Rezonans ve spontan Raman Microspectroscopy Floresan Arkaplan reddi

Biz ultrafast tüm optik anahtarlama floresan sinyallerine karşı Raman izole etmek için kullanan bir karmaşık doğrusal olmayan optik sistem inşası ve işletilmesi tartışacağız. Bu sistemi kullanarak, başarılı bir darbe enerjileri ve biyolojik olarak güvenli kalır ortalama yetkileri kullanan, Raman ve floresan sinyalleri ayrı edebiliyoruz.

Bu prosedürün amacı, floresan sinyallerini reddederken Raman saçılan ışığı geçiren tamamen optik bir yürüyüş oluşturmaktır. Bu, önce Raman saçılımını heyecanlandırarak ve polarize ederek gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, kapıyı çalıştırmak için pompa ışınını hazırlamaktır.

Üçüncüsü, pompa ve şahmerdan ve darbeler üst üste gelecek şekilde ayarlanmalıdır. Prosedürün son adımı, zaman kapılı spektrumlar elde etmektir. Sonuç olarak, yüksek sinyal-gürültü oranlarına sahip ramen sinyallerinin analizi yoluyla biyokimyasal niceleme ve sınıflandırmayı gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin, floresan arka planının yazılımla kaldırılması gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, floresan tarafından üretilen çekim gürültüsünün önemli ölçüde azaltılmasıdır. Bu yöntem, bakteri hücrelerinde ve dokularında endojen florun kimyasal bileşiminin invaziv olmayan karakterizasyonu, içsel belirteçler kullanarak hücresel süreçleri ve kanser, vasküler veya nörodejeneratif hastalıklar gibi hastalıkları anlama gibi biyolojik ve biyomedikal alanlardaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem aynı zamanda hem floresan hem de RAM etiketleri olarak ve ayrıca kan analizi için invaziv olmayan tıbbi sensörler için kullanılabilecek yeni probların geliştirilmesine de yardımcı olabilir.

Bu yöntem, biyomedikal mühendisliği için biyolojik sistemler hakkında bilgi sağlayabilir. Biyoyakıt, araştırma veya telekom endüstrisi gibi diğer alanlara da uygulanabilir. Biyolojik numuneler tipik olarak bir ATO Fluor hücre odasına monte edilmiş bir numaralı kalınlıkta bir kapak kızağı üzerine yerleştirilir.

Sıvı numuneler, özellikle insanlar için toksik olanlar, silikon epoksi vasıtasıyla açıklığa yapıştırılmış bir kapak kızağı ile küçük bir cam şişeye yerleştirilir, daha sonra ölçüm için ters çevrilir, numuneleri mikroskop tablasının üstüne monte edilen ikincil tablaya yerleştirin Zaman kapılı ramen spektrumları almak için kendi bağımsız odak kontrolüne sahip olan mikroskop aşaması, İlk olarak, uyarma ışını uygun şekilde hazırlanmalıdır. 2,4 watt ayarlanabilir darbeli GI safir lazerden çıkan ışıkla başlayın. 80 megahertz darbe dizisindeki her darbe, 30 nano jul enerjiye, 140 femtosaniyelik bir zamansal genişliğe ve yaklaşık altı nanometrelik bir spektral bant genişliğine sahip 808 nanometre merkezli bir spektruma sahip olmalıdır. sistem.

Altı nanometre, çoğu ramen modunu çözmek için çok geniş bir bant genişliği olduğundan, ışın çok dar bir bant geçiren filtreden gönderilir. 808 nanometrede gönderin. Ardından, ışığı beş milimetrelik bir beta baryum deliğine odaklamak için aromatik bir çift kullanın.

808 nanometreden 404 nanometreye kadar dalga boyunun yarısına kadar sekiz kristal. Beta baryum bate kristalini, bir çeviri aşamasına monte edilmiş uç ve eğim kontrollerine sahip bir yuvaya yerleştirin. Dalga boyu dönüşümünün verimliliğini en üst düzeye çıkarmak için, kristal, çiftin odağı etrafında tam olarak simetrik olarak ve kristal ekseni gelen ışının polarizasyonuna hizalanmış olarak yerleştirilmelidir.

Dalga boyu dönüşümünün verimliliği polarizasyona bağlı olduğundan, numuneye gönderilen ışık miktarı üzerinde kontrol, faraday izolatöründen sonra ikinci bir yarım dalga plakası yerleştirilerek elde edilebilir. Bu dalga plakasını döndürerek, numuneye gönderilen ışığın yoğunluğu, pompa ışınında gönderilen yoğunluktan bağımsız olarak ayarlanabilir. Dalga boyuna dönüştürülen ışık daha sonra, heyecan verici ışın mikroskop objektifinin arka açıklığını dolduracak kadar büyük olacak şekilde seçilen ikinci bir aromatik çift ile yeniden toplanır ve iki direksiyon aynası vasıtasıyla ters çevrilmiş bir mikroskoba yönlendirilir.

Mikroskop objektifi, uyarma ışınını bu eksene hizalamak için optik ekseni tanımlar. Mikroskobun örnek düzlemine bir ayna yerleştirin. İki direksiyon aynası daha sonra, mikroskobun görüntüleme portuna bağlı bir CCD kamerada arkadan yansıyan lazer ışınını gözlemlerken yinelemeli olarak ayarlanır.

Kameradaki görüntünün mikroskobun görüş alanı üzerinde ortalandığını varsayarsak, ışın eksen üzerindedir. Odak noktası mikroskop çipi üzerinde ortalandığında ve objektifin Z ekseni boyunca ötelenmesi değişmez. Odak dışı ışın ramen saçılmasının merkez noktası, numune numune düzlemine yerleştirildiğinde ve lazer ışığı ile ışınlandığında meydana gelir.

Mikroskop objektifinin altına yerleştirilen bir dikroik filtre, kaydırılan dalgayı ayırır. Ramen, uyarma ışınından saçılan ışığı, ramen saçılan ışığı mikroskobun yan portuna yönlendirir. Mikroskop, bu yol içindeki herhangi bir merceği çıkarmak için modifiye edilmiştir, öyle ki, mikroskoptan çıkan sinyal ışını bezin net açıklığından daha büyük olduğu için sinyal ışığı kaplı mikroskoptan çıkar

Işını küçültmek için iki aromatik çiftten yapılmış 0.47 katlık bir teleskop olan Thompson polarizörleri kullanılır. Sinyal ışığı daha sonra laboratuvar çerçevesindeki dikeye göre sıfır derecede yönlendirilmiş bir Thompson polarizörü ile polarize edilir ve pompa ışını ile yeniden birleştirildiği dikroik bir aynaya yönlendirilir. Pompa ışını, her ikisi de pompanın ve sinyal darbelerinin zamansal örtüşmesini sağlamak için ayarlanabilen doğrusal bir öteleme aşamasına yerleştirilmiş, birbirine dik açılarda iki aynadan oluşan bir gecikme hattına gönderilir.

Gecikme hattından sonra, ışın, laboratuvar çerçevesindeki dikeye göre 45 derece yönlendirilmiş bir yarı plaka ve polarizörden gönderilir. Bu, doğrusal olmayan ortama ulaştığında pompa ışınının uygun polarizasyon durumunu sağlar. Işık daha sonra, biri piezoelektrik kontrollere sahip iki direksiyon aynasından yansıtılır ve son olarak pompa ışınının konumunu sinyal ışını ile uzamsal olarak örtüşecek şekilde ayarlamak için kullanılmalıdır.

Bu örtüşmeyi elde etmek için, pompa ve sinyal huzmelerini, yakın noktadaki iki huzmeyi üst üste bindirmek için birinci direksiyon aynası ve uzak noktadaki kirişleri üst üste bindirmek için pizo aynası kullanılarak kirişlerin birleştirildiği dikroik aynaya yakın ve biri uzak aynadan uzak olmak üzere iki konumda gözlemleyin, pompa ışını sinyal ışınları ile tam olarak aynı hizada yapılabilir. Daha sonra, toplanan zaman kapılı sinyali en üst düzeye çıkarmak için oluklu ve toplama sistemi kurulmalıdır. Bunu yapmak için, pompa ve sinyal ışınları ilk olarak, herhangi bir artık uyarma ışığının doğrusal olmayan ortam içinde heyecanlanmasını ve dağılmasını önlemek için 404 nanometrede altı OD'ye sahip bir diic filtreden geçirilir.

Pompa ve sinyal ışınları daha sonra aromatik bir çift ile doğrusal olmayan malzemeyi, uygun şekilde yüksek doğrusal olmayan indekse ve uygun şekilde kısa zamansal tepkiye sahip herhangi bir doğrusal olmayan malzemeyi içeren bir santimetre yol uzunluğuna kuvars damarına odaklanır. Burada. Bu deneyler için karbon di sülfür kullanıyoruz. Işık daha sonra birinciyle aynı odak uzaklığına sahip ikinci bir çift ile yeniden toplanır.

Işınlar daha sonra dönen bir montaj üzerindeki bir bez Thompson analizöründen ve daha sonra 808 nanometrede 10'luk bir OD'ye sahip olan bir dizi absorpsiyon ve girişim filtresinden geçirilir. Son olarak, sinyal ışığı, fiberin X, Y ve Z'de ötelemeye izin veren bir aşamada monte edildiği 50 mikronluk çok modlu bir optik fibere aromatik bir çift ile odaklanır. analizörü sıfır dereceye ayarlayın ve numune düzlemine bir toluen test numunesi yerleştirin, pompa ve sinyal ışınlarının uygun uzamsal ve zamansal örtüşmesini sağlamak için fiber montajının X, Y ve Z kontrollerini ayarlayarak toplanan Raman sinyalini optimize edin. Mikroskobun örnek düzlemine bir ayna yerleştirin.

Ardından 404 nanometre filtreyi sistemden çıkarın. Analizörü 90 dereceye döndürün, böylece retro yansıyan 404 nanometre ışını, kamerayı doyurmayacak şekilde ayarlanmış yoğunluk ile spektrografa gönderilir. Şimdi pompa ışını kapalıyken, iletilen 404 nanometre sinyalini en aza indirmek için analizörü döndürün.

Ardından pompa ışınını tekrar açın ve 404 nanometre ışığın iletimi artmaya başlayana kadar gecikme aşamasını yavaşça ayarlayın. Daha sonra yinelemeli olarak dönün, gecikme aşaması, piezoelektrik ayna ve sinyali en üst düzeye çıkarmak için fiberin X, y ve Z kontrolleri, çünkü retro yansıyan 404 nanometre ışını ve Raman saçılan ışık sistem boyunca biraz farklı yollar izleyebilir. Numune tablasına toluen gibi güçlü bir Raman Dağıtıcı yerleştirerek, Raman filtresini değiştirerek ve gecikme aşaması pizo elektrikli aynasını ve Raman sinyalini optimize etmek için fiberin X, Y ve Z kontrollerini değiştirerek hizalamayı biraz değiştirerek son ayarlamaları yapın.

Artık sistem spektrumları toplamaya hazır. Bu, öncelikle sistem kusurlarını düzeltmek için birkaç arka plan eğrisinin alınmasını gerektirir. İlk olarak, analizör sıfır dereceye ayarlandığında, uyarma ışını açık ve pompa ışını kapalıdır.

Açılmamış bir spektrum elde edin, ardından analizörü 90 dereceye ayarlayın ve polarizörlerden sızan başıboş ışığı temsil eden bir arka plan spektrumu toplayın. Ardından, analizör 90 derecede kalırken, ramen ışınını kapatın ve pompa ışınını açın. Dikroik filtrelerden sızan pompa ışığı miktarını temsil eden ikinci bir arka plan spektrumu toplayın.

Son olarak, tüm lazerler kapalıyken, kameranın ve elektronik aksamın karanlık akım seviyesini temsil eden temel bir karanlık spektrum toplayın. Son olarak, tüm ışınları açın ve kapılı bir spektrum toplayın. Kapıdan sadece ışığın gerçek spektrumunu elde etmek için, iki arka plan spektrumu ve karanlık spektrum bu kapılı spektrumdan çıkarılmalıdır.

Burada oluklu sistemin şematik bir diyagramını görüyoruz. Pompa ışın yolu düz kırmızı bir çizgi olarak gösterilirken, SHG yolu düz bir lacivert çizgi olarak gösterilir. Ramen ve floresansın örtüştüğü yol yeşil renkle gösterilmiştir.

Floresansın geçici olarak filtrelendiği yol sarı renkle gösterilir. Burada, daldırma yağında çözülmüş kumarinin ham spektrumlarını görüyoruz. Kırmızı eğri, siyah eğri ile açık tutulan kapı ile alınan spektrumu gösterir, minimum iletim için hizalanmış analizör ve uygulanan bir pompa ışını ile alınan spektrumu gösterir.

Mavi eğri, minimum iletim için hizalanmış ve pompa ışını uygulanmamış olarak analizörle alınan spektrumu gösterir ve yeşil eğri, yalnızca pompa ışını uygulandığında alınan spektrumu gösterir. Tüm spektrumlar, 11 noktalı üçüncü dereceden KY gole filtresi ile pürüzsüz olmuştur. Kesikli macenta çizgiler, aşağıdaki grafikte gösterilen spektral bölgeyi gösterir.

Burada, floresan arka plan çıkarılmasından sonra daldırma yağında çözünen kumarin spektrumlarını görüyoruz. Kırmızı eğri, kapının açık tutulduğu spektrumdur ve mavi eğri, kapılı spektrumdur. Kapılı spektrum, yağların tepe özelliği olan kıvrımlı yüksek dalga sayısını açıkça gösterir.

Bu prosedürü denerken, lazerin önce ga'yı sürmek için yeterli darbe enerjisine sahip olması gerektiğini ve sistemin iki darbenin mükemmel uzamsal ve zamansal örtüşmesini gerektirdiğini hatırlamak önemlidir. Bu videoyu izledikten ve ekteki protokolü okuduktan sonra, lazer ışınını bir uyarma ve eğri ışınına nasıl ayıracağınızı iyi anlamış olmalısınız. Bu iki kirişin hem mekansal hem de zamansal olarak nasıl üst üste bindirileceği.

Spektrograf ve C, c, D aracılığıyla bir ramen sinyalinin nasıl kaydedileceği ve ayrıca ramen sinyalinin nasıl görselleştirileceği ve analiz edileceği. Lazerlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü denerken her zaman lazer gözlüğü takmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın. Doğrusal olmayan malzemenin kullanımı ve özel numunenizin kullanımı için ek güvenlik kuralları geçerlidir.