Name: Embriyonik Ekstremite Cilt damarları Tüm montaj İmmünohistokimyasal Analizi: Embriyo vasküler dallanma Morphogenesis Eğitim Model Sistemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Keşfedin fare embriyo ekstremite cilt damarlarının tüm montaj immünohistokimyasal analizi ile gelişimsel biyolojide vasküler ağ oluşumunu. Bu yöntem konfokal mikroskopi kullanarak yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

K. Gill, fare yetiştirme ve bakımı ile ilgili yardım ve laboratuvar yönetimi için teşekkür ederiz. Teknik yardım için Mukoyama laboratuar üyeleri de teşekkür ederiz. Finansman, Sağlık Naitonal Enstitüleri İntramural Araştırma Programı tarafından sağlanmıştır.

1. Toplama Fare Embriyonik Ekstremite Skin (E13.5 ~ E17.5) <ol><li> Euthanize Onaylanan prosedür kadın takılı. Onaylı hayvan protokole göre, kadınlarda CO 2 maruz tarafından ötenazi ve sonra servikal dislokasyon ile güvence altına. Emici kağıt havlu üzerine yatırın ve hayvan sıkmak şişeden% 70 EtOH / H 2 O iyice ıslatın. </li><li> Rahim sağlam inceleyin ve kan yıkamak için buz Hanks 'Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) içeren 100 x 15 mm Petri kabı yerleştirin. </li><li> Embriyo ayrı ve teşrih. Embriyo çok ince amniyon çıkarın. </li><li> Her embriyo genotip gerekiyorsa (Seçenek) 35 x 10 mm Petri kabında tek bir embriyo parçalara ayır. Disseke kuyruk genotipleme için 0,2 ml PCR tüpü aktarılır. </li><li> Embriyonun ön ayakları kesiliyor ve transferi 24 plaka 2 ml Phosphate Buffer Saline (PBS) buz gibi taze% 4 Paraformaldehit (PFA) içeren bir halka forseps ön ayakları. </li><li> 4 ° C gecede Nutator Mikser nazik karıştırma ön ayakları sabitleyin. </li><li> Ertesi gün, PFA çıkartın ve oda sıcaklığında Nutator Mikser nazik karıştırma ile 2 ml PBS 5 dakika boyunca üç kez yıkayın. </li><li> % 100 metanol (MeOH) ön ayakları transferi ve -20 ° C'de enzim dondurucu (kritik sıcaklık kontrolü ve otomatik buz çözme fonksiyonu olmadan dondurucu) saklayabilirsiniz. İlköğretim antikorlar% 100 MeOH tedaviden sonra Tablo 1 iş listelenmiştir. </li><li> Ince cımbız kullanarak ön ayakları kapalı cilt Peel. Ekstremite cilt, kurutulmuş, uzuv kolayca ayrılmalıdır. İlk uzuv yukarı bakacak ventral tarafı (avuç içi tarafında) yerleştirin. Sonra videoda gösterildiği gibi ince cımbız kullanarak, deri kesme. Sonraki herhangi bir zarar vermeden cildi nazikçe sıyrılarak, tüm bacak çevresinde teşrih. </li></ol> 2. Tüm montaj Ekstremite Skins İmmünohistokimyasal Boyama <ol><li> MeOH / PBT (PBS +% 0.2 Triton X-100) (% 75,% 50,% 25) için her biri 5 dakika aşamalı bir dizi kuluçka 5ml polipropilen yuvarlak alt tüp bacak derileri rehidrate. Çözümler alışverişi ekstremite derileri zarar vermemek için dikkatli olunması gerektiğini unutmayın. </li><li> , Oda sıcaklığında Nutator Mikser nazik karıştırma PBT 5 dakika için iki kez yıkayın. </li><li> Nutator Mikser nazik karıştırma ile 2 saat eşek sekonder antikor için% 10 keçi sekonder antikorlar serum / PBS +0.2% TX100 engelleme tampon Keçi veya% 10 Eşek serum / PBS +0.2% TX100 engelleme tampon ya bacak derileri Blok oda sıcaklığında bekletin. </li><li> Engelleme tampon birincil antikor 800μl (Tablolarda listelenen uygun dilüsyon) (2ml mikrosantrifüj tüp içine bir halka forseps ile 35 x 10 mm Petri kabı ve transfer bacak deriler% 10 ya da koyun keçi serum / PBS 0,2 % TX100 veya% 10 Eşek serum / PBS +0.2% TX100). 4 ° C gecede Nutator Mikser nazik karıştırma ile bacak derileri inkübe edin. Farklı türleri (örneğin, sıçan monoklonal antikor + tavşan poliklonal antikor) türetilen multipl primer antikorlar aynı anda kullanılabilir olabileceğini unutmayın. </li><li> Ertesi gün, yıkama tampon 4ml (ya% 2 Keçi serum / PBS +0.2% TX100 veya 2, yuvarlak alt 5ml polipropilen tüp içine bir halka forseps ile 35 x 10 mm Petri kabı ve transfer ekstremite derileri yerde % Eşek serum / PBS +0.2% TX100). </li><li> Nazik oda sıcaklığında Nutator Mikser karıştırma ile 15 dakika süreyle beş kez yıkayın. </li><li> 800μl engelleme tampon sekonder antikor (ya% 10 Keçi serum / PBS +0.2% TX100 veya% 10 Eşek serum / 2ml-mikrosantrifüj tüp içine bir halka forseps ile 35 x 10 mm Petri kabı ve transfer bacak derileri koyun PBS +0.2% TX100). Genelde biz Jackson ImmunoResearch (Cy3, Cy5, 1:300 dilüsyonları) veya Invitrogen (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 633, 1:250 dilüsyon) ikincil antikorlar kullanır. 0.22μm PVDF membran şırınga filtreleri kullanarak sekonder antikor toplu parçacıkları çıkarmak için ikincil antikor çözüm Filtre. Oda sıcaklığında Nutator Mikser nazik karıştırma ile 1 saat karanlık veya alüminyum folyo ile sarılmış bacak derileri inkübe edin. Farklı türlerden elde edilen farklı floresan konjuge sekonder antikorlar aynı anda kullanılabilir olabileceğini unutmayın. </li><li> Bacak derileri koyun yıkama tampon 4ml (% 2 Keçi serum / PBS 0,2% ya TX100 veya% 2 Eşek serum / PBS ile 5ml polipropilen yuvarlak alt tüpe bir halka forseps ile 35 x 10 mm Petri kabı ve transfer 0,2% TX100). Koyu veya yumuşak oda sıcaklığında Nutator Mikser karıştırma alüminyum folyo ile sarılmış 15 dakika süreyle beş kez yıkayın. </li><li> (Çekirdeği karşı counterstaining için Seçenek) yıkama tampon 4ml (ya% 2 Keçi serum / PBS 0,2% TX100 veya% 2 Eşek serum / PBS +0.2% TX100) için-Pro-3 (Invitrogen T3605 ile bacak derileri inkübe , koyu veya oda sıcaklıklarda Nutator Mikser nazik karıştırma ile 10 dakika süreyle alüminyum folyo ile sarılır 1:3000 dilüsyon)yeniden. Daha sonra, nazik karıştırma ile alüminyum folyo ile karanlık veya sarılmış yıkama tampon 4ml (% 2 Keçi serum / PBS TX100 veya% 2 Eşek serum / PBS +0.2% +0.2% TX100 ya) ile 5 dakika boyunca üç defa yıkamak oda sıcaklığında Nutator Mikser. Çekirdekleri için güçlü ve spesifik boyanması için pro-3 için belirli bir emisyon (HeNe 633 nm eksitasyon) görülmektedir unutmayın. </li></ol> 3. Slayt Ekstremite Skins Montaj <ol><li> 35 x 10 mm Petri kabında bacak derileri yerleştirin. Beyazlatma kapsamlı fotoğraf çekmemek için düşük aydınlatma stereomicroscope altında ince bir cımbız kullanarak derileri iç tabakası toz, kristaller, elyaf çıkarın. </li><li> Bir halka forseps yapışkan mikroskobik slayt bacak derileri aktarın. Slayt (yani lamel doğru) yukarı doğru uzanan iç tabakası ile derileri yerleştirin. Derileri titizlikle cımbız kullanarak Düzleştir'i kaldırmak ve Kimwipe tarafından tampon yıkama-over taşımak. </li><li> Hava kabarcıkları olmadan, anti-solmaya montaj medya monte edin. Biz 25 "x25" lamel kullanın. Karanlıkta düz bir yüzey üzerinde Cure (örneğin, örnekleri görüntülemeden önce oda sıcaklığında karanlık bir gece olarak yerleştirilir Altın reaktif uzatmak kullanılarak monte). Uzun süreli depolama için, 4 slayt lamel ve mağaza mühür ° C </li></ol> 4. Konfokal Mikroskop <ol><li> Fluorophores için uygun lazerler kadar ayarlayın. Biz, Argon 488nm (Alexa Fluor 488 ve GFP), DPSS 561nm (Alexa Fluor 568 ve Cy3) ve HeNe 633nm (Alexa Fluor 633, Cy5 ve To-Pro-3 için) olmak üzere üç lazer kaynakları ile Leica TCS SP5 konfokal mikroskop . </li><li> Tüm boyalar, çift ya da üçlü lekeli örneklerinde aynı zamanda heyecanlı olacağı crosstalk önlemek veya azaltmak için sıralı tarama aracını kullanın. Sıralı tarama modu, sıralı olarak kaydedilir. </li><li> Uyarma için floresan boyalar ve lazer hakkında daha fazla genel bilgi Hibbs (2004) tarafından "Biyologlar için Konfokal Mikroskop" kurulmuş olabilir </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Pan-endotelyal hücre işaretleyici karşı antikorlar E15.5 fare ön ayakları deride Tüm montaj üç-etiket konfokal immnofluorescence mikroskopi PECAM-1 (Şekil 1A-C, D, mavi), nörofilaman işaretleyici 2H3 (Şekil 1A yeşil) ve ekstremite cilt 2H3 + periferik sinirleri ile uyumlu αSMA + arterlerin bir karakteristik dallanma deseni, düz kas hücre belirteci αSMA (Şekil 1A, B kırmızı) ortaya çıkardı. Dallanma kan damarı yanı sıra, bu uzuv deri vaskülatürü modeli lenfatik endotel hücre işaretleyici LYVE-1 (Şekil 1D, E kırmızı) ve Neuropilin2 (NRP2) (Şekil 1D, F yeşil antikorlar kullanılarak lenfatik damar dallanma desenlendirme incelemek için kullanılır. .) <img src="/files/ftp_upload/2620/2620fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 (AC) Arterler embriyonik ekstremite cilt periferik sinir ile aynı hizaya getirin. Pan-endotelyal hücre belirteci PECAM-1 (AC, mavi), nörofilaman işaretleyici 2H3 (A, yeşil) ve düz kas hücre işaretleyici αSMA (A ve B, kırmızı karşı antikorlar ile tüm montaj üçlü-etiket konfokal immnofluorescence mikroskopi ) gösterilir. E15.5, 2H3 + periferik sinirlerin (açık ok) αSMA tarafından karşılanmaktadır arterler (ok başları) + düz kas hücreleri ile ilişkilendirir. (DF) embriyonik ekstremite cilt Lenfatik damarsal. Pan-endotelyal hücre belirteci antikorlar PECAM-1 (D, mavi), lenfatik endotel hücre işaretleyici LYVE-1 (D ve E, kırmızı) ve Neuropilin2 (NRP2) (D ve F, yeşil Triple-etiket konfokal immnofluorescence mikroskopi ) gösterilir. LYVE-1 de makrofajlar (açık ok başları) bir alt kümesi ile ifade edilir ise, lenf damarları, LYVE-1 ve NRP2 her iki tarafından görüntülenmiştir. Ölçek çubuğu: 100μm.

<ol><li>Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+nerves+determine+the+pattern+of+arterial+differentiation+and+blood+vessel+branching+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin.</a> Cell. 109, 693-705 (2002).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve-derived+VEGF+promotes+arterial+differentiation+via+neuropilin+1-mediated+positive+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback.</a> Development. 132, 941-952 (2005).</li>
<li>Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+distinction+and+angiogenic+interaction+between+embryonic+arteries+and+veins+revealed+by+ephrin-B2+and+its+receptor+Eph-B4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular distinction and angiogenic interaction between embryonic arteries and veins revealed by ephrin-B2 and its receptor Eph-B4.</a> Cell. 93, 741-753 (1998).</li>
<li>Gerety, S. S., Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetrical+mutant+phenotypes+of+the+receptor+EphB4+and+its+specific+transmembrane+ligand+ephrin-B2+in+cardiovascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Symmetrical mutant phenotypes of the receptor EphB4 and its specific transmembrane ligand ephrin-B2 in cardiovascular development.</a> Mol Cell. 4, 403-414 (1999).</li>
</ol>

Organlara yeterli oksijen ve besin kaynakları nedeniyle vasküler sistem, embriyogenez sırasında yanı sıra yetişkinler organ bakım ve üreme fonksiyonları için organ gelişimi için çok önemlidir. Uygun damar ağı, önceden mevcut olan kapiller ağ çok dallı ve hiyerarşik yapıları ile yeniden düzenlenmiş olan anjiyogenez karmaşık ve çok adımlı işlemler ile kurulmuştur. Birçok eseri çeşitli moleküller bu süreçlere dahil olduğu gösterilmiş olsa da, organ veya bileşenleri vasküler dallanma endotel farklılaşma ve desenlendirme de ...

Antikorlar Pan-endotelyal hücre belirteci <table border="1"><tbody><tr><td> Antikor </td><td> Tür </td><td> Şirket </td><td> Katalog # </td><td> Çalışma şartları </td></tr><tr><td> PECAM-1 </td><td> Ermeni, hamster (M) </td><td> Chemicon </td><td> MAB1398Z </td><td> 1:100 dilüsyon # 1 </td></tr><tr><td> PECAM-1 </td><td> Rat (M) </td><td> BD </td><td> 553369 </td><td> 1:300 dilüsyon </td></tr><tr><td> VEGFR2 </td><td> Rat (M) </td><td> eBioscience </td><td> 14-5821-82 </td><td> 1:200 oranında seyreltildiğinde </td></tr><tr><td> CD34 </td><td> Rat (M) </td><td> eBioscience </td><td> 13-0341 </td><td> 1:300 dilüsyon </td></tr><tr><td> Kollajen IV. </td><td> Tavşan (P) </td><td> Abd Serotec </td><td> 2150-1470 </td><td> 1:300 dilüsyon # 2 </td></tr></tbody></table> Arter endotel hücre işaretleyici <table border="1"><tbody><tr><td> Antikor </td><td> Tür </td><td> Şirket </td><td> Katalog # </td><td> Çalışma şartları </td></tr><tr><td> Neuropilin1 </td><td> Tavşan (P) </td><td> Alex Kolodkin laboratuvar # 3 </td><td></td><td> 1:3000 dilüsyon </td></tr><tr><td> Unc5H2 </td><td> Keçi (P) </td><td> Ar-Ge </td><td> AF1006 </td><td> 1:200 oranında seyreltildiğinde </td></tr></tbody></table> Venöz endotel hücre işaretleyici <table border="1"><tbody><tr><td> Antikor </td><td> Tür </td><td> Şirket </td><td> Katalog # </td><td> Çalışma şartları </td></tr><tr><td> EphB4 </td><td> Keçi (P) </td><td> Ar-Ge </td><td> AF446 </td><td> 1:100 dilüsyon </td></tr></tbody></table> Lenfatik endotel hücre işaretleyici <table border="1"><tbody><tr><td> Antikor </td><td> Tür </td><td> Şirket </td><td> Katalog # </td><td> Çalışma şartları </td></tr><tr><td> LYVE-1 # 4 </td><td> Tavşan (P) </td><td> Abcam </td><td> ab14917 </td><td> 1:200 oranında seyreltildiğinde </td></tr><tr><td> LYVE-1 # 4 </td><td> Rat (M) </td><td> MBL </td><td> D225-3 </td><td> 1:200 oranında seyreltildiğinde </td></tr><tr><td> Prox-1 </td><td> Tavşan (P) </td><td> Chemicon </td><td> AB5475 </td><td> 1:1000 dilüsyon </td></tr><tr><td> Prox-1 </td><td> Keçi (P) </td><td> Ar-Ge </td><td> AF2727 </td><td> 01:50 seyreltme </td></tr><tr><td> Neuropilin2 </td><td> Tavşan (P) </td><td> Hücre Sinyalizasyonu </td><td> 3366 </td><td> 1; 100 seyreltme </td></tr><tr><td> Podoplanin </td><td> Suriye hamsteri (M) </td><td> Hibridoma Bankası </td><td> 8.1.1 </td><td> 1:200 oranında seyreltildiğinde </td></tr></tbody></table> Düz kas hücre / pericyte işaretleyici <table border="1"><tbody><tr><td> Antikor </td><td> Tür </td><td> Şirket </td><td> Katalog # </td><td> Çalışma şartları </td></tr><tr><td> αSMA-Cy3 </td><td> Fare (M) # 5 </td><td> Sigma </td><td> C-6198 </td><td> 1:500 dilüsyon # 6 </td></tr><tr><td> NG2 </td><td> Tavşan (P) </td><td> Chemicon </td><td> AB5320 </td><td> 1:200 oranında seyreltildiğinde </td></tr><tr><td> SM22α </td><td> Tavşan (P) </td><td> Abcam </td><td> ab14106 </td><td> 1:200 oranında seyreltildiğinde </td></tr></tbody></table> GFP muhabiri için Antikorlar <table border="1"><tbody><tr><td> Antikor </td><td> Tür </td><td> Şirket </td><td> Katalog # </td><td> Çalışma şartları </td></tr><tr><td> GFP </td><td> Tavşan (P) </td><td> Invitrogen </td><td> A11122 </td><td> 1:300 dilüsyon </td></tr><tr><td> GFP </td><td> Rat (M) </td><td> Nacalai tesque </td><td> 04404-84 </td><td> 1:1000 dilüsyon </td></tr><tr><td> GFP </td><td> Civciv (P) </td><td> Chemicon </td><td> P42212 </td><td> 1:300 dilüsyon </td></tr></tbody></table> LacZ muhabiri için Antikorlar <table border="1"><tbody><tr><td> Antikor </td><td> Tür </td><td> Şirket </td><td> Katalog # </td><td> Çalışma şartları </td></tr><tr><td> ß-gal </td><td> Tavşan (P) </td><td> MP Biyomedikal </td><td> 55976 </td><td> 1:5000 dilüsyon </td></tr><tr><td> ß-gal </td><td> Keçi (P) </td><td> Abd Serotec </td><td> 4600-1409 </td><td> 1:500 dilüsyon </td></tr><tr><td> ß-gal </td><td> Civciv (P) </td><td> Abcam </td><td> ab9361 </td><td> 1:200 oranında seyreltildiğinde </td></tr></tbody></table> Periferik akson için Antikorlar <table border="1"><tbody><tr><td> Antikor </td><td> Tür </td><td> Şirket </td><td> Katalog # </td><td> Çalışma şartları </td></tr><tr><td> 2H3 </td><td> Fare (M) # 7 </td><td> Hibridoma Bankası </td><td> 2H3 </td><td> 1:200 oranında seyreltildiğinde </td></tr><tr><td> Tuj1 </td><td> Fare (M) # 8 </td><td> Covance </td><td> MMS-435P </td><td> 1:500 dilüsyon </td></tr><tr><td> Peripherin </td><td> Tavşan (P) </td><td> Chemicon </td><td> AB1530 </td><td> 1:1000 dilüsyon </td></tr></tbody></table> Schwann hücreleri göç için antikorlar <table border="1"><tbody><tr><td> BFABP </td><td> Tavşan (P) </td><td> Thomas Müller laboratuvar # 9 </td><td></td><td> 1:3000 dilüsyon </td></tr></tbody></table> (P): poliklonal antikor (M): monoklonal antikor # 1: keçi anti-Ermeni hamster Cy3 (Jackson ImmunoResearch 127-165-160) antikor ikincil bir antikor olarak kullanılmalıdır. # 2: Kollajen IV antikor in situ hibridizasyon sonra kan damarlarını tespit etmek için kullanılabilir. # 3: Neuropilin1 antikor nazik Alex Kolodkin Johns Hopkins Üniversitesi laboratuvarı tarafından sağlanmaktadır. Koyun anti-insan Neuropilin1 antikor, henüz test edilmemiş olmasına rağmen Ar-Ge (AF3870) kullanılabilir. # 4: LYVE-1 antikorları da embriyonik deri makrofaj bir alt kümesi algılar. # 5: anti-αSMA antikor fare IgG2a monoklonal antikor. # 6: Cy3 konjuge αSMA antikor sn birlikte oda sıcaklığında 1 saat inkübediğer primer antikorları için ikincil antikorlar. # 7: 2H3 antikor nörofilaman karşı fare IgG1 monoklonal antikor. # 8: Tuj1 antikor Nöron-spesifik sınıf III beta-tubulin karşı fare monoklonal antikor IgG2a. # 9: BFABP (beyin özel yağ asidi bağlayıcı protein) antikoru nazik Thomas Müller Max-Delbrück Merkezi Moleküler Tıp laboratuarı tarafından sağlanmaktadır.

embriyonik ekstremite cilt damarları tüm montaj İmmünohistokimyasal analizi: embriyo vasküler dallanma morphogenesis eğitim model sistemi

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Tüm montaj immünohistokimyasal analiz görüntüleme için tüm damarsal morfolojilerinden dallanma hücresel mekanizmaları anlamak için çok önemlidir. Biz önceden varolan ilkel kapiller pleksus hiyerarşik dallı bir damar ağına yeniden organize olduğu damar gelişimini incelemek için ekstremite deri vaskülatürü modeli geliştirdik. Birden fazla etiketleme ile tüm montaj konfokal mikroskopi belirli floresan belirteçleri kullanarak, endotel hücreleri perisitlerden ve düz kas hücreleri de dahil olmak üzere, sağlam kan damarlarının yanı sıra hücresel bileşenleri, güçlü görüntüleme için izin verir. Genetik çalışmalar ile bu uzuv deri vaskülatürü modeli gelişmeler, vasküler gelişimi ve desenlendirme moleküler mekanizmaları anlamak düzeldi. Ekstremite deri vaskülatürü modeli, periferik sinirleri arterlerin farklılaşma ve desenlendirme için mekansal bir şablon nasıl çalışmak için kullanılır olmuştur. Bu video makalede, vasküler gelişim sürecini takip edebilecek vaskülarize embriyonik organları için geçerli olan vasküler spesifik antikorlar ve floresan ikincil antikorlar, sağlam kan damarları leke için basit ve sağlam bir protokol tanımlamaktadır.

Biz bir bütün montaj immünohistokimya tanıtmak ve lazer fare embriyonik ekstremite cilt karmaşık damar ağı oluşumunu analiz etmek için birden fazla etiketleme ile konfokal mikroskopi tarama.

Embriyonik Ekstremite Cilt damarları Tüm montaj İmmünohistokimyasal Analizi: Embriyo vasküler dallanma Morphogenesis Eğitim Model Sistemi

Tüm vaskülarizasyonun görüntülenmesi için yapılan whole-mount immünohistokimyasal analiz, dallanma morfogenezinin hücresel mekanizmalarının anlaşılması açısından hayati önem taşır. Önceden var olan primitif bir kapiller pleksusun hiyerarşik olarak dallanmış bir vasküler ağa yeniden organize olduğu vasküler gelişimi incelemek için ekstremite deri vaskülarizasyon modelini geliştirdik. Çoklu işaretlemeli whole-mount konfokal mikroskopi; spesifik floresan markörler kullanarak endotelyal hücreler, perisitler ve düz kas hücreleri dahil olmak üzere hücresel bileşenlerin yanı sıra sağlam kan damarlarının güvenilir bir şekilde görüntülenmesine olanak tanır. Genetik çalışmalarla birlikte bu ekstremite deri vaskülarizasyon modelindeki ilerlemeler, vasküler gelişim ve paternlenmenin moleküler mekanizmalarının anlaşılmasını geliştirmiştir. Ekstremite deri vaskülarizasyon modeli, periferik sinirlerin arterlerin diferansiyasyonu ve paternlenmesi için nasıl mekânsal bir şablon sağladığını incelemek için kullanılmıştır. Bu video makalesi, vasküler gelişimi takip edebildiğimiz vaskülarize embriyonik organlar için uygulanabilir olan, sağlam kan damarlarının vasküler spesifik antikorlar ve floresan sekonder antikorlarla boyanmasına yönelik basit ve güvenilir bir protokolü açıklamaktadır.

Bu prosedürün genel amacı, gelişmekte olan ekstremite derisindeki tüm vaskülatürün görüntülenmesi için whole-mount immünohistokimyasal analiz gerçekleştirmektir. Bu işlem, öncelikle embriyodan dört ekstremitenin kesilmesi, bu dört ekstremitenin PBS içindeki %4 paraformaldehit ile fikse edilmesi ve ardından %100 metanol ile dehidre edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, ince cımbızlar kullanarak ekstremitenin tabanındaki derinin soyulmasıdır.Mavi kesikli çizgileri takip edin ve deriyi %100 methanol içeren bir kap içerisinde soyun. Deriyi uzuvdan ayırın. Ardından, uzuv derisi üzerinde damara özgü primer antikorlar ve floresan sekonder antikorlar ile immünohistokimyasal boyama gerçekleştirilir.Son olarak, çoklu etiketleme ile yapılan tümle (whole mount) konfokal mikroskopi, tüm ekstremite deri vaskülatürünün güçlü bir şekilde görüntülenmesini sağlayacaktır. Bu tekniğin, kesit histolojik analiz gibi mevcut yöntemlere göre avantajı şudur: Embriyo kesitleme yönteminin aksine, ekstremite deri vaskülatürünün tümle immünohistokimyasal analizi, hücre bileşenleri dahil olmak üzere tüm vaskülatürü görüntülememize olanak tanıdığı gibi, kan damarı hücrelerinin farklılaşma ve örüntülenme süreçleri ile lenfatik damar dallanmasını da incelememize imkan tanır. Laboratuvarımdaki doktora sonrası araştırmacı Winding DA ile birlikte prosedürü gösteriyoruz; embriyonik ekstremite derileri gebe dişi farelerden toplanır.Uterusu çıkarıp yıkadıktan sonra, embriyoları ayırmak ve diseke etmek için bir diseksiyon mikroskobu altında çalışın. Embriyolar diseke edildikten sonraki adım, ince cımbızlar kullanarak dört LIMS'i embriyolardan çıkarmaktır. Dört uzvu omuz kısmından kesin, ardından dört uzvu buz içeren 24 kuyucuklu bir plakaya aktarmak için halka pens kullanın.Soğuk, taze PBS içinde %4 Paraformaldehit (PFA) çözeltisi hazırlayın; her bir kuyucuğa ikişer adet ekstremite yerleştirip üzerine 2 mL %4 PFA ekleyin. Ekstremiteleri, bir orbital çalkalayıcıda 4 °C'de gece boyunca nazikçe karıştırarak fikse edin. Ertesi gün, her kuyucuktaki PFA'yı uzaklaştırın ve 2 mL PBS ekleyin.Numuneleri, oda sıcaklığında mutator karıştırıcıda hafifçe karıştırarak beş dakika boyunca yıkayın. Bu yıkama işlemini iki kez tekrarlayarak toplamda üç yıkama yapın. Ardından, dört uzvu, %100 methanol içeren beş mililitrelik polipropilen yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın ve kritik sıcaklık kontrollü, otomatik buz çözme özelliği olmayan bir enzim dondurucuda -20 °C'de saklayın. Gece boyunca -20 °C'de saklama işleminden sonra, deri uzuvdan soyulabilir.Bu, prosedürün en kritik aşamalarından biridir çünkü sonraki boyama ve görüntüleme işlemlerinin başarısı, derinin zarar görmemesine bağlıdır. Bu şekildeyenen uzuv derisi, dört uzuvdan da kolayca soyulabilmesi için uzuvdan rahatça ayrılır. İlk olarak, uzuvu ventral tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin.Ardından ince cımbızlar kullanarak, ekstremite tabanının yakınındaki deriyi pençeye doğru düz bir hat boyunca diseke edin. Sonra, ekstremiteyi döndürerek deriyi soyarken tüm ekstremite boyunca diseksiyon yapın. Deriler soyulduktan sonra.Dört ekstremitenin deri bütün boyama immünohistokimyasal boyamasına başlanmadan önce hazırlıklar yapılır. Yeniden hidratasyon için PBT içerisinde %75, %50 ve %25 metanol içeren üç adet 50 mililitrelik stok tüp hazırlanır. Deriler, yani ekstremite derileri, en yüksekten en düşüğe doğru sıralanmış metanol serilerinde beşer dakika inkübe edilerek yeniden hidrate edilir.Başlamak için ekstremite derisini, PBT içinde %75 metanol içeren beş mililitrelik polipropilen yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın. Mutator karıştırıcıda beş dakika beklettikten sonra, %75 metanolü dikkatlice aspire edin ve tüpü %50 metanol ve PBT ile yeniden doldurun. Beş dakika sonra.%50 metanolü, %25 metanol ve PBT ile değiştirin. Son inkübasyonun sonunda, %25 metanol PBT'yi dikkatlice aspire edin ve tekrar PBT ile doldurun.Eklem derilerini, mutator karıştırıcıda oda sıcaklığında nazikçe karıştırarak beş dakika boyunca yıkayın. Bu yıkama işlemini bir kez tekrarlayın. Çözelti değişimi sırasında eklem derilerine zarar vermemeye dikkat edin.Uzuv derileri yeniden hidrate edildikten sonra, uygun bloklama tamponu ile bloklayın. Oda sıcaklığında, nutt karıştırıcıda hafif karıştırma ile iki saat boyunca inkübe edin. İki saat sonra, uzuv derilerini 35 by 10 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. Ardından, derileri uygun bloklama tamponunda seyreltilmiş 800 mikrolitre primer antikor içeren iki mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarmak için halka pens kullanın.Burada, farklı türlerden türetilmiş birden fazla primer antikor aynı anda kullanılabilir. Uzuv derilerini, mutator karıştırıcı üzerinde hafifçe karıştırarak 4 °C'de gece boyunca inkübe edin; ertesi gün, uzuv derilerini 35 x 10 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin. Derileri, 4 L uygun yıkama tamponu içeren 5 mL'lik polipropilen yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın.Oda sıcaklığında mutator karıştırıcıda hafif karıştırma ile 15'er dakikadan beş kez yıkayın. Yıkama işlemleri sırasında her yıkama için kullanılmış tamponu dikkatlice yenisiyle değiştirin. Sekonder antikorlardaki agregasyon oluşmuş partikülleri gidermek için sekonder antikorları hazırlayın.Sekonder antikor çözeltisini 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne filtrelemek için 0,22 mikronluk bir PVDF membran şırınga filtresi kullanın. Ardından, partikülleri ve hava kabarcıklarını gidermek için filtrelenmiş örneği 4 °C'de 10 dakika boyunca 15.000 RPM'de santrifüjleyin. Filtrelenmiş antikor çözeltisini iki mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne toplayın.Beş yıkama işlemi tamamlandığında, ekstremite derilerini 35 by 10 millimeter'lik bir Petri kabına yerleştirin ve ardından bunları, bloklama tamponu içerisinde 800 microliters sekonder antikor içeren iki litrelik bir mikrofüj tüpüne aktarın. Bu adımda, farklı türlerden elde edilmiş farklı floresan konjuge sekonder antikorlar eş zamanlı olarak kullanılabilir. Ekstremite derilerini oda sıcaklığında, mutator karıştırıcıda hafifçe karıştırarak bir saat boyunca karanlıkta inkübe edin.Bir saatlik inkübasyonun ardından, ekstremite derilerini 35 by 10 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin ve ardından dört mililitre uygun yıkama tamponu içeren beş mililitrelik polipropilen yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın. Konfokal mikroskopi ile görüntüleme yapmak üzere, oda sıcaklığında Tator karıştırıcıda hafif karıştırma ile karanlıkta, her biri 15 dakika süren beş yıkama işlemi gerçekleştirin. Ekstremite derileri, immünohistokimyasal boyamanın ardından bir lam üzerine monte edilmelidir.Bu prosedüre başlamak için, düşük aydınlatma altında bir stereo mikroskop altında çalışarak, boyanmış ekstremite derilerini 35 x 10 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. Yaygın fotobeyazlamayı önlemek için, derilerin iç tabakasındaki toz kristallerini ve lifleri ince bir cımbızla temizleyin. Ekstremite derilerini yapışkanlı bir mikroskopi lamına aktarın.Deri parçalarını, iç tabaka lam üzerine gelecek şekilde, lamel ile karşı karşıya gelecek şekilde yerleştirin. Ardından, ince cımbızlar kullanarak deri parçalarını dikkatlice düzleştirin. Kalan yıkama tamponunu Kim wipe ile temizleyin.Deri örneklerine Antifa montaj medyumu ekleyin ve örneklerin üzerine 25 x 25 boyutunda bir lamelle kapatıcı cam yerleştirin. Hava kabarcığı oluşmamasına dikkat ederek, örneklerin uzun süreli saklanması için oda sıcaklığında, karanlıkta ve düz bir yüzeyde kürlenmeye bırakın. Kapatıcı camı oje ile lama sabitleyin ve 4 °C'de saklayın.E 15.5 evresindeki fare ekstremite derisindeki sinirlerin ve kan damarlarının paternlenmesi, bütün mount üçlü etiketli konfokal immünofloresan mikroskopi ile elde edilen bu temsili sonuçlarla gösterilmiştir; pan endotelyal hücre markörü pcam one mavi renktedir. Nörofilament markörü two H three yeşil, düz kas hücresi markörü alpha SMA ise kırmızı renktedir. Bu görüntüler, kan damarı dallanmasının yanı sıra, açık oklarla belirtilen two H three periferik sinirleri ile hizalı, beyaz ok başlarıyla gösterilen alpha SMA pozitif arterlerin karakteristik dallanma paternini ortaya koymuştur.Bu ekstremite deri vaskülatür modeli, kırmızıda gösterilen lenfatik endotel hücresi belirteci LYVE1 ve yeşilde gösterilen neuropilin-2 kullanılarak lenfatik damar dallanmasının örüntülenmesini de ortaya çıkarabilir; lenfatik damarlar hem LYVE1 hem de NRP2 ile görselleştirilirken, LYVE1 aynı zamanda açık ok uçlarıyla belirtilen bir grup makrofaj tarafından da eksprese edilir. Bu teknik, vasküler biyoloji alanındaki araştırmacıların doku gelişimi, doku onarımı ve hastalık durumlarında vaskülatürün karmaşık örüntülenmesini ve diferansiyasyon süreçlerini keşfetmelerinin yolunu açmaktadır.

whole-mount-immunohistochemical-analysis-for-embryonic-limb-skin

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu makale, embriyonik deri ve timüs kan damarlarının etiketlenmesine yönelik bir yöntem açıklanmaktadır.

Embriyonik Farelerde damarları Etiketleme Bir Yöntem

Yenidoğan fare retina bir anjiyogenez modüle farklı genler ya da uyuşturucu rolleri soruşturma izin anjiyogenez bir iyi karakterize fizyolojik modeli...

Anjiyogenez Araştırma Yenidoğan Fare Retina Tüm Dağı Immunofluorescent Boyama<em&gt; In vivo</em

Vaskülarizasyon başarılı doku mühendisliği yaklaşımları anahtarıdır. Bu nedenle, güvenilir teknolojileri doku yapıları vasküler ağların gelişimini değerlendirmek için gereklidir. Burada görselleştirmek ve in vivo damarlanmayı ölçmek için basit ve maliyet-etkin bir yöntem mevcut.

A Tam Cilt Hata Modeli Biyomateryallerin vaskülarizasyonunu değerlendirin<em&gt; In Vivo</em

Bu izole edilmiş ve iyi karakterize edilmiş bir ortamda in vivo damarlanmayı analiz etmek için bir model olarak bir arteriovenöz (AV) döngü üretilmesi için bir mikro yaklaşımı açıklar. Bu model yalnızca anjiyojenezde araştırılması için yararlıdır, ama aynı zamanda en iyi şekilde mühendislik eksenel vaskülarize ve transplante dokuların için uygundur.

Bir Küçük Hayvan Modelinde Arteriovenöz (AV) Döngü Anjiogenez ve Vaskülarize Doku Mühendisliği Eğitim için

Biz optik açıklık ve konfokal mikroskobu ile takip standart immünolojik boyama yöntemleri kullanarak, E15.5 kadar bütün embriyonik fare kalplerinde koroner damarların analizi için bir protokol mevcut. Bu teknik, dizi bölgelerinin zaman alıcı analizi için gerek kalmadan tüm kalp boyunca kan damarlarının görselleştirme sağlar.

Temizlendi Embriyonik Kalpler Koroner Damarlar Analizi

Bu protokol, vaskülatürü görselleştirmek ve Xenopus tropicalis'deki karmaşıklığını niceleştirmek için flüorüre dayalı bir yöntemi göstermektedir . İn vivo kardiyovasküler gelişimi incelemek için genetik ve / veya farmakolojik manipülasyonlardan sonra bir embriyonun kalp atımına floresan bir boya enjekte edildikten birkaç dakika sonra kan damarları görüntülenebilir.

Embriyonik Anjiyojenezin Görselleştirilmesi ve Nicel Analizi<emXenopus tropicalis</em

Bu çalışma, mikroskopik gözlem için tüm montaj dokusu hazırlığının ardından meme yağ padi transplantasyonu yoluyla vasküler endotel kök hücrelerinin (VESC'lerin) çoğalmasını, farklılaşmasını ve damar oluşturma potansiyelini değerlendirmek için yeni bir yaklaşımı göstermektedir. VESC'lerin in vivo davranışlarını araştırmak için bir soy izleme stratejisi de sunulmuştur.

Vasküler Endotelyal Kök Hücrelerin Damar Oluşumunu Görselleştirmek İçin Yeni Bir Göğüs Göğsü Transplantasyon Tekniği

Burada, dallanma morfogenez ve periferik sinirler ve kan damarları yanı sıra bağışıklık hücre dağıtım desenlendirme görselleştirmek sağlayan tüm yetişkin fare kulak deride bir yüksek çözünürlüklü bütün Dağı görüntüleme yöntemi açıklanmaktadır.

Bütün-Confocal mikroskobu yetişkin kulak cilt için mount: nöro-vasküler dallanma morfogenez ve bağışıklık hücre dağıtım modeli sistemi

Bu tahlil, filizlenen anjiyogenezi in vitro olarak kontrol eden biyolojik süreçleri analiz etmek için 3D-kollajen jel içinde kültürlenmiş embriyoid cisimlere farklılaştırılmış fare embriyonik kök hücrelerini kullanır. Bu teknik, ilaçları test etmek, hastalıkları modellemek ve embriyonik olarak ölümcül olan delesyonlar bağlamında spesifik genleri incelemek için uygulanabilir.

In Vitro Vasküler Hastalık Modellemesi ve İlaç Testi için Fare Embriyonik Kök Hücreleri Kullanılarak Anjiyogenezin Üç Boyutlu Filizlenme Testi

Bu protokol, FVB farelerde arka bacak kangrenini indüklemek için femoral arter ve ven elektrokoagülasyonunu nitrik oksit sentaz inhibitörü uygulamasıyla birleştiren benzersiz, klinik olarak ilgili bir periferik arter hastalığı modelini tanımlamaktadır. İntrakardiyak DiI perfüzyonu daha sonra ayak yastığı vaskülatürünün yüksek çözünürlüklü, üç boyutlu görüntülenmesi için kullanılır.

Murin Arka Ekstremite Kangren Modelinde Footpad Vaskülatürünün Yüksek Çözünürlüklü Üç Boyutlu Görüntülenmesi

Bu protokol, ışık tabakası floresan mikroskobu kullanılarak kantitatif tam montajlı üç boyutlu vasküler görüntüleme için hızlı bir yöntem sunar. Yöntemin etkinliği, civciv embriyo modelinin faringeal ark arter sistemi kullanılarak, hesaplamalı akışkanlar dinamiği yoluyla ölçülen hemodinamik kuvvetler ile gösterilmiştir.

Kantitatif Çalışmalar için Küçük Hayvan Damar Sisteminin Hızlı Tam Montajlı Yüksek Çözünürlüklü Görüntülenmesi

Keşfedin fare embriyo ekstremite cilt damarlarının tüm montaj immünohistokimyasal analizi ile gelişimsel biyolojide vasküler ağ oluşumunu. Bu yöntem konfokal mikroskopi kullanarak yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar.

Embriyonik Ekstremite Cilt damarları Tüm montaj İmmünohistokimyasal Analizi: Embriyo vasküler dallanma Morphogenesis Eğitim Model Sistemi (Video) | JoVE Journal

Embriyonik Ekstremite Cilt damarları Tüm montaj İmmünohistokimyasal Analizi: Embriyo vasküler dallanma Morphogenesis Eğitim Model Sistemi

Daha fazla video keşfet