Uzun menzilli DNA Etkileşimleri belirlenmesi için İlişkili Kromozom Tuzak

Aşağıdaki deneyin genel amacı, uzun menzilli ilişkili DNA ortaklarını keşfetmek ve tanımlamaktır. Bu, ilk kısıtlama enzimi tarafından DNA'nın fiksasyonu, hücre lizisi ve sindirimi ve ardından iki ilişkili genden segmentlerden oluşan kimerik bir DNA oluşturmak için ligasyon ile elde edilir. Daha sonra, ikinci kısıtlama sindiriminden sonra kimerik DNA'ya bağlayıcılar eklenir Amplifikasyonunu kolaylaştırmak için, daha sonra ilişkili DNA fragmanlarından yeterli miktarda elde etmek için bağlayıcı ve yem DNA'sına özgü primerler kullanılarak PCR amplifikasyonu gerçekleştirilir Amplifiye edilmiş DNA fragmanlarının dizi analizine dayalı olarak yem DNA'sı ile uzun menzilli ilişkili DNA ortaklarını gösteren sonuçlar elde edilir.

Bu tekniğin kromozom doğrulama yakalama veya üç C gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, ACTS'nin bilinmeyen uzun menzilli bir ilişkili DNA partnerini etkili bir şekilde tanımlamak için kullanılabilmesidir. Oysa üç C, yalnızca daha önce şüphelenilen etkileşimlerin doğrulanması için ortaya çıktı. Bu protokol kültürüne başlamak için, bir inkübatördeki insan hücreleri, %80 ila 90 birleşene kadar 37 santigrat derecede %5 karbondioksit ile beslenir.

Bu gösteri için insan balo asidik lösemi hücreleri kullanılır. Hücreleri 50 mililitrelik bir NOC tüpüne dökerek toplayın ve 1200 RPM'de 15 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi takiben, ortamı aspirasyon ile çıkarın.

Hücre peletlerini yeniden süspanse etmek için beş mililitre kültür ortamı ekleyin. Hücreleri bir hemo sitometre ile saydıktan sonra,% 10 FBS içeren ortam olan RPMI 1640 ile 40 mililitrelik bir hacme yaklaşık bir kez 10 ila yedinci hücreler alın. Daha sonra seyreltik kromatini sabitlemek için 1.7 mililitre% 37 formaldehit ekleyin.

Numuneyi oda sıcaklığında hafifçe çalkalayarak 10 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, reaksiyonu 2.4 mililitre iki molar glisin ile söndürün. Ardından, numuneyi 1200 RPM'de ve dört santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin.

Süper natini çıkardıktan sonra, peleti bir kez 40 mililitre buz gibi soğuk PBS ile yıkayın, ardından yıkanmış hücre peletini almak için numuneyi santrifüjleyin, elde edilen peleti yeni eklenmiş proteaz inhibitörleri ve 0.1 milimolar PMSF ile 40 mililitre buz gibi soğuk lizis tamponunda yeniden süspanse edin, numuneyi 90 dakika boyunca rotasyonla soğuk bir odada inkübe edin. Son olarak, numuneyi 2.500 RPM'de 15 dakika santrifüjleyin ve süper natini çıkarın ve izole edilmiş çekirdekleri elde edin. Çekirdekleri 0,5 mililitre bir XNEB tamponu üç içinde yeniden süspanse edin ve 15 mikrolitre% 10 SDS ekleyin.

Numuneyi 37 santigrat derecede çalkalayarak bir saat inkübe edin. Daha sonra SDS'yi ayırmak için 45 mikrolitre %20 Triton X 100 ekleyin ve 37 santigrat derecede bir saat boyunca çalkalama ve altıda bir kez 10 alikot ile tekrar inkübe edin. Çekirdekler veya yaklaşık 15 mikrogram, 55 mikrolitre çekirdek çözeltisine kısıtlama enzimi sindirimi için kullanılır.

433 mikrolitre bir XNEB tamponu üç ve 12 mikrolitre BGL iki ekleyin. Toplam 500 litrelik bir sindirim reaksiyonu hacmi yapmak için, reaksiyonu gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün 95 mikrolitre %10 SDS ekleyerek kısıtlama enzimini etkisiz hale getirin ve 65 derecede 20 dakika ısıtarak enzimi denatüre edin.

Bir su banyosunda yedi mililitre bir x ligasyon tamponu ve 360 mikrolitre %20 Triton X 100 ekleyin. Numuneyi 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Sıcaklığı 16 santigrat dereceye düşürün ve mikrolitre başına 50 mikrolitre 400 birim ekleyin.

T dört DNA Ligaz. Ligasyon reaksiyonunun 16 santigrat derecede dört saat ve ardından oda sıcaklığında 30 dakika inkübe etmesine izin verin. Ligasyon tamamlandıktan sonra, 300 mikrogram proteinaz K ekleyin ve gece boyunca 65 santigrat derecede inkübe edin.

Daha sonra beş mikrogram RNAA ekleyin ve 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. DNA'yı fenol kloroform ekstraksiyonu ile saflaştırın ve DNA'yı izopropanol içinde çökeltin, çökeltilmiş DNA'yı 150 mikrolitre steril damıtılmış suda çözün. Kimerik DNA'ya bağlayıcılar eklemek için, önce iki mikrogram saflaştırılmış DNA'yı beş birim msp ile inkübe ederek DNA'yı, biri sindirimi takiben dört ila altı saat boyunca 37 santigrat derecede, MSP'yi 10 dakika boyunca 65 derecede inaktive ederek sindirin.

Daha sonra DNA'yı etanol içinde mililitre başına beş miligramlık bir mikrolitre ile çökeltin. Glikojen, elde edilen DNA damağını 50 mikrolitre steril damıtılmış suda çözer. Daha sonra, 50 mikrolitre MSP, bir işlenmiş DNA'yı iki mikrolitre 20 mikromolar bağlayıcı oligonükleotid L ve bir mikrolitre 20 mikromolar oligonükleotid S ile karıştırın, ardından bir mikrolitre steril damıtılmış su ve altı mikrolitre 10 XT dört DNA Ligaz tamponu ekleyin.

Karışımı sıvı balmumu ile örtün. Oligonükleotidleri bir dakika boyunca 50 santigrat derecede denatüre edin ve dakikada 0,5 santigrat derece gradyanda kademeli olarak 10 santigrat dereceye kadar soğumaya bırakın. Bir termal döngüleyici kullanarak, mikrolitre T dört DNA ligaz başına bir mikrolitre 400 birim ekleyin ve reaksiyonu gece boyunca 15 santigrat derecede inkübe edin.

Ertesi gün, bir kaya hızlı PCR saflaştırma kiti kullanarak bağlayıcı bağlı DNA'yı saflaştırın ve 50 mikrolitre steril damıtılmış su içinde boşaltın. Uzun menzilli etkileşimler için araştırılacak DNA'nın spesifik bölgesi için bir astar seçin. Bu örnekte, Abel astar veya yem olarak kullanılacaktır.

Saflaştırılmış DNA'nın bir mikrolitresini bir mikrolitre 20 mikromolar özellikli bir spesifik primer, 46 56 ve bir mikrolitre 20 mikromolar bağlayıcıya özgü primer 29 63 ile birleştirerek saflaştırılmış DNA'yı ilk tur PCR için hazırlayın. Daha sonra, yazılı protokole göre daha önce 32 P-D-C-T-P ile karıştırılmış üç mikrolitre üç x ClinTech, DNA polimeraz bir kokteyl ve ardından üç mikrolitre steril damıtılmış su ekleyin. PCR döngüsü tamamlandıktan sonra yazılı protokolde açıklanan sıcak başlatma PCR termal döngüsünü kullanarak PCR amplifikasyonunu gerçekleştirin.

İlk tur PCR ürünlerini 30 mikrolitre steril damıtılmış suda bir kaya hızlı PCR saflaştırma kiti Elute kullanarak saflaştırın. Bir mikrolitre 20 mikromolar özellikli bir spesifik primer, 46 26 ve bir mikrolitre 20 mikromolar bağlayıcıya özgü primer ekleyerek iç içe geçmiş primerler kullanarak ikinci bir PCR turu gerçekleştirmek için 100 kez seyreltilmiş ilk PCR ürününün bir mikrolitresini kullanın. 29 61.

Yine, üç mikrolitre üç x ClinTech, DNA polimeraz, bir kokteyl ve üç mikrolitre steril damıtılmış su ekleyin. 20 saniye boyunca 95 santigrat derecede 25 döngülük bir termal döngü programı kullanarak ikinci PCR turunu gerçekleştirin. 67 saniye boyunca 40 santigrat derece ve bir dakika boyunca 72 santigrat derece, ardından beş dakika boyunca 72 santigrat derecede bir uzatma.

%5'lik bir üre sayfa jeli çalıştırarak ve ardından açıkta kalan ekranı bir fosfo görüntüleyicide tarayarak PCR ürünlerini görselleştirin. Her bir PCR bandı, jel şeritlerinin 60 mikrolitre steril damıtılmış su içeren bir einor tüpünde çözülmesi ve 95 santigrat derecede beş dakika inkübe edilmesiyle jelden geri dönüştürülebilir. Merkezkaç. Çözünmüş jel ürünleri, 10 saniye boyunca 10.000 RPM'de kısa bir süre.

Tüm örnekleri toplamak için. Birincil onarım ile PCR gerçekleştirmek için DNA şablonu olarak kullanmak üzere bir mikrolitre çıkarın. 29 61 46 26.

Yukarıda tarif edilenle aynı koşullar kullanılarak, saflaştırma ve dizilemeden sonra, kromozomal konumu belirlemek için çevrimiçi bir araçla analiz yapılabilir. Genom biyoinformatik sitesine girdikten sonra, yeni bir pencere oluşturmak için blatt'a tıklayın ve DNA dizisini yapıştırın. DNA dizisini gönderdikten sonra, BLATT arama sonuçları görünecektir.

DNA dizisinin yerini ortaya çıkarmak için %100 kimlikli isabetteki tarayıcıya tıklayın. Yetenekli bir bölge, uzun menzilli DNA etkileşimlerini belirlemek için yem olarak kullanıldı. PCR primer setinin ikinci turunda A CT testi için iki BGL, iki bölge ve bir BAM H bir bölge seçildi, 46 26 29 61, yetenekli M1'i amplifiye etmek için kullanıldı, 46.30 29 61, yetenekli M iki için kullanıldı ve 46, 36 29 61, yetenekli M üç için kullanıldı.

Tipik bir jel modeli, burada able M1, able M two ve able M three için burada gösterildiği gibi bir ila birkaç bant ortaya çıkarır. Klonlanabilen M1'in DNA dizisinin, bir A CT testinden elde edilen her bir parçanın iki birleşik DNA segmentinden oluştuğunu gösterdiği gösterilmiştir. Bir segment yem DNA bölgesinden türetilirken, ikinci segment ilişkili partnerden gelir.

Segmentler, ilk kısıtlama enzimi tanıma dizisi ile birbirine bağlanır. İkinci enzim tanıma dizisi, ilişkili ortak dizinin sonunda görünecektir. Klonlanmış able M1 fragmanı, dokuzuncu kromozom Q 32.4'te bulunan ABLE bir bölgesinden DNA içerir ve ilişkili partner, prok iki olarak tanımlanan kromozom üç P üç'te bulunur.

Benzer şekilde, able M iki ilişkili partner, kromozom beş Q 21.1'e lokalize edilirken, klonlanabilir M üç, üç C testinin aksine, ABLE bir lokusunun yakınında bir kromozom içi ilişki olarak tanımlandı. Bu videoda özetlenen metodoloji, en yaygın uzun menzilli etkileşimleri seçecektir. Bununla birlikte, PCR R döngülerinin sayısını artırarak, fare fiberblast hücrelerinde yem DNA'sı olarak IGF iki H 19 lokusunda baskı ve kontrol bölgesi veya ICR kullanılarak daha az sıklıkta ek ilişkileri tanımlamak da mümkündür, A CT testinde PCR'nin birinci ve ikinci turlarında farklı döngü programları uygulanmıştır.

A CT testi, nükleer mimarideki farklılıkları ve normal hücreler ile kanser hücreleri arasındaki uzun vadeli etkileşimleri tanımlamak için de kullanılabilir. Normal kolon dokusu ve kolon kanseri dokusu homojenize edildi ve burada anlatılan prosedürleri takiben A BT testi yapıldı. Burada gösterilen, IGF iki H 19 lokusu ve IGF iki gen dpn'deki ICR bölgesinin DNA yapısıdır.

A CT testi için iki bölge etiketlenmiştir: ikinci turda kullanılan primerler, PCR farklı renklerde oklar ve sayılarla etiketlenir. A CT testinin jel modeli, 41, 61, 41, 63, 51, 45 ve 51 51 primer çifti ile primer 29 61 kullanılarak yapılan PCR sonuçlarını temsil eder. Sadece normal kolon dokusunda görülen benzersiz bantlar sarı oklarla, sadece kolon kanseri dokusunda görünen bantlar ise gelişiminden sonra kırmızı oklarla işaretlenir.

Bu teknik, pazar biyolojisi alanındaki araştırmacıların nükleer mimariyi ve gen düzenlemesini üç boyutlu olarak keşfetmelerinin önünü açıyor.