Rezonans ve spontan Raman Microspectroscopy Floresan Arkaplan reddi

Bu prosedürün amacı, floresan sinyallerini reddederken Raman saçılan ışığının geçişine izin veren tamamen optik bir kapı oluşturmaktır. Bu, öncelikle Raman saçılmasının uyarılması ve polarize edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı ise kapıyı çalıştırmak için pompa ışınının hazırlanmasıdır.

Üçüncü olarak, pompa, ram ve darbeler birbiriyle örtüşecek şekilde ayarlanmalıdır. Prosedürün son adımı, zaman kapılı spektrumların elde edilmesidir. Sonuç olarak, yüksek sinyal-gürültü oranlı ramen sinyallerinin analizi yoluyla biyokimyasal nicelikleme ve sınıflandırmayı gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin, floresans arka planının yazılımsal olarak çıkarılması gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, floresans tarafından üretilen shot gürültüsünün önemli ölçüde azaltılmasıdır. Bu yöntem; bakteri hücreleri ve dokulardaki endojen florların kimyasal bileşiminin invaziv olmayan karakterizasyonu, intrinsik markerların kullanılmasıyla hücresel süreçlerin ve kanser, vasküler veya nörodejeneratif hastalıklar gibi hastalıkların anlaşılması gibi biyolojik ve biyomedikal alanlardaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem ayrıca hem floresans hem de RAM etiketleri olarak kullanılabilecek yeni probların geliştirilmesinin yanı sıra kan analizi için invaziv olmayan tıbbi sensörlerin geliştirilmesine de yardımcı olabilir.

Bu yöntem, biyomedikal mühendisliği için biyolojik sistemlere dair içgörüler sağlayabilse de, aynı zamanda biyoyakıt araştırmaları veya telekomünikasyon endüstrisi gibi diğer alanlara da uygulanabilir. Biyolojik örnekler genellikle bir ATO Fluor hücre odasına monte edilmiş bir numara kalınlığında lamel üzerine yerleştirilir.

Sıvı numuneler, özellikle insan için toksik olanlar, ağzı silikon epoksi ile sabitlenmiş bir lamel bulunan küçük bir cam şişeye yerleştirilir ve ölçüm için ters çevrilir; numuneler, zaman kapılı raman spektrumları alabilmek için kendi bağımsız odak kontrolüne sahip olan mikroskop tablasının üzerine monte edilmiş ikincil tablanın üzerine yerleştirilir. İlk olarak, eksitasyon demeti uygun şekilde hazırlanmalıdır. 2.4 watt ayarlanabilir darbeli GI safir lazerden çıkan ışıkla işleme başlayın. 80 megahertz'lik darbe dizisindeki her bir darbe 30 nano joule enerjiye, 140 femtosaniye zamansal genişliğe ve yaklaşık altı nanometre spektral bant genişliğine sahip, 808 nanometre merkezli bir spektruma sahip olmalıdır. Geri yansımaların lazer boşluğuna tekrar girmesini önlemek için ışık bir Faraday izolatöründen geçirilmelidir; sisteme gönderilen toplam gücün sürekli ayarlanmasına olanak tanımak için Faraday izolatöründen önce bir yarım dalga plakası yerleştirin.

Altı nanometre, çoğu Raman modunu çözümlemek için çok geniş bir bant genişliği olduğundan, ışın çok dar bir bant geçiren filtreden geçirilir. Işını 808 nanometrede gönderin. Ardından, ışığı beş milimetrelik bir beta baryum bor üzerine odaklamak için bir akromatik dublet kullanın.

808 nanometreden 404 nanometreye dalga boyunu yarıya indirmek için bir kristal kullanın. Beta baryum borat kristalini, bir translasyon tablasına monte edilmiş, eğme ve bükme (tip/tilt) kontrollerine sahip bir tutucuya yerleştirin. Dalga boyu dönüşüm verimliliğini maksimize etmek için kristal, dubletin odağına göre tam simetrik olarak yerleştirilmeli ve kristal ekseni gelen ışının polarizasyonu ile hizalanmalıdır.

Dalga boyu dönüşüm verimliliği polarizasyona bağlı olduğu için, faraday izolatöründen sonra ikinci bir yarım dalga plakası yerleştirilerek numuneye gönderilen ışık miktarı kontrol edilebilir. Bu dalga plakasının döndürülmesiyle, numuneye gönderilen ışığın şiddeti, pompa ışınıyla gönderilen şiddetten bağımsız olarak ayarlanabilir. Dalga boyu dönüştürülmüş ışık daha sonra, uyaran ışının mikroskop objektifinin arka açıklığını dolduracak kadar büyük olmasını sağlayacak şekilde seçilmiş ikinci bir akromatik dublet ile yeniden kolime edilir ve iki yönlendirme aynası vasıtasıyla ters bir mikroskoba yönlendirilir.

Mikroskop objektifi, uyarım ışınının bu eksene hizalanması için optik ekseni tanımlar. Mikroskobun numune düzlemine bir ayna yerleştirin. Ardından, mikroskobun görüntüleme portuna bağlı bir CCD kamera üzerinden geri yansıyan lazer ışını gözlemlenirken iki yönlendirme aynası yinelemeli olarak ayarlanır.

Kameradaki görüntünün mikroskobun görüş alanının merkezinde olduğu varsayıldığında, ışın eksen üzerindedir. Odak noktası mikroskop çipinin merkezine geldiğinde ve objektifinin Z ekseni boyunca ötelemesi değişmediğinde. Odak dışı ışının ramen saçılmasının merkez noktası, numune numune düzlemine yerleştirildiğinde ve lazer ışığı ile ışınlandığında meydana gelir.

Mikroskop objektifinin altına yerleştirilen dikroik bir filtre, dalga boyu kaymış Raman saçılan ışığı eksitasyon ışınından ayırarak Raman saçılan ışığı mikroskobun yan portuna yönlendirir. Mikroskop, bu yol üzerindeki tüm lensler kaldırılacak şekilde modifiye edilmiştir; böylece mikroskoptan çıkan sinyal ışını, glandın net açıklığından daha büyük olduğu için mikroskoptan kaplamasız olarak çıkar.

Işını daraltmak için iki aromatik dubletten oluşan 0,47 katlı bir teleskop ve Thompson polarizörler kullanılır. Sinyal ışığı daha sonra, laboratuvar çerçevesinde dikey eksene göre sıfır dereceye yönlendirilmiş bir gland Thompson polarizör tarafından polarize edilir ve pompa ışınıyla yeniden birleştirildiği dikroik aynaya yönlendirilir. Pompa ışını, her ikisi de pompa ve sinyal darbelerinin zamansal örtüşmesini sağlamak için ayarlanabilen lineer bir translasyon tablası üzerine yerleştirilmiş, birbirine dik iki aynadan oluşan bir geciktirme hattına gönderilir.

Geciktirme hattından sonra ışın, laboratuvar çerçevesinde dikey eksene göre 45 derece açıya sahip bir yarım dalga plakası ve polarizatörden geçirilir. Bu işlem, pompa ışınının doğrusal olmayan ortama ulaştığında uygun polarizasyon durumunda olmasını sağlar. Işık daha sonra, biri piezoelektrik kontrollü olmak üzere iki yönlendirme aynasından yansıtılır; piezoelektrik kontrollü ayna, pompa ışınının konumunu, sinyal ışınıyla uzaysal olarak örtüşecek şekilde nihai olarak ayarlamak için kullanılmalıdır.

Bu çakışmayı elde etmek için, pompa ve sinyal ışınlarını, dikroik aynanın yakınında ve uzağında olmak üzere iki noktadan gözlemleyin; ışınlar burada birleştirilir. Yakın noktada iki ışını çakıştırmak için birinci yönlendirme aynasını, uzak noktada ise ışınları çakıştırmak için piezo aynayı kullanarak pompa ışınının sinyal ışınları ile tam olarak aynı eksende olması sağlanabilir. Ardından, toplanan zaman kapılı sinyali maksimize etmek için koruge ve toplama sistemi kurulmalıdır. Bunu yapmak için, pompa ve sinyal ışınları, öncelikle 404 nanometrede OD değeri altı olan bir dikroik filtreden geçirilerek, herhangi bir kalıntı eksitasyon ışığının non-lineer ortam içinde eksitasyon yapması ve saçılması önlenir.

Pompa ve sinyal ışınları daha sonra bir akromatik dublet aracılığıyla, doğrusal olmayan materyalin bulunduğu bir santimetre yol uzunluğuna sahip bir kuvars küvete odaklanır; uygun düzeyde yüksek bir doğrusal olmayan indise ve uygun düzeyde kısa bir zamansal yanıta sahip olan herhangi bir doğrusal olmayan materyal kullanılabilir. Bu deneyler için karbon disülfür kullanılmıştır. Işık daha sonra, odak uzaklığı birincisiyle aynı olan ikinci bir dublet ile yeniden kolime edilir.

Işınlar daha sonra döner bir düzenek üzerindeki Glan-Thompson analizöründen ve ardından 808 nanometrede toplam 10 OD değerine sahip bir dizi absorbsiyon ve girişim filtresinden geçirilir. Son olarak, sinyal ışığı akromatik bir dublet ile 50 mikronluk çok modlu bir optik fibere odaklanır; burada fiber, X, Y ve Z eksenlerinde öteleme yapılmasına olanak tanıyan bir tablaya monte edilmiştir. Daha sonra fiber, toplanan sinyali maksimize etmek için toplama sistemini hizalamak, analizörü sıfır dereceye ayarlamak ve numune düzlemine bir toluen test numunesi yerleştirmek amacıyla, CCD kamera takılı ticari bir görüntüleme spektrografına bağlanır; pompa ve sinyal ışınlarının uygun uzamsal ve zamansal örtüşmesini sağlamak için fiber düzeneğinin X, Y ve Z kontrolleri ayarlanarak toplanan Raman sinyali optimize edilir. Mikroskobun numune düzlemine bir ayna yerleştirin.

Ardından, 404 nanometre filtresini sistemden çıkarın. Geri yansıyan 404 nanometre ışının, kamerayı doyurmayacak şekilde ayarlanmış bir yoğunlukla spektrografa gönderilmesi için analizörü 90 dereceye döndürün. Şimdi, pompa ışını kapalıyken, iletilen 404 nanometre sinyalini minimize etmek için analizörü döndürün.

Ardından pompa ışınını tekrar açın ve 404 nanometre ışığın geçirgenliği artmaya başlayana kadar geciktirme kademesini yavaşça ayarlayın. Daha sonra, geri yansıtılan 404 nanometre ışın ile Raman saçılan ışık sistem içinde hafifçe farklı yollar izleyebileceği için sinyali maksimize etmek amacıyla geciktirme kademesini, piezoelektrik aynayı ve fiberin X, Y ve Z kontrollerini yinelemeli olarak döndürün. Raman sinyalini optimize etmek için örnek tablasına toluen gibi güçlü bir Raman Saçıcı yerleştirerek, Raman filtresini değiştirerek ve geciktirme kademesi piezoelektrik aynası ile fiberin X, Y ve Z kontrollerini değiştirerek hizalamada küçük düzeltmeler yapıp son ayarlamaları gerçekleştirin.

Sistem artık spektrum toplamak için hazırdır. Bu işlem için öncelikle, sistem artefaktlarını düzeltmek amacıyla birkaç arka plan eğrisinin elde edilmesi gerekir. İlk olarak, analizör sıfır dereceye ayarlanmış, eksitasyon ışını açık ve pompa ışını kapalıyken işlem gerçekleştirilir.

Önce kapısız (ungated) bir spektrum elde edin, ardından analizörü 90 dereceye ayarlayın ve polarize edicilerden sızan saçılma ışığını temsil eden bir arka plan spektrumu toplayın. Sonrasında, analizör 90 derecede kalırken ramen ışınını kapatın ve pompa ışınını açın. Dikroik filtrelerden sızan pompa ışığı miktarını temsil eden ikinci bir arka plan spektrumu toplayın.

Son olarak, tüm lazerler kapalıyken, kameranın ve elektroniklerin karanlık akım seviyesini temsil eden bir temel karanlık spektrumu toplayın. Son olarak tüm ışınları açın ve kapılı bir spektrum toplayın. Sadece kapıdan geçen ışığın gerçek spektrumunu elde etmek için, iki arka plan spektrumu ve karanlık spektrum, bu kapılı spektrumdan çıkarılmalıdır.

Burada oluklandırma sisteminin şematik bir diyagramını görüyoruz. Pompa ışını yolu düz kırmızı bir çizgiyle, SHG yolu ise düz lacivert bir çizgiyle gösterilmiştir. Raman ve floresansın üst üste geldiği yol ise yeşil renkle gösterilmiştir.

Floresansın geçici olarak filtrelendiği yol ise sarı ile gösterilmiştir. Burada, imersiyon yağı içerisinde çözünmüş kumarinin ham spektrumlarını görüyoruz. Kırmızı eğri, kapının açık tutulduğu durumda alınan spektrumu; siyah eğri ise analizörün minimum transmisyon için ayarlandığı ve bir pompa ışınının uygulandığı durumda alınan spektrumu göstermektedir.

Mavi eğri, analizörün minimum iletim için hizalandığı ve pompa ışınının uygulanmadığı durumda alınan spektrumu; yeşil eğri ise yalnızca pompa ışını uygulandığında alınan spektrumu göstermektedir. Tüm spektrumlar 11 noktalı üçüncü derece KY gole filtresi ile düzeltilmiştir. Kesikli magenta çizgiler, sonraki grafikte gösterilen spektral bölgeyi belirtmektedir.

Burada, floresan arka plan çıkarımı sonrası imersiyon yağı içinde çözünmüş kumarin spektrumlarını görüyoruz. Kırmızı eğri, kapının açık tutulduğu spektrumu; mavi eğri ise kapılanmış (gated) spektrumu temsil etmektedir. Kapılanmış spektrum, yağlara özgü olan yüksek dalga sayısı pikinin konvolüsyonunu net bir şekilde göstermektedir.

Bu prosedürü uygularken, lazerin öncelikle ga'yı sürmek için yeterli darbe enerjisine sahip olması gerektiğini ve sistemin iki darbenin mükemmel bir uzaysal ve zamansal örtüşmesine ihtiyaç duyduğunu unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten ve ekteki protokolü okuduktan sonra, lazer ışınını bir uyarma ve eğri ışınına nasıl ayıracağınız ile bu iki ışını hem uzaysal hem de zamansal olarak nasıl örtüştüreceğiniz konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Spektrograf ve C, c, D aracılığıyla raman sinyali nasıl kaydedilir ve ayrıca raman sinyali nasıl görselleştirilip analiz edilir. Lazerlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü uygularken lazer gözlüğü takmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın. Doğrusal olmayan materyalin kullanımı ve spesifik örneğinizin kullanımı için ek güvenlik kuralları geçerlidir.