla aktive olur. Bu nedenle, fotorezistimizin ışıkla aktive olmaması için temiz odada çalışır ve filtrelenmiş ışık kullanırız; ayrıca aşındırma işlemi sırasında faydalanacağımız bir özellik olarak asitlere karşı dayanıklıdır.

Spin kaplama işlemini tamamladık, yüzeyde fotoresist mevcut; şimdi örneği çıkarıp bir sonraki adımımıza geçeceğiz. Numuneyi bir dakika 45 saniye boyunca fırınladıktan sonra, ısıtıcı plakadan alıp maske hizalayıcıya taşıyoruz. Burada ihtiyacımız olan maskeyi alıyoruz ve fotoresist kaplı substrat ile maske arasında temas baskı sağlamak amacıyla maskeyi substratın üzerine yerleştiriyoruz; üzerine ağırlık eklemek için dört inçlik bir cam wafer yerleştiriyoruz.

Bu işlemi tamamladıktan sonra, kepengi tekrar kapatıyoruz ve ardından örneği UV ışığına maruz bırakıyoruz. Pozlama tamamlandığında, kapağı ters sırayla uzaklaştırıyoruz. Cam gofretimizi ve maskemizi çıkarıyoruz, ardından substratımızı alarak geliştirme işlemi için götürüyoruz.

Numuneyi pozladıktan sonra, onu bir geliştirici çözeltiye yerleştiririz. Numune UV ışığına maruz kaldığında, baz ve geliştirici çözelti ile nötralize edilen ve aslında yüzeyden uzaklaştırılan hidrojen iyonları oluşmuştur. Bu nedenle, numuneyi işlerken altlığı sürekli olarak salladığınızdan emin olmalısınız.

Bunu yaptığınızda, yaklaşık ilk bir veya bir buçuk dakika içinde, maruz kalan bölgelerin aslında geliştiğini ve yüzeyden uzaklaştırıldığını görebilirsiniz. Ancak tam bir gelişim gerçekleşmesi için örneği geliştirici solüsyon içerisinde yaklaşık beş dakika bekletiyoruz. Geliştirme işlemi tamamlandıktan sonra, örneği dışarı çıkaracağız, DI su ile yıkayacağız ve ardından bir nitrojen tabancası kullanarak kurutacağız.

Numunemizi kuruttuktan sonra, mikroskobumuz altında görselleştirmek üzere götüreceğiz. Burada numuneyi mikroskop altında inceliyoruz. Beş dakika boyunca geliştirdikten sonra numuneyi yeni çıkardık.

Burada görebileceğiniz iki bölge bulunmaktadır: fotoresist ile kaplanmış daha koyu bir bölge ve fotoresistin uzaklaştırıldığı daha açık renkli bölge. Daha önce kullandığımız maske ile karşılaştırıldığında, maske üzerindeki koyu bölgeler şu an mikroskop altında gördüğümüz koyu bölgelere, buradaki açık renkli bölgeler ise maske üzerindeki şeffaf bölgelere karşılık gelmektedir. Burada gösterilen tasarımlardan biri 500'den 50 mikrona kadar inen farklı boyutlardaki dizilerken, diğer tasarım ise birbirine bağlı olan 1000 mikronluk dairelerdir.

Burada, aynı prosedür kullanılarak yapılmış farklı bir tasarımımız var. Burada, bireysel olarak adreslenebilir elektrotlar bulunmaktadır. Bununla kastettiğim, ITO'nun farklı bölgelerinin birbirine bağlı olduğu ve farklı şekilde aktive edilebildikleridir.

Örneğin burada, merkezdeki dairesel bölgeler buradaki bir elektrik pedine bağlıyken, en dıştaki dikdörtgen bölgeler farklı bir elektrik pedine bağlıdır. Bu sayede bu iki farklı yüzeyi farklı zaman noktalarında uyarabiliriz. Örneklerimize baktıktan sonra geçtiğimiz bir sonraki adım, örneği aşındırmaktır.

Fotoğraflar tarafından korunmayan bölgeler, bir ITO aşındırma işlemiyle aşındırılacaktır. Bunu yapmadan önce, ITO aşındırma işlemi asit içerdiğinden uygun kıyafetler giydiğimizden emin olmalıyız. Şimdi, asit koruyucu önlüğümü giyip yüz siperliğimi taktıktan sonra, cam bir behere biraz ITO aşındırıcı dökeceğim.

ITO aşındırma çözeltisi %20 hidroklorik asit, %5 nitrik asit ve geri kalanı DI sudan oluşmaktadır. Ardından numunemi getirip aşındırma çözeltisinin içine yerleştiriyorum. Daha önce mikroskop altında, fotorezist ile korunmayan bazı bölgeler olduğunu görmüştük.

ITO aşındırma işlemindeki asitler bu bölgelere etki ederek, söz konusu bölgelerdeki ITO'nun aşınmasını sağlamıştır. ITO yüzeyden yavaşça aşındıkça rengi değişir. Burada, başlangıçtaki mavimsi rengin morumsu bir renge dönüştüğünü ve şimdi de sarı renge doğru ilerlediğini görebilirsiniz.

Renk değişimi, ITO'nun aşındırıldığını gösterir. Şu an 15. dakikadayız. Tüm ITO tamamen aşındırılmış durumda.

Şu an gördüğünüz fotoğraflar, korumalı ITO bölgeleridir. Aşındırma işlemi tamamlandıktan sonra, yüzeyde hâlâ bazı asitler kalmaktadır. Bu asitleri gidermek için, tüm asidi nötralize edecek olan bir sodyum karbonat çözeltisine yerleştireceğiz.

Asitleri nötralize ettikten sonra, numuneyi çıkaracağız, DI su ile temizleyecek ve ardından nitrojen ile kurutacağız. Böylece asit aşındırma işlemini tamamlamış oluyoruz. Artık asit kalmadığına göre, koruyucu önlüğümü çıkarabilirim.

Numuneyi dışarı çıkarıp aktaracağız ve mikroskobumuz altında görüntüleyeceğiz. Şu anda numuneyi mikroskop altında gözlemliyoruz. Bu görüntü, ITO aşındırma işlemini gerçekleştirdikten sonrasıdır.

Bu durumda, daha koyu bölgeler ITO'nun aşındırıldığı cam bölgelerdir. Daha açık bölgeler ise bu durumda fotorezist ile korunan ITO bölgeleridir. Tekrar belirtmek gerekirse, bunlar 500 ile 50 mikron arasındaki dizilerdir ve diğer durumda ise her biri bin mikron olan birbirine bağlı dairelerimiz bulunmaktadır.

Mikroskop altında yaptığımız incelemede cam bölgeler ve ITO bölgeleri olduğunu, ancak ITO bölgelerinin fotoresist ile korunduğunu gördük. Şimdi bu fotoresist tabakasını temizlememiz gerekiyor. Bunun için substratı alıp asetona koyacağız ve ardından sonikatöre yerleştirerek 10 dakika boyunca sonikasyon uygulayacağız.

Bu işlem, tüm fotoresist tabakasının uzaklaştırılmasını sağlar; bunu tek başına tonlama yöntemiyle yapabilirsiniz ancak ses dalgalarının etkisini kullanan sonik temizleme yöntemi, fotoresistin doğru şekilde temizlendiğinden emin olunmasını sağlar. Sonik temizlemeden çıkardıktan sonra, DI su ile yıkanır, tekrar azot ile kurutulur ve artık cam alt katman üzerindeki desenleri net bir şekilde görebilirsiniz. Bunlar, başlangıçta fotoresist tarafından korunan desenlerdi.

Numunelerimizi incelediğimize ve ITO desenlerimizi bulduğumuza veya oluşturduğumuza göre, deneyin ikinci aşamasına başlayacağız. Bu aşama, yüzeyin bir PEG siklin kendi kendine düzenlenen tek tabakası ile modifikasyonunu içerir. Ancak bunu yapmadan önce, yüzeyin reaktif olduğundan emin olmalıyız.

Bunu yapmak için örneği bir plazma temizleyiciye yerleştiriyoruz. Bu işlem yüzeyde hidroksil grupları oluşturarak yüzeyi reaktif hale getirir. Bunun için örneğimizi plazma temizleyicinin içine yerleştirip ardından vakum pompasını çalıştırıyoruz.

Oksijeni açıyoruz, ardından ana gücü devreye alıyoruz. Bu güç, oksijen gazını plazmaya dönüştürmek için kullanılır; plazma daha sonra içeri verilerek hidroksil oluklarının oluşmasını sağlar. Gücü açtıktan sonra, başlat düğmesine basıyoruz.

İşlem tamamlandıktan sonra substratı dışarı çıkarıp bir kapta saklıyoruz, temiz oda kıyafetlerini çıkarıp dışarı çıkıyor ve bir sonraki adıma geçiyoruz. Temiz odadan çıktığımıza ve ideal desenleme işlemini bitirdiğimize göre, az önce desenlediğimiz yüzeyi polietilen glikol silan veya PEG silan ile modifiye edeceğiz. PEG silanın neme karşı reaktif olduğunu bilmek kritik önem taşır.

Bu nedenle, kullandığımız her şeyin nemsiz olması gerekir. Burada kullandığımız cam malzemeler, yani petri kapları, yüz derece C'de gece boyunca fırınlanmıştır. Solvent olarak kullanacağımız toluen de anhidrittir.

Nem içermez. Bu yüzden şimdi, biri örneğimizi içeren her iki cam behere de anhidrat tolu dökeceğim. Modifikasyonu birinde gerçekleştireceğimiz için iki adet petri kabı kullanmamız gerekiyor.

Ve diğerini, modifikasyon tamamlandığında substratımızı yıkamak için daha sonra kullanacağız. Cam pizza tabaklarına yerleştirdikten sonra, bunları alıp eldiven kutusundaki hava kilidi odasına aktaracağım. Hava kilidi odasını kapattıktan sonra, odaya azot vereceğiz.

Şu an buradaki ana hazne zaten azotla doldurulmuş durumda. Bu nedenle, azotla doldurulmadığı sürece bu hazneyi açmak istemiyoruz. Her iki hazne de azotla dolduğunda, tüm örneklerimizi bir pipet yardımıyla aktaracağız.

Daha sonra örnekleri aktarmak için kullanacağımız bir tutucu ve bir cımbızımız olacak. Öyleyse eldivenlerimizi giyeceğiz, buradaki bölmeyi açacağız ve hava kilidinde bulunan her şeyi yavaşça ve dikkatlice çıkarıp ana bölmeye yerleştireceğiz. Bunlar, substratımızın bulunduğu Petri kabı ve yıkama için kullanacağımız sadece toluen içeren Petri kabıdır.

Mevcut olan pxi azot altında paketlenmiştir ve bu şişeyi azot ortamında olmadığınız sürece açmamalısınız. Bu nedenle, örneği çıkarmak istediğinizde, onu tekrar torbaya yerleştirin. Silindirinizi çıkarın; kullanacağımız konsantrasyon toluen içerisinde %2'dir.

Ardından dışarı çıkarıp yüksek tüpe koyun ve karıştırın. Ayrıca hazne içinde iyice karıştığından emin olun ve ardından numunenin Toin içinde iki saat inkübe edilmesini sağlayın. İki saatlik süre dolduğuna ve numunemiz Pxi içinde kaldığına göre, numuneyi dışarı çıkarıp kısa bir yıkama işlemi için çalkalayacağımız taze bir toin çözeltisine aktaracağız ve sonrasında hava kilidi haznesine taşıyacağız.

Hava kilidi haznesine girdikten sonra, hazneyi açıp modifiye edilmiş yüzeyimizi dışarı çıkaracağız ve azot tabancasıyla taşıyabileceğiz. Yüzeyi tekrar temiz, kuru bir Petri kabına yerleştiriyoruz ve ardından yüz derece C'lik bir fırında iki saat daha bekletiyoruz. Örnekler fırında yüz C'de iki saat boyunca pişirildikten sonra, hazırladığımız elektrotlara kabloları bağlayacağız.

Bunu, gümüş epoksi ve bir sertleştiriciden oluşan bir bire bir karışım hazırlayarak yapıyoruz. İşte gümüş epoksi; şimdi içerisine aynı miktarda sertleştirici ekliyoruz. Karışımı iyice karıştırmalıyız, ardından bunu kablolarımızı sabitlemek için kullanacağız.

Teli kullanmak istediğimiz elektrotların üzerine yerleştiriyoruz ve ardından sabitliyoruz. Lehimleme ITO üzerinde çalışmadığından, gümüş epoksi ve kürleme ajanı kullanmamız gerekiyor. Daha sonra, daha önce kullandığımız tüm kürleme ajanının uzaklaşması ve yapının sertleşerek bir elektrot olarak kullanılabilecek hale gelmesi için pişirme işlemi uyguluyoruz.

İki aşamayı tamamladığımıza göre, deneyin elektrokimya kısmının gerçekleştirileceği üçüncü aşamaya başlayacağız. Bunu yapmak için bir numune alıp elektrokimyasal hücremize yerleştireceğiz. Numuneyi elektrokimyasal hücremize yerleştirdikten sonra, üzerine bir O-ring yerleştireceğiz.

Bu işlem, elektrokimyanın gerçekleşeceği bölgeyi izole edecek ve ardından hücreyi mühürleyeceğiz. Telini bağladığım numuneyi elektrokimyasal hücreye yerleştirdim. Artık voltaj uygulamak için potansiyostatı kullanmaya hazırım.

Beyaz kabloyu buradaki referans elektroda, kırmızı olanı karşı elektroda ve son olarak yeşil olanı çalışma elektrodumuza bağlayacağım. Tüm bu elektrotlar bağlandıktan sonra, elektrokimyasal hücrenin içine 1x fosfat tamponlu tuzlu su veya PBS çözeltisi ekleyeceğim. Bunu açıklığa kavuşturmak gerekirse, şu anki haliyle tüm yüzey pxi ile modifiye edilmiştir.

Böylece, çevreleyen cam bölgeler de dahil olmak üzere tüm elektrotlar pxi ile modifiye edilir. Voltajı her yere uyguladığımda, ITO'nun bulunduğu yerlerde (hazırladığımız elektrot tasarımları), peg adacığı yalnızca bu yüzeylerden ayrılacak ve çevre bölgelerde hiçbir şey etkilenmeyecektir. Böylece, substratımızdan peg adacığını seçici olarak uzaklaştırmış oluruz.

Şimdi oynat düğmesine basacağım ve bu işlem, çalışma elektrodumuza -1,4 voltluk bir gerilim uygulamaya başlayacak. Gerilim uygulandığında, elektrotlarda görebileceğiniz bir renk değişimi meydana gelir. Renk, başlangıçtaki şeffaf yeşilimsi mavi tondan kahverengiye döner.

Elektrotların kahverengiye dönmesine neden olan bir oksidasyon reaksiyonunun gerçekleşmiş olabileceğinden şüpheleniyoruz. Bu aynı zamanda, yüzeydeki pxi'nin gerçekten yüzeyden sıyrıldığının göstergelerinden biridir. Ve tekrar belirtmek gerekirse, kahverengi gördüğünüz her yer, peg adacığının kaldırıldığı yerdir.

Çevredeki cam bölgelerde hâlâ birikmiş PXI bulunmaktadır. Bu nedenle, 60 saniye boyunca -1.4 V gerilim uyguluyoruz. Bu işlem, elektrotlar üzerinde bulunan tüm PXI'lerin uzaklaştırılması için yeterli süreyi sağlar.

Bu yöntemi, tek tek adreslenen elektrotları sıyırmak için de kullanabiliriz. Bu durumda, sıyırılacak üç sıra daire bulunuyordu. Üç farklı elektrodun tamamını kullanarak hangi elektrotların sıyırılacağını seçebiliriz.

Böylece, ITO elektrotlarımızdan PG silan kaplamasını seçici olarak kaldırdığımız elektrokimyanın üçüncü bölümünü başarıyla tamamladık. Elektrotları kısaca PBS ve DI su ile yıkadım, teli çıkardım ve örnekleri standart altı kuyucuklu plakalara yerleştirdim. Şimdi bir sonraki aşamaya geçip bu elektrotlar üzerinde hücre kültürü yapacağız.

Şu anda doku kültürü odasındayız. Deneyin son aşaması için bugün fibroblastlar, yani 3T3 hücreleri kullanacağız. Hücreleri ekmek için kullandığımız konsantrasyon, mL başına 0.5 ile 1.5 milyon hücre arasındadır.

Hücre ekiminden sonra, hücrelerin örneğimiz üzerinde yaklaşık 20 dakika kalmasını sağlıyoruz. Bu, hücrelerin soyulmuş bölgelere tutunması için yeterli süre sağlayacaktır. Bu nedenle örneği inkübatöre yerleştiriyoruz.

Şimdi 20 dakika geçti ve ITO'nun sıyrılmış bölgelerinde, daha önce gördüğümüz kahverengi bölgelerde desenleşmiş hücrelere bakmaya hazırız; hücreler yalnızca bu bölgelere spesifik olarak bağlanacak ve bu bölgelerin dışındaki hiçbir yere tutunmayacaktır. Burada, kahverengi bölgelerin pxi'den sıyrılmış ITO bölgeleri olduğunu görebilirsiniz. Elektrokimya kullanılarak, hücreler yalnızca bu kahverengi bölgelere tutunmuş, çevreleyen cam bölgelere ise tutunmamıştır.

Bu diğer karede, bir kez daha, hücrelerin sıyrılmış bölgelere tutunduğunu görüyoruz. Bunlar kahverengi bölgelerdir; ancak bu kahverengi bölgelerin üzerinde, ITO tasarımındaki PEG'in sıyrılmadığını ve bu nedenle buraya hiçbir hücrenin tutunmadığını zar zor görebilirsiniz. Tamam, işte bu kadar.

Protokolü tamamladık ve hücreler ITO elektrotlar üzerinde desen oluşturdu; tam olarak istediğimiz buydu. Size, mikro üretimli optik olarak şeffaf indiyum 10 oksit elektrotlar üzerinde hücre adezyonunun nasıl kontrol edildiğini göstermiş oldum. Bugün, bu elektrotlar üzerine nasıl üç fibroblast deseni oluşturulacağını gösterdim.

Aynı prosedürü Hep G iki hücreleri, uydu hücreler ve sıçan primer hücrelerini desenlemek için de kullandık. Mevcut hücre desenleme teknikleri, yüzeyde yalnızca iki hücre tipinin birleştirilmesine izin vermektedir. Bu tekniğin esnekliği, gelecekte yüzeyde uzaysal olarak izole edilmiş birden fazla hücre tipinin birleştirilmesine olanak sağlayacaktır.

In vivo mikroçevreyi taklit etmek amacıyla, bu tekniği kullanarak ITO substratı üzerinde üç farklı karaciğer hücre tipini mekansal olarak izole etmeyi planlıyoruz. Bunu yaparak, olgun hücreler ve destek hücrelerinin yanı sıra immatür hücreleri veya kök hücreleri mekansal olarak izole edebiliriz. Bu durum, immatür hücrelerin büyümesi ve farklılaşması için yönlendirici bir ortam oluşturacaktır.