Name: Gut-tropik T Hücre Göç Eğitim Rekabetçi Homing Tahliller (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-01T17:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Öğrenin, bağırsak-tropik ve kontrol T hücrelerinin göç yeteneklerini rekabetçi homing testiyle karşılaştırın. Bu yöntem, farede doku özgü T hücresi göçünü analiz ederek immünoloji araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

EJV Amerika Crohn &amp; Kolit Vakfı (CCFA) bir burs ile desteklenmektedir. JRM CCFA, Kanser Araştırma Enstitüsü (CRI), Howard H. Goodman&#39;ın (MGH), Massachusetts Yaşam Bilimleri Merkezi (MLSC) ve NIH Müdürü Yeni Yenilikçisi Ödülü hibe tarafından desteklenmektedir.

1. gut-homing ve kontrol T hücrelerinin ex vivo nesil (bkz. Şekil 1) <ol><li> Vahşi tip farelerin dalak bir ezme splenositlerin izole edin. 5 '400 x g. hücreler PBS içinde süspansiyon ve santrifüj yeniden süspanse Süpernatantı ve kırmızı kan hücreleri, 2-3 dakika için ACK lizis tamponu 4 ml hücre pelletini resuspending lyse. Bundan sonra, 5 ml PBS ekleyin. 400 xg'de 5 'Santrifüj ve supernatant çıkarın. </li><li> 1 toplam splenositlerin süspanse edin x 10 6 / mL IMDM +% 10 FBS + 50 mM 2-merkaptoetanol + penisilin / streptomisin (tam IMDM). RA (ya da, Am80 ya da Am580 olarak sentetik RAR-agonistleri) 100-200 nM 3 final konsantrasyon ile desteklenmiş bir tanesi iki grup, hücrelerin ayırın . RA varlığı veya RAR-agonistler aktive T hücreleri a4b7and CCR9 upregüle ve RA olmaksızın aktive T hücreleri, T hücreleri kontrol olacak iken, gut-tropik T hücreleri haline gelecektir. </li><li> 1.5-2.0 ml hücre süspansiyonu her bir kuyu için önceden anti-CD3 (10 mg / ml) ve anti-CD28 (10 mg / ml) ile kaplı bir 24 plaka ekleyin ve 37 ° C'de% 5 CO 2 (plaka kaplama için 500 ml / anti-CD3 artı 37 az 2 saat, PBS ve inkübe anti-CD28 eklemek ° C ve daha sonra iki kez 2 ml PBS ile yıkama ). </li><li> T hücre aşırı uyarılma önlemek için, 2-3 gün sonra, yeni bir kaplanmamış 24 plaka içine hücre süspansiyonları transfer. Ek 2-3 gün inkübe edin. Hücre yoğunluğu ve çoğalması bağlı medya taze tam IMDM medyanın yarısını değiştirmek için gerekli olabilir, bu durumda asit (sarı), haline gelebilir. 4-5 gün sonra (gün 0 sayılarak) hücrelerinin Hasat. </li><li> Tipik nihai verim x 10 6 efektör T hücreleri / iyi 1-2. Bu nedenle, her gut-tropik T hücreleri ve kontrol T hücreleri 9-12 kuyuların bir durum başına 10-20 x 10 6 T hücreleri ile sonuna kadar en az kaplama olmalıdır . </li></ol> 2. Gut-homing reseptörleri aktive T hücreleri Analizi Kültür 4-5 gün sonra biz kontrolü T hücreleri, bu reseptörlere 4 çok düşük düzeylerde ifade gerektiğinden, RA veya RAR agonistlerin varlığında aktive T hücreleri üzerindeki gut-homing reseptörleri a4b7and CCR9 yüksek bir ifade dikkat etmelisiniz . Flow sitometri (FACS) analizi. <ol><li> 300 gr az 5 dakika, 0.2-0.5 x10 6 hücre ve santrifüj arasında toplayın 4 ° C </li><li> 15 dakika 4 ° C karanlıkta için anti-CD4-FITC, anti-a4b7-PE (BD Biosciences), anti-CCR9-APC (eBiosciences) ve anti-CD8-PercP ile inkübe edin. </li><li> Inkübasyondan sonra, g 4 ° C 300 5 dakika santrifüj Yıkayın ve tekrar süspansiyon hücreleri tampon boyama ve FACS tarafından analiz. </li></ol> 3. T hücre, KAKE ve CMTMR hücre izci ile etiketleme <ol><li> 37 tüm çözümler tutun ° C başlamadan önce. PBS ile iki kez yıkayın gut-tropik T hücreleri (a4b7 Yüksek CCR9 Yüksek) ve kontrol T hücreleri (a4b7 / Düşük Neg CCR9 / Düşük Neg) serum kaldırmak için . T hücre konsantrasyonu 10-15 PBS içinde x 10 6 / mL ayarlayın. </li><li> Yavaşça girdap ve 20 dakika boyunca inkübe, sırasıyla, 5 mM ve 10 mM nihai konsantrasyonu gut-tropik T ve kontrolü T hücreleri ya KAKE (Carboxyfluorescein succinimidyl ester) veya CMTMR (klorometil benzoil-amino-tetramethylrhodamine) fluorophores ekle 37 ° C T hücre göç fluorophores potansiyel intrensek etkileri ekarte etmek için, aynı ya da ayrı bir deneyde labelings takas etmek için tavsiye edilir. </li><li> Inkübasyondan sonra, oda sıcaklığında 1-5 dakika FBS ve inkübe 1 hacim ile soğutun. Sulandırınız sıcak PBS ile 10 kat ve 300 g az 5 dakika santrifüj PBS ile tekrar süspansiyon ile tam IMDM iki kez yıkayın. </li><li> İdeal olarak, her T nüfusunun 10-20 x 10 6 hücre 1:1 oranında karıştırılır ve daha sonra 5 dakika süreyle 300 xg santrifüj edilmelidir . Son olarak, 200-250 ml sıcak PBS hücrelerin tekrar süspansiyon ve kuyruk damar yoluyla enjekte. </li><li> Tam giriş oranı (1 ideal yakın) hesaplamak için 5-10 ml enjekte edilen hücre süspansiyonu kaydetmek ve seyreltik ve 300 ml PBS ile FACS tarafından analiz. </li></ol> 4. Homing T hücre analizi Fareler çeşitli zaman noktalarında (1 saat sonrası birkaç gün T hücre enjeksiyonu arasında) analiz edilebilmesine rağmen, gut-tropik T hücreleri sahipliği, 12-24 saat sonrası enjeksiyon arasında en iyi belgelenmiştir. Daha uzun zaman noktalarında numaraları / oranları, son hücre gibi T hücre apoptoz ve doku T hücre çıkış olarak etkileyen diğer değişkenlerin potansiyel etkilerini artırabilir. Fareler, hücre ölümünü azaltmak için çeşitli dokulardan ötenazi, hücre süspansiyonları gecikmeksizin izole edilmelidir sonra, nihai verim ve sonuçları etkileyebilir. Ilgi dokular ince bağırsak, kalın barsak, dalak, lenf düğümleri, Peyer Kullanıcı yamaları, karaciğer, akciğer ve kan vardır. Eğeriyi niyetli gut-tropik T hücreleri enjekte T hücreleri, T hücreleri kontrol etmek için karşılaştırıldığında, ince bağırsak mukoza için ortalama 5-10 kat daha iyi (veya üstü) eve gerekir. Ancak, kan ve dalak gibi diğer dokularda, tercihli bir T hücre migrasyonu göstermezler. Bağırsak lamina propria ve intraepitelyal bölmesi lenfositler İzolasyon, daha önce 5 tarif edilmiştir. <ol><li> FACS boyama: Örnekler hücre sayısı 3.0 x 10 6 hücre / ml 'den yüksek bir yoğunlukta, toplanan bağlı olarak yeniden süspanse. Eğer congenic CD45.1 + veya Thy1.1 + fareler alıcıları olarak kullanılan, hücrelerin bazı soy işaretleyici (örneğin, TCRbchain, CD4, CD8 ile birlikte ilgili congenic işaretleyici (örneğin, CD45.2 veya Thy1.2) ile boyandı. , CD45.1 + / CD45.2 +). </li><li> FACS analizi sırasında, hücreler congenic marker (örneğin CD45.1) ve daha sonra belirli soy belirteçleri (örneğin CD4/CD8) kapılı ve CMTMR ve KAKE pozitif hücreler arasındaki oranların analiz. </li><li> Veriler genellikle ilgili giriş oranı (aşağıya bakın) bölünmesiyle her doku oranı KAKE / CMTMR (veya CMTMR / KAKE) olarak hesaplanan Homing Endeksi (HI), olarak ifade edilir. Giriş oranı 1 çok yakın ise, doku oranları HI eşdeğer olacaktır. </li></ol> HI = KAKE doku / CMTMR doku: KAKE giriş / CMTMR girdi Kan aynı zamanda her iki T hücre popülasyonlarının eşit dolaşımda temsil veya diğer ilgili (örneğin, akciğerlerin / karaciğer tercihli yakalama veya azalmış canlılığı ile) bir T hücre popülasyonunun azalmış ise olmadığını belirlemek için analiz edilmelidir. Ikincisi akciğerlerde büyük ölçüde sıkışıp olabilir bu yana, naif ya da dinlenme bellek T hücrelerine karşı son zamanlarda aktif efektör T hücreleri karşılaştırırken bu durum meydana gelebilir. Kan HI 1 den önemli ölçüde farklı ise, bir dokularda kan HI HI normalize. Kan anestezi farelerin kalp ponksiyon (AVERTIN veya isofluorane önce ötanazi ile) yoluyla elde edilebilir ve FACS boyama için ACK tampon kullanmadan önce iki kez parçalanmış olmalıdır. Kan normalleşme = HI doku / HI Kan 5. Temsilcisi Sonuçlar Alıcı fareler (Thy1.1 +) euthanized18h yazılan hücre enjeksiyonu. Hücre süspansiyonları, dalak, periferik lenf düğümleri (PLN), mezenterik lenf düğümleri (MLN) ve ince bağırsakta lamina propia (LP) oluşturulmuştur. Thy1.2 ve CD8 hücreleri lekeli ve sonra nihayet CMTMR + hücreleri (gut-tropik T hücreleri) ve KAKE arasındaki oranı analiz edildi yaşayabilir Thy1.2 + CD8 + hücreler, yolluk FACS tarafından analiz edildi Bundan sonra + giriş oranı ile bölünen hücrelerden (kontrol T hücreleri). Sonuçları Şekil 2, gut-tropik ve kontrol T hücreleri, dalak (HI, kırmızı bir çizgi ile gösterilir 1'e yakın) eşit girişli olduğu takdir edilebilir olduğu gösterildiği gibi gösterilebilir . Buna karşılık, gut-tropik T hücreleri, T hücreleri kontrol ile karşılaştırıldığında LP yaklaşık 10 kat daha verimli bir şekilde göç. <img src="/files/ftp_upload/2619/2619fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1: Diyagram gut-tropik ve tropik T hücreleri-gut olmayan üretim ve etiketleme gösteren T hücreleri vahşi tip farelerden izole ve anti-CD3/anti-CD28 100-200 nM varlığı ya da yokluğu ile aktive edilir - trans retinoik asit (RA). 4-5 gün sonra RA-tedavi T hücre bağırsak homing reseptörleri CCR9 ve a4b7 ifade kazanır. Daha sonra, gut-tropik ve kontrol T hücreleri farklı bir 1:1 oranında karıştırılır ve bir alıcı fare kuyruğu damar yoluyla enjekte, yıkanmış, KAKE veya CMTMR etiketlenir. Bazı etiketli hücrelerin KAKE / CMTMR giriş oranı (1'e yakın olmalı) belirlemek için kullanılır. <img src="/files/ftp_upload/2619/2619fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2: Örnek homing analiz Fare ilgi organları 12-18 saat sonrası T hücre enjeksiyonu ve tek hücre süspansiyonları elde edilen analiz etti. Hücreler, sonra da anti-Thy1.2 (congenic işaretleyici) artı anti-CD8 ve Thy1.2 lekeli + CD8 + T hücreleri CMTMR oranı analiz ve KAKE + + FACS tarafından her doku hücreleri . Sonra doku CMTMR / KAKE oranları homing indeksi (HI) elde etmek için Giriş CMTMR / KAKE oranına göre normalize edilir. Bu örnekte CMTMR + ve KAKE + hücrelerin sırasıyla gut-tropik ve kontrol efektör T hücreleri vardır.

<ol><li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte-endothelial+cell+recognition%3A+Three+%28or+more%29+steps+to+specificity+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Leukocyte-endothelial cell recognition: Three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67, 1033-1036 (1991).</li>
<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration%3A+the+multistep+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76, 301-314 (1994).</li>
<li>Iwata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+imprints+gut-homing+specificity+on+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells.</a> Immunity. 21, 527-538 (2004).</li>
<li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+and+dynamic+control+of+CD8+T+cell+homing+by+dendritic+cells+from+skin-+and+gut-associated+lymphoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Reciprocal and dynamic control of CD8 T cell homing by dendritic cells from skin- and gut-associated lymphoid tissues.</a> J Exp Med. 201, 303-316 (2005).</li>
<li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imprinting+of+gut-homing+T+cells+by+Peyer%27s+patch+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer's patch dendritic cells.</a> Nature. 424, 88-93 (2003).</li>
<li>Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).</li>
</ol>

Homing deneyler herhangi bir doku toplam hücre popülasyonlarının göç hakkında çok değerli bilgiler sunmak olsa da, bu testlerin doğrudan endotel adezyonu analiz ve bu nedenle ayrımcılık akılda tutulması olmalıdır adımlı yapışma adım (lar) cascade (bağlama / haddeleme, aktivasyon veya yapışmasını) belirli bir homing reseptör davranmaktadır. Yapışma kaskad homing reseptörlerin belirli bir rolü tanımlamak için altın standart, bireysel floresan etiketli T hücreleri (veya hatta floresan ile işaretlenmiş diğer hücreleri veya ...

Hayvanlar: C57BL / 6 farelerde T hücre izolasyonu için yaygın olarak kullanılmaktadır. Buna ek olarak, CD45.1 ve Thy1.1 congenic suşları Jackson Laboratuvarları (Bar Harbor, ME) ile mevcuttur. Kültür medya: IMDM (Iscove Kullanıcı Modifiye Dulbecco&#39;nun Kullanıcı Orta + L-Glutamine + HEPES) artı 10% ısı-inaktive 100 U / ml penisilin ile desteklenmiş FBS (fetal sığır serumu, düşük endotoksin, Gibco ®, Invitrogen, Carlsbad, CA), 100 mg / ml streptomisin (HyClone Antibiyotikler, Waltham, MA), 0.5 mg / ml fungizone / amfoterisin B (Gibco) ve 50 mM b-mercaptoethanol. ACK Kırmızı Kan Hücresi Lizis tamponu (RBC, 10 mM KHCO 3, 150 mM NH 4 Cl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0)), pH 7,2-7,4 ve oda sıcaklığında saklayın ayarlayabilirsiniz. PBS (Fosfat Tuzlu, Hyclone, Waltham, MA Tamponlu). Flow sitometri (FACS) medya (PBS veya IMDM +% 2 FBS + 5 mM EDTA). 2 mM Ca selektin-Fc kimeralar, medya kullanılarak boyama + + (FACS satın alma da dahil olmak üzere) tüm adımları kullanılmalıdır. Bu durumda IMDM tavsiye edilir. T hücre etiketleme ve evlatlık transferi: KAKE (carboxyfluorescein diasetat, succinimidyl ester), CMTMR - Molecular Probes ((5 (6 )-((( 4-klorometil) benzoil) amino) tetramethylrhodamine) ®, Invitrogen, Carlsbad, CA .) 1000 x stokları DMSO (5 mM KAKE, 20 mM CMTMR) ve -20 ° C&#39;de saklanan olmalıdır Poliklonal T hücre aktivasyonu: 24-iyi ya da 96-iyi tabak (doku kültürü tedavi, düz bir kapak ile alt polistiren, BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) ° C ile 50 ml PBS, sırasıyla 37 az 2 saat süreyle inkübe , anti-CD3 artı anti-CD28 antikorları (10 mg / ml) içeren. Sonra, kültür plakaları PBS ile iki kez yıkanır ve T hücre kültürü için hemen kullanılabilir. Alternatif olarak, anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA) ile kaplı Dynabeads plaka bağlı antikorlar yerine T hücre aktivasyonu için kullanılabilir. Flow sitometri (FACS) boyama: Poliklonal aktivasyon: CD3 (1452C11), CD28 (37,51). Lineage mAb: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2) CD45.2 (104). Gut-homing reseptörleri: saflaştırılmış CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, San Diego, CA), a4b7 (LPAM-1/DATK3), izotip kontrolü (IgG2a k). Cilt homing reseptörleri: P-selektin-Fc (Saflaştırılmış Fare P-selektin - IgG Fusion Protein, BD Pharmingen, San Jose, CA), E-selektin-Fc (Rekombinant Fare E-Selectin/Fc Chimera, R &amp; D Systems, Minneapolis, MN) artı karşılık gelen ikincil reaktif keçi F (ab &#39;) 2 anti-insan IgG R-PE (Invitrogen, Carlsbad, CA). All-trans retinoik asit (Sigma, St Louis, MO) hazırlanması sırasında bir sarı ampul veya dolaylı bir ışık kaynağı kullanarak mutlak etanol veya DMSO yeniden süspanse. -80 Cam şişeleri saklayın alikotları ° C ve her zaman ışıktan korunmalıdır. Sentetik RAR-agonistler: Am80 (Wako Kimyasallar, Richmond, VA).

gut-tropik t hücre göç eğitim rekabetçi homing tahliller

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Altına almak üzere fonksiyon lenfositler, kan terk ve vücudun farklı dokulara göç etmek gerekir. Endotel hücreleri ve doku ekstravazasyonu Lenfosit yapışır lenfositler ve endotel hücreleri 1 2 görüntülenen kendi ligandlar (addressins) ifade farklı adezyon molekülleri tarafından kontrol edilen çok adımlı bir süreç (homing reseptörler). Bu adezyon reseptörlerinin fonksiyon kısmen çalışılan rağmen ex vivo, in vivo lenfosit yapışma ve göç sırasında fizyolojik alaka için nihai test rollerini değerlendirmek için. Intravital mikroskobu (IVM) ve homing deneyler: İki tamamlayıcı stratejiler, bu amaç için kullanılır olmuştur. IVM yapışma kaskad sırasında gerçek zamanlı olarak ve farklı dokularda spesifik adezyon reseptörleri kesin katkısını tanımlamak için gerekli olmasına rağmen, IVM, yoğun zaman alıcı ve emek, genellikle gelişmiş cerrahi tekniklerin geliştirilmesini gerektirir, homojen önceden izolasyon ihtiyacı hücre popülasyonlarının ve herhangi bir zamanda sadece bir doku / organ analizine izin verir. Buna karşılık, rekabetçi homing deneyler aynı fare göç iki (hatta daha fazla) hücre alt direkt ve eş zamanlı karşılaştırma izin verir ve onlar da birçok dokuların ve hücrelerin aynı deneyi bir yüksek sayıda analiz izin. Burada bir kontrol hücre popülasyonu ile karşılaştırıldığında belirli dokulara belirli bir hücre tipi avantajı / dezavantajı belirlemek için kullanılan klasik rekabetçi homing protokol açıklar. Bağırsak mukozasının dış çevre ile temas halinde büyük vücut yüzey, çünkü, gut-tropik karşı gut-tropik olmayan T hücreleri göçmen özelliklerini göstermek için seçti ve aynı zamanda iyi tanımlanmış göçmen gereksinimleri ile ekstra-lenfoid doku . Ayrıca son çalışma, vitamin A metabolit all-trans retinoik asit (RA) lenfositler gut-spesifik adezyon reseptörleri (integrin a4b7and kemokin reseptör CCR9) uyarılacak sorumlu başlıca moleküler mekanizma olduğunu belirlemiştir. Bu yüzden, kolayca sonunda, burada açıklanan rekabetçi homing deneylerde kullanılabilecek, sırasıyla, RA varlığı ya da yokluğu T hücreleri aktive ederek, gut-tropik ve lenfositler gut-tropik olmayan ex vivo çok sayıda üretebilirsiniz.

Rekabetçi homing deneyler, doğrudan tek bir fare iki farklı hücre popülasyonlarının göçmen özelliklerinin değerlendirilmesi için izin verir. Burada oluşturulan ex vivo gut-tropik karşı-gut olmayan tropik T hücreleri göç karşılaştırarak bu yordamı göstermektedir.

Gut-tropik T Hücre Göç Eğitim Rekabetçi Homing Tahliller

Lenfositlerin işlevlerini yerine getirebilmeleri için kan damarlarından çıkmaları ve vücuttaki farklı dokulara göç etmeleri gerekir. Lenfositlerin endotelyal hücrelere adezyonu...

Bu prosedürün genel amacı, aynı fare alıcısında iki veya daha fazla hücre alt kümesinin dokuya özgü göç yeteneklerini karşılaştırarak, tek bir deneyde birçok doku ve hücrenin analiz edilmesine olanak sağlamaktır. Burada, in vitro ortamda üretilen gut tropik ve kontrol T hücrelerinin vahşi tip bir alıcı faredeki göç yeteneklerini karşılaştırmak için bir yöntem gösteriyoruz. Bu yöntem, örneğin, gut tropik T hücrelerinin bağırsak mezenterik lenf düğümlerine, periferik lenf düğümlerine ve dala göç etme yeteneğini belirlemek için kullanılabilir.Kontrol T hücrelerine kıyasla, öncelikle gut tropik ve kontrol efektör T hücreleri in vitro ortamda üretilmelidir. Ardından, deneysel ve kontrol T hücreleri farklı boyalarla işaretlenmeli ve bire bir oranda karıştırılmalıdır. Daha sonra, giriş oranını doğrulamak için kullanılan küçük bir alıkontum hariç, hücre karışımı alıcı fareye enjekte edilir.Son olarak, adoptif transferden 18 saat sonra fare sakrifiye edilir ve ilgili organlar, bağırsak tropik ve kontrol T hücrelerinin varlığı açısından akış sitometrisi ile analiz edilir. Bu tekniğin, tek hücre popülasyonunun adoptif transferi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, farklı alt tip kombinasyonlarının aynı alıcı farelere enjekte edilmesidir; bu durum, intravenöz enjeksiyondan veya farklı alıcı farelerin kullanılmasından kaynaklanan değişkenliği önemli ölçüde azaltır. Bu tekniğin uygulamaları, inflamatuar bağırsak hastalığı gibi masif lökosit infiltrasyonu ile ilişkili hastalıkların tedavisine kadar uzanmaktadır.Örneğin, bu yöntem hem normal hem de aran lenfosit migrasyonu sırasında bağırsağa ne kadar molekül gerektiğini belirlememize olanak tanır. Ayrıca bu prosedür, lökosit trafiğini engellemek için tasarlanmış ilaçların etkinliğini değerlendirmemizi sağlar. 24 kuyucuklu bir plakanın her kuyucuğunu, 10 mg/mL anti CD3 ve anti CD28 antikorları içeren 500 µL PBS ile kaplayın. Kuyucuklar kaplanırken plakayı 37 °C'de, %5 CO2 içeren ortamda iki saat boyunca inkübe edin.Vahşi tip bir fareyi sakrifiye edin ve dalağı disseke ederek besiyerli 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. Dalağı iki lam arasında bırakıp bir Petri kabı üzerinde ezerek PLE sitlerini izole edin. Hücreleri PBS içinde yeniden süspanse edin, hücre süspansiyonunu yeni bir 50 mililitrelik konik tüpe pipetleyin ve beş dakika boyunca santrifüjleyin.Oda sıcaklığında 400 Gs'de santrifüjleyin ve hücre peletini iki ila üç dakika boyunca dört mililitre akt lizis tamponunda süspanse ederek eritrositleri lize edin. Lizisi beş mililitre PBS ile durdurun, hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 400 Gs'de beş dakika daha santrifüjleyin ve süpernatantı atın. Oluşan peletini, buz üzerinde complete ice içerisinde mililitrede 1x10⁶ hücre olacak şekilde süspanse edin.Coves modifiyeli delcos medyumu veya IMDM ile eşit şekilde karıştırın, elde edilen hücre süspansiyonunu iki ayrı tüpe bölün ve tüplerden birine nihai konsantrasyonu 100 ila 200 nanomolar olacak şekilde all-trans retinoik asit veya RA ekleyin. All-trans retinoik asit bozunmasını önlemek için tüpü doğrudan ışıktan koruyun. 24 kuyucuklu plakayı inkübatörden çıkarın ve her bir kuyucuğu iki mililitre PBS ile iki kez yıkayın.RA takviyeli hücre süspansiyonunun 1,5 ila iki mililitresini 24 kuyucuklu plakanın yarısına ekleyin. Ardından, kontrol hücrelerinin aynı miktarını 24 kuyucuklu plakanın ikinci yarısındaki her bir kuyucuğa ekleyin ve plakayı inkübatöre geri yerleştirin. İki ila üç gün sonra, hücre süspansiyonlarını yeni bir kaplanmamış 24 kuyucuklu plakaya aktarın.T hücrelerinin aşırı uyarılmasını önlemek için hücreleri iki ila üç gün daha inkübe edin. Hücre yoğunluğu ve/veya proliferasyon nedeniyle besiyeri sarıya dönerse, her kuyucukta bir mililitre son hacme ulaşmak için her kuyucuğa 500 µL taze IMDM ekleyin. Hücreleri hasat etmek için, hücrelerin ekildiği günü sıfırıncı gün olarak sayarak, dördüncü veya beşinci günde süpernatantı toplayın.Tipik nihai verimler, kuyur başına 1 ila 2 x 10⁶ efektör T hücresidir. Bu nedenle, grup başına 10 ila 20 x 10⁶ T hücresi üretmek için gut tropik ve kontrol T hücrelerinin her birinden minimum dokuz ila 12 kuyur ekilmelidir. ra üzerindeki alfa dört, beta yedi ve CCR dokuz ekspresyon seviyelerini kontrol etmek için.Aktive edilmiş ve kontrollü T hücrelerinin, taze hasat edilmiş deney ve kontrol hücrelerinin altıda birinin onda biri kadar olan 0,2 ile 0,5 katı arası miktarı dört mililitrelik faks tüplerine toplanır ve santrifüj edilir. Tüpler, 4 °C'de 300 G'de beş dakika boyunca santrifüjlenir. Süpernatan atılır ve hücreler 100 µL boyama tamponu içinde yeniden süspanse edilerek; anti-CD4 FITC, anti-CD4 beta 7 PE, anti-CCR9 APC ve anti-CD8 PerCP ile karanlıkta, 4 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edilir.İnkübasyon sonrası, hücreleri 300 GS'de dört derece Celsius'da beş dakika boyunca PBS ile yıkayın, süpernatanı atın ve hücreleri tekrar boyama tamponu içinde süspanse edin ve ardından akış sitometrisi ile analiz edin. Bu adımın başında, boyama protokolünde daha sonra kullanılmak üzere bir şişe IMDM ve bir şişe PBS'yi 37 derece Celsius'de önceden ısıtın.Önceki adımda açıklandığı üzere, akış sitometrisi ile iki hücre kültürünün T-hücresi homing fenotiplerini doğruladıktan sonra; yeni hasat edilmiş alfa dört, beta yedi, yüksek CCR dokuz, yüksek bağırsak tropik ve alfa dört, beta yedi, düşük veya negatif CCR dokuz düşük veya negatif kontrol T-hücresi popülasyonlarını oda sıcaklığında 300 Gs ile beş dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, serumu uzaklaştırmak için hücreleri PBS ile iki kez daha yıkayın ve daha sonra her grup için T-hücresi konsantrasyonunu 10 ila 15 × 10⁶ hücre/mL olacak şekilde ayarlayın. PBS içerisine, bağırsak tropik T veya kontrol T hücrelerine CFSE veya C-M-T-M-R boyalarını ekleyin.Burada CFSE kontrol hücre popülasyonuna ve C-M-T-M-R ise gut tropik T hücrelerine sırasıyla beş milimolar ve 10 milimolar son konsantrasyon olacak şekilde eklenmektedir. Hücreleri beş saniye boyunca hafifçe vortexleyin ve tüpleri su banyosunda 37 °C'de 20 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyon süresinin ardından, beş mililitre FPS ekleyerek boyamayı durdurun ve oda sıcaklığında bir ila beş dakika boyunca inkübe edin.Ilık PBS ile 10 kat seyreltin ve oda sıcaklığında 300 Gs'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın, PBS ile iki kez daha yıkayın ve hücreleri komple IMDM içinde yeniden süspande edin. İdeal olarak, her bir T hücresi popülasyonunun altı hücresinin 10 ila 20 kat 10'u, dört mililitrelik faks tüplerinde bir bire bir oranında karıştırılmalıdır.Kesin girdi oranını hesaplamak için, girdi olarak adlandırılan ve tübe enjekte edilen hücre süspansiyonundan 5 ila 10 µL kaydedin ve bunu 4 °C'de tutun. Enjekte edilecek hücre karışımını oda sıcaklığında, 300 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Enjekte edilecek hücreleri 250 ila 300 µL sıcak PBS içinde yeniden süspande edin; enjeksiyon için hücreleri 28 gauge iğneye sahip 1 CC'lik bir insülin şırıngasına doldurun.Hücre karışımının 250 µL'sini kuyruk veninden enjekte edin. Son olarak, önceden enjekte edilen CFSE ve C-M-T-M-R pozitif hücrelerin yüzdesini belirlemek için girdi hücrelerini akış sitometrisi ile analiz edin. Bu değer, kullanılan girdi oranı olacaktır.Homing indeksinin nihai hesaplamasında, T-hücresi homing analizini gerçekleştirmek için dokulardan alınan hücre örneklerini mililitrede 3 x 10⁶ hücreyi geçmeyecek bir yoğunlukta süspansiyona getiririz. Bu videoda alıcı olarak konjenik fareler kullanılıyorsa, akış sitometrik analiz sırasında uygun konjenik belirteç ve belirli soy hattı belirteçleri ile birlikte CD 45.1 pozitif hücreler boyanmıştır; hücreler önce seçilen konjenik belirtece, ardından spesifik soy hattı belirteci CD8'e göre kapılandıkça (gate) CMTR ve CFSE pozitif hücreler arasındaki oranlar analiz edilir.Veriler daha sonra, her dokudaki iki farklı boya arasındaki oranın ilgili girdi oranına bölünmesiyle hesaplanan homing indeksi veya hi olarak ifade edilir. Girdi oranı, bu amaçla ayrılan ve akış sitometrisi ile analiz edilen beş ila 10 µL'lik hücre süspansiyonu alikotundan hesaplanan, enjeksiyondan önce şırıngadaki CFSE pozitif hücrelerin CMTM TMR pozitif hücrelere oranıdır. Girdi oranı bire çok yakınsa, doku oranları hi ile eşdeğer olacaktır.Eğer HI ve kan değerleri birden önemli ölçüde farklıysa, analiz edilen dokulardaki HI; dokulardaki HI'nın, enjeksiyondan 18 saat sonra dalak, periferik lenf düğümleri veya PLN, mezenterik lenf düğümleri veya MLN ve ince bağırsak lamina propria veya LP'den hazırlanan hücre süspansiyonlarındaki HI'ya bölünerek oranı hesaplanarak kan HI'sı ile normalize edilebilir. Kapılı CD8 pozitif CD45.1 pozitif hücrelerde CMTR ve CFSE ekspresyonu analiz edilmiştir. Aktive edilmiş α4, β7 ve CCR9 eksprese eden CMTR pozitif T hücreleri, kontrol CFSE pozitif hücrelerle eşit sayılarda dalağa göç etmiş, ancak bağırsak ve drenaj lenf dokularına göçte belirgin bir artış göstermiştir; her bir doku için HI hesaplanması bunu daha da doğrulamıştır. Bağırsak tropik T hücrelerinin kontrol T hücreleriyle dalağa eşit oranda göç ettiği, buna karşın, bağırsak tropik T hücrelerinin kontrol T hücrelerine kıyasla LP'ye yaklaşık 10 kat daha verimli göç ettiği görülmüştür. Prosedürde uzmanlaşıldıktan sonra.Dendritik hücreler veya makrofajlar gibi ek hücre tiplerinin göç etme yeteneğini değerlendirmek için boya seviyelendirmesi yerine konjenik fareler kullanılabilir. Bu hücre tipleri alıcı farelere enjekte edildikten sonra boyayı kaybetme eğiliminde olduğundan, konjenik hayvanların kullanılması hücrelerin daha iyi takip edilmesine ve adoptif transfer sonrası çok daha uzun sürelerin izlenmesine olanak tanır.

competitive-homing-assays-to-study-gut-tropic-t-cell-migration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

T lenfosit göç homing lenfoid organlar, damar çıkış sırasında oluşur ve periferik dokularda girmeden. Burada, T lenfosit göçü analiz etmek için kullanılan bir protokol...

Göç İnsan T Lenfosit İzolasyon, Kültür ve Analiz In Vitro</em

Bu videoda, insan akciğer tümörü dilimleri içinde floresan olarak bağlanmış antikorlarla işaretlenmiş yerleşik tümöre sızan CD8 T hücrelerinin görüntülenmesi açıklanmaktadır. Bu teknik, konfokal mikroskopi kullanılarak CD8 T hücre göçünün gerçek zamanlı analizlerine izin verir.

Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Farklı Tümör Bölgelerinde Yerleşik T Hücresi Migrasyonunun Gerçek Zamanlı Analizi

Çeşitli büyüme faktörlerinin varlığında enterik nöral tepe hücre göçü potansiyelinin hassas miktar tayinine izin veren bir ex vivo hücre göçü deneyi mevcut.

Kemirgen Enterik Sinir progenitörlerin için Kantitatif Hücre Göç Tahlili

enflamasyon bölgelerinde CD4 efektör T hücrelerinin geçiş motilite yöneten mekanizma nispeten bilinmemektedir. Biz görselleştirmek ve yerinde bu hücrelerin dinamik davranışının çalışması için izin iltihaplı kulak dermiş in vitro -astarlı CD4 T hücrelerinde işlemek için non-invaziv bir yaklaşım sunuyoruz.

Iltihaplı Dermisinde içinde görüntüleme CD4 + T hücre Geçiş Göç

Lenfosit kemotaksis ve geçiş kantitatif değerlendirilmesi için protokolleri İmmünoloji araştırma için önemli araçlardır. Burada, bir vitro Protokolü izni gerçek zamanlı, hücre göç değerlendirilmesi yanı sıra bir tamamlayıcı vivo içinde teknik etkinleştirme izlemeyle yerli hücreleri dalak multiplexed açıklanmıştır.

İnsan monosit kemotaksisi Vitro ve In Vivo kaçakçılığı fare lenfosit miktarının

Burada tanıtılan Protokolü içinde vivo inflamatuar koşullar altında birincil insan lenfosit akciğer izleme kapasitesini karakterizasyonu sağlar. Alerjik iltihap bir fare modeli adoptively transfer edilen insan bağışıklık hücrelerinin pulmoner infiltrasyon görüntüsü ve kimyasal olarak temizlenen Akciğer doku ışık sayfalık Floresans mikroskobu tarafından sayılabilir.

Akciğer yolu bulabilen insan lenfosit içinde deneysel bir alerjik iltihap ışık sayfalık mikroskobu üzerinde dayalı, Vivo modeli görüntüleme gelişmiş

Bu protokolde lenfositler, alt odadan gözenekli bir zarla ayrılan bir transmigration sisteminin üst odasına yerleştirilir. Keokin alt hazneye eklenir, bu da bir kemokin gradyan boyunca aktif göçe neden olur. 48 saat sonra, lenfositler transmigration quantitate için her iki odada sayılır.

Ex Vivo Transmigration Sisteminde Lenfosit Göçünün Değerlendirilmesi

Burada bağırsak-homing düzenleyici T hücre indüksiyon invivo büyütme için bir protokol sıyoruz. Bu protokolde, dendritik hücreler lokal olarak aktif D vitamini (1,25-dihidroksivitamin D veya 1,25[OH]2D) ve aktif A vitamini (retinoik asit veya RA) de novo yüksek konsantrasyonlarda üretmek için tasarlanır.

Bağırsak-Homing Düzenleyici T Hücre İndüksiyon In Vivo Augmentation

Bu protokol, kantitatif analiz ile belirli çevresel koşullar altında primer murin T hücresi izolasyonu ve T hücresi göçünün hızlandırılmış mikroskobu için bir yöntem sağlar.

Primer Murin CD8 + T Hücreleri için Gerçek Zamanlı İn Vitro Migrasyon Testi

Kaçakçılık reseptörlerinin retroviral transdüksiyonu ve reseptör aracılı organ ve mikroçevreye özgü lenfosit konumlandırmasını incelemek için rekabetçi hedef arama için geliştirilmiş protokoller sunuyoruz. Bu yöntem, bağışıklık hücresi kaçakçılığı mekanizmaları hakkında değerli bilgiler sunar ve gelecekteki temel ve terapötik araştırmalarda potansiyel uygulamalara sahiptir.

Farklı Doku Mikroortamlarında GPCR Aracılı T Hücresi Lokalizasyonunu Araştırmak için Verimli Retroviral Transdüksiyon ve Rekabetçi Hedef Arama

Öğrenin, bağırsak-tropik ve kontrol T hücrelerinin göç yeteneklerini rekabetçi homing testiyle karşılaştırın. Bu yöntem, farede doku özgü T hücresi göçünü analiz ederek immünoloji araştırmalarına katkı sağlar.

Gut-tropik T Hücre Göç Eğitim Rekabetçi Homing Tahliller

Daha fazla video keşfet