Name: Fibröz Proteinler gerin ve Tedbir Roman Yerçekimi Kuvveti Spektrometresi kullanır gösterilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-19T11:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 51 s
Description: Öğrenin, yerçekimi kuvvet spektrometresi ile tek moleküllü analiz yapmayı ve moleküler kuvvet ölçümlerini nasıl gerçekleştireceğinizi. Bu yöntem sinirbilim ve biyofizik araştırmalarında değerli bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu malzeme, çalışma, Ulusal Bilim Vakfı Hibe No: 0842736 altında tarafından desteklenen dayanmaktadır.

Roman GFS Yapılandırma Giriş Düzenli bir ışık mikroskobu, bir ekvatoral montaj, kamera ve bilgisayar [Şekil 1]: GFS birkaç temel bileşenleri içerir. Örnek tutan kapalı bir akış hücre odası GFS tasarımına göre vazgeçilmezdir. Işık mikroskobu kapsamında uzayda farklı yönlerde döndürülebilir, böylece ekvatoryel kundak üzerine monte edilir. Bu yetenek, statik ağırlık vektör yerçekimi kuvveti örnekleri piconewton menzilli kuvvet yükleri aktarabilir örnekleri, vektör ile ilgili dinamik odaklı böylece istismar olanak sağlar. Kamera, ışık mikroskobu oküler lens yerine, bu yönde örnek değişiklikleri kaydedebilirsiniz. Bu ham veri sayısallaştırılmış ve gerçek gücü ve mesafe ölçümleri içine verileri yorumlamak için bilgisayar tarafından manipüle. Kapalı akış odacıklı örnek kaybı olmadan uzayda özgürlüğü tüm dereceler izin verecek şekilde tasarlanmıştır. Odasında odasının yüzeyine yapıştırılmış bir "demirlemiş" boncuk bir ucuna yakın gergin örnek molekülü bulunur. Ters terminus odasının yüzeyinden bir "cep" boncuk bağlı. Bu, yerçekimi kuvveti, böylece bu kadar düşük kuvvet yükleri gergin bir molekül uzanan üzerine hareket olabilir tahlil tampon ücretsiz mobil boncuk [Şekil 2]. Iki boncuk akış odasının yüzey üzerinde oturan çiftleri bir molekül bağlılığını birleştiğinde iyi kullanılabilir çiftleri ayırt etmek biraz tecrübe sürer rağmen basit örnek, mikroskop altında mikroküreler bir çift gibi görünüyor. Sisteme bir değişiklik GFS tutan ve yaylar tarafından askıya alınır bir yüzer platform ektir. Bu yapılandırmada, bir zamanlar örnek yerçekimi kuvveti örnek üzerinde hareket edebilir bir konuma döndürülmüş, platform ve tüm bileşenler sabit bahar karşı düşmüş olabilir. Serbest düşüş civarında, mobil boncuk üzerine etki eden kuvvet sıfıra yakındır ve yaylar maksimum uzantısı, iki kez olduğunca yerçekimi kuvveti ile çarpılır. Bu şekilde, kademeli bir kuvvet / mesafe yanıt farklı kuvvet yükleri tek bir molekülün davranışlarını ölçmek için grafikle gösterilebilir. 1. Microsphere Hazırlık <ol><li> 0.04% 3-iki dakika Aminopropyltriethoxysilane (aseton ile kesilen) cam veya silika boncuk yaklaşık 10 mg Submerge. </li><li> Iki değişiklik çift distile su ile yıkayın ve 5 dakika boyunca 2000 XG pelet için santrifüj. Süpernatant atın. </li><li> Kaplin tamponu (0.01 M piridin çift distile su ile kesim ve pH 6,0 'a ayarlayın) 5 ml ekleyin ve bu karışımı kuvvetlice sallayın. Yukarıda açıklandığı gibi santrifüjleyin. Bu adımı üç kez tekrarlayın. </li><li> Boncuk ıslak kek için, (kaplin tampon gluteraldehid kesmek) 2 ml% 5 gluteraldehid çözüm ekleyin. Çalkalanır. </li><li> Kaputun altında, oda sıcaklığında 3 saat / gluteraldehid karışımı boncuk döndürün. </li><li> Yukarıdaki gibi Santrifüj ve süpernatant aspire. </li><li> Şiddetle sallayarak kaplin tampon 5 ml boncuk yıkayın ve süpernatant santrifüj ve aspire. Bu üç kez daha tekrarlayın. </li><li> Boncuklar istenilen antikor yaklaşık 15 mcL ekleyin ve şiddetle çalkalanır. Boncuk 16-24 saat boyunca rotasyona tabi tutulmalıdır. </li><li> Kaputun altında, 1 M glisin su verme solüsyonu 5 ml (glisin çift distile su ile kesme ve pH 7.0 'ye ayarlamak) ekleyin. Bu karışımı kuvvetlice çalkalayın ve 30 dakika çevirin. </li><li> Santrifüj ve süpernatantı aspirat. </li><li> Yıkama tamponu (% 0,1 sodyum azid;% 0,1 BSA, 0.15 M NaCl ve 0.001 M EDTA 0,01 M Tris, pH 7.0) 5 ml ekleyin. Şiddetle bu çalkalayınız, santrifüj ve süpernatantı aspirat. Bu adımı üç kez tekrarlayın. </li><li> Düşük tuz tamponu (0.02 M imidazol; 5 mM MgCl 2; pH 7.0 'ye uyum 0,1 M KCl) tamponu değiştirin. Üç kez tekrarlayın. </li></ol> 2. Örnek Eklenti için Mikroküreler <ol><li> Hazırlanan boncuklar küçük bir miktar alın ve bunları eklemek (partiler arasında çapı büyük bir tutarsızlık varsa, ancak yaklaşık 2 mcL boncuklar her pasta, büyük ve küçük boncuklar 8:1 oranı etrafında kullanımı avantajlıdır.) tahlil tamponu ile mikrosantrifüj tüp. Tahlil tampon kullanarak, yaklaşık 5 mcM protein konsantrasyonu azaltın. Tampon, protein ve boncuklar dahil olmak üzere en az 400 mcL toplam hacmi hazırlayın. </li><li> (Protein, çok ajite ise, agrega ve işe yaramaz hale), 3 saat boyunca yaklaşık 1 RPM bu karışımın döndürün. </li></ol> 3. Slayt Odası Hazırlık <ol><li> % 0.01 nitroselüloz (amil asetat) ile kalın bir mikroskop lamı ceket. Bu slayt yaklaşık 10 dakika kurumasını bekleyin. </li><li> Keskin bir cam kesici ile bir oda yapmak için slayt kapsayacak şekilde kesti. Bu dört cam strip gerektirir. </li><li> Aslında kullanın.kenarının her iki tarafında vakum gres bir karalama karşısında cam ve komisyon bu ORY kenarı. </li><li> Basın yağ kaplı şeritler kuru nitroselüloz üzerine slayt yüzeyinde bir kutusu oluşturmak için slayt kaplı. </li><li> Kutu içinde cam yüzeye pipetter dokunarak boncuk / protein karışımı Pipet 2 hakkında mcL. </li><li> Yaklaşık 20-400 mcL, odanın ne kadar büyük bağlı olarak düşük tuz tampon ekleyin. </li><li> Zaten kapalı ve tamponlu odasına bitirmek için vakum yağ ile kaplı kutunun üstüne bir kapak kayma basın. </li><li> Boncuk nitroselüloz kendilerini demirlemek için yeterli zamanımız var, böylece slayt düzeyde bir yere oturup edelim. </li></ol> 4. GFS Veri Toplama <ol><li> GFS sahneye Dağı slayt </li><li> GFS kamera küçük Microsphere büyük Microsphere ekvatora yakın bağlı olduğu ", boncuk çiftleri" kayıt ve meşru araştırın ne olduğunu izleyin. </li><li> Potansiyel bir boncuk çifti bulunduğunda, "cep" boncuk slayt yüzey üzerine oturtulmuş olup olmadığını belirlemek için, odak derinliği üzerinden gitmek. </li><li> Bir kere uygun bir çifti tanımlanır, not açısı mobil boncuk d max uzak (d max = birleştiğinde mikroküreler sentroidler arasındaki maksimum mesafe). Kapsamı video satın almak için pozisyon içine taşıyın. </li><li> GFS seyahat açı d min, d max, molekülünün uzunluğuna bağlı olarak 25-90 derece diyebilirsiniz d dakika kayıt için yeterli olmalıdır. </li><li> Çifti olarak RECORD d d min max ve geri d dk gitti. </li><li> Bu analiz için daha sonra çıkarılmalıdır, böylece arka planda da bir film çekmek için iyi bir fikirdir. </li><li> GFS damla performans, d max kapsamı taşımak ve en az saniyede 60 kare hızla açılan kaydetmek. Kritik bir parçası ilk salınım, ancak uzun kayıt süreleri, aynı zamanda dinamik çalışma için kullanılabilir. </li></ol> 5. GFS Veri Analizi <ol><li> Dijital "eşiklenir" bir görüntü içine ham video Dönüşümü ve video her kare her boncuk ağırlık merkezi konumunu belirlemek için ImageJ makro çalıştırmak. Bu açılan video için de. </li><li> X, Y ve Excel'e ImageJ alan veri dökümü ve puan arsa. </li><li> Uygun bir boncuk çifti video tarafından satın alındı, grafik gözle görülür bir kambur boncuk (d min) en yakın olmanın göstergesidir ve grafik apeks d max konumudur. </li><li> Bu verileri kullanarak, her bir boncuk yarıçap tam ImageJ belirlenir ve tüm bu bilgiler iç içe denklemi içine konur: d = [(g sin α) 2 + (g cos α + d max - g) 2] 0.5 g = [d min 2 + r b 2 - (r + r b) 2] 0.5 = r b günah β c = d max - r - g (D = kütle merkezleri arasındaki mesafe; g = yerçekimi kuvveti; α = paralel derece objektif lens açısı, r b = mobil boncuk yarıçapı r = yarıçap demirlemiş boncuk ekseni kapalı eki β = açı ekvator bağlantılı boncuk. </li><li> Hacmi de verim ve boncuk, mobil boncuk molekülün kazandırır kuvvet yoğunluğu göz önüne alındığında, mobil boncuk takılmış yarıçapı kullanarak çıkarılır solvent kaldırma kuvveti sonra piconewtons hesaplanabilir. Bu yöntem piconewtons gergin bir molekül kuvvet F = V (db) bir (F = kuvvet, V = hacim, d = yoğunluk cam Microsphere, a = ivme ölçer ve nanometre antikor ekleri arasında mutlak molekül süresini hesaplar yerçekimi nedeniyle, b = yerinden su yoğunluğu). </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar: Boncuk hazırlık doğru yapılırsa, hala arada bir boncuk tutam olabilirse de, en az boncuk agregasyonu olacak. Kapsamı ile bakıldığında, odanın içinde eşleştirilmiş olsun veya olmasın boncuk makul bir dağıtım olması gerekir. Mümkün olduğunca titreşimleri en aza indirmek için önemlidir; bu ya bir hava tablo yapmak için, bir EQ monte tutan bir tripod için özel şok emici ayaklar, veya yayları titreşim izolasyonu için kullanılabilir kullanan sistem. Mühürlü akış odası ile ilgili bir diğer yararlı ipucu tam olarak inşa edildikten sonra bir seviye tablosunu yaklaşık beş dakika boyunca ayakta izin vermektir. Bu herhangi bir unattached boncuk büyük nitroselüloz tabakası tampon ve dinlenme ile şamandıra sağlar. Slayt yerine tamamlanması üzerine doğrudan monte edilmiş olsaydı, araştırmacı tam anlamıyla görüş alanı üzerinden uçan boncuklar ile başa çıkmak için sürekli olurdu ve bu video edinimi sırasında olur th bozabilire deney. Bu şekilde yapılırsa, boncuk uçuş önemli ölçüde en aza indirilmeli ve temiz bir video sonuçları. Potansiyel bir boncuk çifti GFS operatör tarafından tespit edildiğinde, bu çiftin davranışlarını izlemek için bir ön döndürme koymak için yararlıdır. Nadiren, büyük boncuk slayt sıkıca yapıştırılmış değildir. Bu durumda daha büyük satın alma süresi boyunca sabit bir pozisyonda boncuk kalış demirlemiş kritik, çünkü çifti kullanan hiçbir faydası yoktur. Çifti istikrarlı ve sergi gelmez "Eğer demirlemiş boncuk rulo," o zaman deneyler için uygundur. Yerçekimi göre açı değişim karşısında boncuk ayırma mesafeleri bir arsa elde edilen verileri değerlendirmek için kullanılabilir. Iyi bir temsilcisi sonucu bir plato üzerinde küçük ayrımı gösterecek ve mobil boncuk yerçekimi etkisi nedeniyle bağlantılı boncuk kendini kurtarır gibi, grafiğin daha fazla ayrılık gösterecektir. Güzel bir zirveye ulaştı ve d max denir temel tekrar dönen eğrisi aşağıya doğru başlar kadar bu şekilde devam eder d min [Şekil 1]. İdeal koşullarda, bu imza simetriktir. Olmayan bir temsili bir sonuç tutarsız desenleri ile hiçbir farklı d min-d, max-d min desen gösteren bir grafik göstermek ya da arasında bir toz parçası vardı, belki de belirten tek bir molekül için çok yüksek büyüklüğü siparişleri ayrımlarını göstermek mobil boncuk sadece ekli olmadığı belki de boncuk, veya. Çifti bulma, çekim, işleme ve analiz süreci, uygunsuz boncuk çiftleri itlaf birçok durdurmak boşluklar vardır. Yani, sürecin sonuna kadar almak ve önceki sonuçlar ile tutarlı bir molekülün uzunluğu varsa, bir çok emin orijinal boncuk çifti temsilcisi ve sonuçları dahil edilebilir. Boncuk çiftleri çekim yaklaşık yarısı, iyi bir gününde, meşru bir veri noktası olmayı yoluyla alınmış olabilir. Örneğin, MF20 ve MF30 antikorlar arasında miyozin sarmal bobin uzunluğu, EM veri ve AFM, 100 nm 2,7,8,9 yaklaşım veri olarak bilinir. Sonucu bu uzunluğu birkaç kez ise, örnek toplanmış. Burada sunulan sonuçlar, standart GFS rotasyon deneyleri ve 96 nm ± 5 nm mesafe göstermek, [Şekil 2] MF30 ölçümleri ile yakından kabul eder (miyozin subfragment-2 N-terminus bağlar) ve MF20 hangi literatür değerleri çıkarılabilir miyozin (ışık meromyosin bağlanır) antikor ayırma mesafesi [Şekil 3]. <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 GFS yapılandırma. GFS ana bölümden etiketlenir. <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 GFS prensibinin şematik. Sol tarafta en az mesafede demirlemiş boncuk centroid bir mobil boncuk centroid gösterir. GFS döndürülebilir olduğu gibi, mobil boncuk da gergin molekülünün ekseni ile paralel çalışan yerçekimi vektör ile hizalar. Bu pozisyonda, mobil ve bağlantılı boncuk sentroidler arasındaki mesafe maksimum. Sağ üst GFS film temsili bir dilim gösterir. Sağ alt GFS rotasyon geçiren bir görüntü. <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 grafiğin sol d dakika gösteren Temsilcisi sonucu; 17,78 mikron göreceli bir ayrılık d max ve d boncuklar arasında göreli olarak ayrılması 17.75 mikron temel etrafında dakika dönüş . <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 GFS rotasyon deney ortalama MF20 ve MF30 antikorlar 96 nm arasındaki mesafeyi gösteren Temsilcisi sonuç. Bu S2 yaklaşık uzunluğu temsil eder. <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5 Miyozin II dimer antikor ve / veya aktin ekleri de dahil olmak üzere GFS ile kullanmak mümkün ekleri göstermek için kullanılır. Farklı farklı bölgelerde farklı GFS stratejilerini ölçmek için, ya da miyozin dimer çubuk etki gücü dik paralel olarak uygulamak veya eklenti olanakları sağlar.

<ol><li>Schwaiger, I., Sattler, C., Hostetter, D. R., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myosin+coiled-coil+is+a+truly+elastic+protein+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">The myosin coiled-coil is a truly elastic protein structure.</a> Nat. Mater. 1, 232-235 (2002).</li>
<li>Root, D. D., Yadavalli, V. M., Forbes, J. G., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coiled-coil+nanomechanics+and+uncoiling+and+unfolding+of+the+superhelix+and+alpha-helices+of+myosin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Coiled-coil nanomechanics and uncoiling and unfolding of the superhelix and alpha-helices of myosin.</a> Biophysical Journal. 90, 2852-2866 (2006).</li>
<li>Nishizaka, T., Miyata, H., Yoshikawa, H., Ishiwata, S., Kinosita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbinding+force+of+a+single+motor+molecule+of+muscle+measured+using+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Unbinding force of a single motor molecule of muscle measured using optical tweezers.</a> Nature. 377, 251-254 (1995).</li>
<li>Gawalapu, R. K., Root, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+labeling+and+computational+analysis+of+the+strut+of+myosin%27s+50+kDa+cleft%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Fluorescence labeling and computational analysis of the strut of myosin's 50 kDa cleft.</a> Arch. Biochem. Biophys. 456, 102-111 (2006).</li>
<li>Kellermayer, M. S. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+and+manipulating+individual+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules+Physiol.+Meas%22%5BJournal%5D)">Visualizing and manipulating individual protein.</a> Molecules Physiol. Meas. 26, R119-R153 (2005).</li>
<li>Shimizu, T., Dennis, J. E., Masaki, T., Fischman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axial+arrangement+of+the+myosin+rod+in+vertebrate+thick+filaments%3A+immunoelectron+microscopy+with+a+monoclonal+antibody+to+light+meromyosin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Axial arrangement of the myosin rod in vertebrate thick filaments: immunoelectron microscopy with a monoclonal antibody to light meromyosin.</a> J. Cell Biol. 101, 1115-1123 (1985).</li>
<li>Godfrey, J. E., Harrington, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-association+in+the+myosin+system+at+high+ionic+strength.+I.+Sensitivity+of+the+interaction+to+pH+and+ionic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Self-association in the myosin system at high ionic strength. I. Sensitivity of the interaction to pH and ionic environment.</a> Biochemistry. 9, 886-893 (1970).</li>
<li>Root, D. D., Stewart, S., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+docking+of+myosin+and+actin+observed+with+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Dynamic docking of myosin and actin observed with resonance energy transfer.</a> Biochemistry. 41, 1786-1794 (2002).</li>
<li>Xu, J., Root, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+Selection+during+Weak+Binding+at+the+Actin+and+Myosin+Interface%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Conformational Selection during Weak Binding at the Actin and Myosin Interface.</a> Biophys. J. 79, 1498-1510 (2000).</li>
<li>Sattin, B. D., Pelling, A. E., Goh, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+base+pair+resolution+by+single+molecule+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNA base pair resolution by single molecule force spectroscopy.</a> Nucleic Acids Res. 32, 4876-4883 (2004).</li>
</ol>

Dijital eşiklenir bir temsili bir film dönüştürürken, bu, video, her çerçeve içinde aynı bölgede korumak için eşiklenir bir görüntü için çok önemlidir. , Bir boncuk çifti boncuk birbirlerinden bağımsız hareket nedeniyle, eşiklenir alanlarda herhangi bir sürüklenme boncuk sentroidler arasındaki izafi mesafeleri önemli bir hata da sürüklenme ve tanıtmak için neden olabilir. Eşik alanı kontrol 5 nm 26 nm mesafe ölçümlerinde hata beş kat azalttı. Ayrıca, mesafe ve kuvvet değerleri veren nihai hesaplama önemli boncuklar aras...

<table><tbody><tr><td>3-Aminopropiltrietoksisilan</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>919-30-2</td><td></td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Fisher Scientific</td><td>A18P-4</td><td></td></tr><tr><td>Piridin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>110-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehit</td><td>Fisher Scientific</td><td>G7776</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Research Organics</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9682T</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum azid</td><td>Amresco</td><td>71289</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AMR-0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>MSI</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>Nitroselüloz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60443</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Dimetilformamid</td><td>Büyük Yeniden Çıkartılmış/Ekstre Edilmiş</td><td>D4254</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan iskelet miyozin II</td><td>Zealand Beyaz Tavşanlar (7-8)</td><td>Sisteme girilen veri bulunmamaktadır. Lütfen çevrilmesini istediğiniz metni sağlayınız.</td><td></td></tr><tr><td>MF30 antikoru (9-10)</td><td>Gelişimsel Çalışmalar Hibritoma Bankası</td><td>MF30</td><td></td></tr><tr><td>MF20 antikoru (6)</td><td>Hibridoma Bankası</td><td>MF20</td><td></td></tr><tr><td>Laboratuvar mikroskobu</td><td>Boreal</td><td>WW57905M00</td><td></td></tr><tr><td>Ekvatoryal kundak</td><td>Celestron</td><td>CG-5</td><td></td></tr><tr><td>Dijital video kamera</td><td>Sony Corporation</td><td>XCDV60</td><td></td></tr><tr><td>Kumpas bırakma</td><td>Cabelas</td><td>IA-415482</td><td></td></tr><tr><td>Basınç yayı</td><td>Jones Spring Co.</td><td>723</td><td></td></tr><tr><td>Çekme yayı</td><td>Jones Spring Co.</td><td>770</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Ulusal Sağlık Enstitüleri</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Fire-i sürücüleri &amp;amp; uygulama </td><td>Unibrain</td><td>3.80</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>Yalnızca çevrilecek metin sağlandığında çeviri işlemi gerçekleştirilebilir. Lütfen çevrilmesini istediğiniz İngilizce metni paylaşın.</td><td></td></tr></tbody></table>

fibröz proteinler gerin ve tedbir roman yerçekimi kuvveti spektrometresi kullanır gösterilmesi

Demonstrating the Uses of the Novel Gravitational Force Spectrometer to Stretch and Measure Fibrous Proteins

Makromoleküler yapısının çalışmada, moleküler mekanizmaları ve fonksiyon aydınlatılması için kritik hale gelmiştir. Proteinlerin yapısal özellikleri kuvvet bağımlılığı test etme yeteneğine sahip, sınırlı, ama önemli birkaç bioinstruments vardır. Ölçeği araştırmacılar, nükleik asitler, enzimler ve yaşam sürdürme çalışma yapan motor protein molekülleri, nanomechanical dünyaya eş ne ​​kadar doğru bir sınırlama parametre olmuştur. Atomik kuvvet mikroskobu (AFM), elektron mikroskobu ile eşit bir mesafe çözünürlüğü ile lifli proteinler doğal yapıları belirlemek için ayarlanmıştır. Ancak, AFM kuvvet çalışmaları, güçleri genellikle tek bir molekülün daha yüksek 1, 2 yaşayabilirsiniz. Optik tuzakları (OT), tuzağa boncuk arasındaki göreceli mesafeyi belirleyen çok iyi ve çok küçük kuvvetlerle 3 aktarabilir . Ancak, bu çalışma kapsamında moleküllerin doğru mutlak uzunluk vermeyecektir. Moleküler simülasyonlar, bu tür deneylere destekleyici bilgileri sağlar, ama aynı büyük moleküler boyutlarda, uzun zaman dilimlerini, sap ve destekleyen diğer kanıtlar 2, 4 yokluğunda bazı araştırmacılar, ikna yeteneği sınırlıdır. Yerçekimi kuvveti spektrometresi (GDS) yeteneklerinin benzersiz bir kombinasyonu sunarak bir araştırmacının cephanelik kritik bir boşluğu doldurmaktadır. Bu cihaz genellikle% 98 veya daha yüksek doğruluk femtonewton aralığı nanonewton aralığı ile güçlerini üretme yeteneğine sahiptir. Mesafe ölçümleri şu anda aşağı beş nanometre ve hassas optik yakalamak için benzer bir göreceli boncuk çifti ayırma mesafeleri mutlak moleküler uzunluğu çözme yeteneğine sahiptir. Ayrıca, GFS germe veya kuvvet denge yakın olduğu uncoiling belirlemek veya ölçülen herhangi bir yapısal değişikliklere karşı yan yana getirmek kademeli güç sağlamak. Bu fizyolojik kuvvet yükleri 2 maddesi uyarınca olayları uncoiling kaç amino asit kalıntıları yer belirlemek için bile mümkün. GFS aksine, herhangi bir tahlil önce kapsamlı bir gücü kalibrasyon var, diğer yöntemler gibi kuvvet kalibrasyonu 5 gerektirir. Güçlü diğer yöntemleri tamamlayıcı olarak, GDS hayati proteinlerin ve diğer makromoleküllerin nanomekanik anlayış boşlukları arasında köprü olacak.

Bu amaç, işletme ve roman yerçekimi kuvveti spektrometresi temsilcisi sonuçları gösteren bir adım adım kılavuz.

Fibröz Proteinler gerin ve Tedbir Roman Yerçekimi Kuvveti Spektrometresi kullanır gösterilmesi

Makromoleküler yapı çalışmaları, moleküler mekanizmaların ve fonksiyonların aydınlatılmasında kritik bir hale gelmiştir. Sınırlı olmakla birlikte çeşitli...

Yerçekimi kuvveti düzeneği bir epi montajdan, standart bir ışık mikroskobundan, dijital kameradan ve bir bilgisayardan oluşur. Bunu tek molekül asit çalışmaları yapmak için kullanıyoruz. Kuvvet dengesini kaydedebilir veya damla yoluyla kademeli bir kuvvet sağlayabiliriz.Başlamak için, bu tür işlemlerin gerçekleştirilebilmesi için bir cam mikro pipet hazırlamamız gerekir. Kullanacağınız fasulyelerden yaklaşık 10 miligram ölçmek için genellikle 2K hazırlarım. Burada, üç triloji için kullanacağımız beş mililitre örneğimiz bulunmaktadır.İşte burada terminal Put One'ı alacağız. Bir transfer pipetiyle iyice karıştırın ve ardından karışımın 2 mL'sini bead cake'in üzerine aktarın. Bead cake'leri 2 dakika bekletin ve ardından 2 dakika boyunca iyice vorteksleyin.Aşağıdaki ıslak ikisini yedi. Çift distile su içinde bir purin istersiniz. pH altı eşleşmesi.Her bir boncuk grubuna beş mililitre kenetleme tamponu eklemeniz yeterlidir; bu kenetleme işlemi boncukların bağlanmasını sağlar. Ardından antikorlar tekrar yakından bağlanır, bir dakika boyunca vortekslenir. Beş dakika boyunca çöktürün ve dondurucudan çıkardığınız glutaralde, kenetleme tamponu kullanarak mevcut konsantrasyonu %5'e düşürün.Ardından, bu çözeltiden iki mililitre alıp ekleyin; bu işlem, TER'in vorteks cihazımızda halihazırda bulunan terminallerle eşleşmesini sağlayacaktır. Bunu iki kez tekrarlayın, üç kez döndürün. Bağlama tamponu prosedürünüz tamamlanmıştır.Besleme kekine tekrar beş mililitre kenetleme tamponu ekleyin. Tekrar karıştırın, santrifüjleyin ve süpernatantı çekin. Dördüncü seferde, antikorun serbestçe hareket edebilmesi için kekin üzerinde bir miktar süpernatant bırakın.Antikorumuz burada. O hacmi mikro pipetle alın. Antikorları, çift distile su ile 1 M molariteye gelecek şekilde seyreltin ve karışımı uygun süre boyunca 30 dakika boyunca döndürün.Tüm alt etkileşimli yapıştırıcıyı söndürmek için, göz göze. Döndürerek çöktüreceğiz, S'den kurtulacağız. Ardından içeriği protokol olan bir tane oluşturmak istersiniz. Beş mililitre alın, boncukları alın, işte boncuklar, dişle aşağıya indirin.Bu adımı üç kez tekrarlayın ve ardından yaptığınız her türlü analiz için aynı işlemi uygulayın. Hazırlığımıza başlamak için öncelikle proteinimizi temin etmemiz gerekir. Bu durumda, -70 °C'de saklanan proteinlerin bulunduğu yere gidin; bu proteini almak ve ısıtmak önemlidir.Bu, şu an mevcut halinden, analizimizde kullanmak isteyeceğimizden çok daha konsantre olacaktır. Bu nedenle, miktarı yaklaşık 15'e düşüreceğiz ve bunun bir kısmını uca koyacağız. Ancak bu, hacim doğru olduğu için gereklidir; hacim miktarını yaklaşık 5 µL'ye düşürdükten sonra, büyük boncuklar için daha büyük bir hacim alacağız, bu örnek boncuktan 10 µL alacağız.Ve bu bize güzel bir sonuç verecek; burada, nihai konsantrasyonu elde etmek için mikro santrifüj tüpüne yaklaşık 350 µL daha assay tamponu ekliyoruz. Şimdi bunu, tıpkı vertexleyici ile yaptığımız gibi yapacağız; burada tüpü kelimenin tam anlamıyla döndüreceğiz ve bunu gerçekleştireceğiz. Artık boncuklarımızın yerleşeceği ve bulunacağı akış sistemini gerçekten oluşturma zamanı geldi.Bu standart mikroskop lamını %1'lik, yüzeye tutunmayı sağlamak için yapıştırıcı ile hazırlanmış bir çözeltiye yerleştiriyorum; böylece lam ve lamel yüzeyine sabitlenebilirler. Kenarları zaten belirledim ve daha ince olan bu cam parçasını daha kalın olan lamelin üzerine yerleştireceğim. Bu oda nispeten küçük olacaktır.İşte burada küçük bir tane var ve hasarlı konumda. Her gün karşılaşılan durumlardan biri daha. Ajan beni daha iyiye, daha iyi bir eksikliğe götürüyor.Burada, kraker ve peynir eklemeye başlamadan önce, son iki adet 25 yıllık olanları muhtemelen tadacağız. Ve güneş kaçırdınız. Sadece birkaçı tadıldı, sadece birkaçı.Ve burada yakından bakarsanız boncuğu gerçekten görebilirsiniz. Pipet ucuyla yaptığım şey, öncelikle boncuğun olduğu bölgeye hafifçe vurmakla başlamaktır ve bunu yaptıktan sonra, slayt yüzeyinin geri kalanını yaklaşık 40 derece eğimle tutarım; böylece slaytı farklı yönlendirmelerde kullanabiliriz ve boncukların aşağı kayması konusunda endişelenmeyiz. Numunemi almak için herhangi bir vidalı kapak kullanmanıza gerek yok, hattın arkasından biraz alırım ve slaytı monte ederim; her şeyin daha stabil kalması için ek bir klips kullanırım. Ve objektifi yerleştirebiliriz.Bu, lamın konumunu ayarlamak için kullandığımız bir uzaktan kumandadır ve kamera da dahil olmak üzere her şey açık durumdadır. Video ekranını izleyerek potansiyel boncukların takibine başlayabiliriz. Soldakinin daha küçük bir boncuğu vardır ve bu küçük boncuk, lamın yüzeyinde öylece duran diğer küçük boncuklara benzer.Ancak, boncuk çiftinde, LOP'un odak dışı boncuk yüzeyinde odaklanan bir boncuk vardır; bu durum, söz konusu boncuğun diğer boncuktan farklı bir odak düzleminde yer aldığını gösterir. Ayrıca, sağdaki A örneği, boncuk çiftlerinin bir lam üzerinde nasıl çalışabileceğini göstermektedir. Böylece, farklı açılarla rotasyon gerçekleştirdikçe lamı yerleştiriyoruz ve bu bize farklı uzunluklar vermektedir; ardından rotasyonu kullanıyoruz. Bilgisayar kullanarak bir besleme parametresinin nasıl görünebileceğine dair bir görüntü görüyoruz.Her ikisini de buluyoruz. Bu durumda, verilen ölçümü çıkarabileceğimizi hesaplayabiliriz; burada F'yi ve ayrıca diğerini de çıkardık. İzlediğiniz için teşekkürler.Rahatsızlığınızla ilgili size iyi şanslar dilerim. Dans etmenin bir zamanı vardır. Ayrıca, kimsenin benimkini kazanamayacağını düşünmeyin.Arkadaşlarım onu kapmaya çalışmakla meşgul. Her şey benim arkamda kaldı. Birlikte geldiğim kız nerede?Arkadaşımla birlikte gidiyor. Gerçekten öyle olduğunu düşünüyor. Gerçek bir adamı tanımıyor mu.Yeniden bin, yeniden sağa, mekanik boğa. Bırak gitsin. Sağ, sağ, ta Meksika'nın derinliklerinde.Bu geceki turların tarzına bayıldım. Mekanik boğa. Sakın yavaşlama.Sol elimle işim bittiğinde beni rahatlatmak için 5 saniye ver. Sadece sağ elimi kullanacağım. Evet, sol elimle sadece sağımı kullanacağım.

demonstrating-uses-novel-gravitational-force-spectrometer-to-stretch

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

48 saatlik bir süre boyunca çevre kontrollü bir biyoreaktörde fibroblast aracılı jel sıkıştırma ve fibrin fiber yeniden hizalamayı gözlemlemek ve analiz etmek için zaman atlamalı mikroskopi ve görüntü işleme teknikleri kullanılmıştır.

Fibroblast aracılı Fibrin Jel Sıkıştırmayı Gözlemleme ve Ölçme

Selülozomlar, selülozu sindirmek için tasarlanmış multienzim kompleksleridir. AFM tabanlı SMFS, selülozomla ilişkili protein düzeneklerinin mekanik özelliklerini ve katlanma konfigürasyonunu incelemek için kullanıldı. Selülozom montajında yer alan bireysel reseptör-ligand komplekslerinin etkileşimlerini incelemek için protein immobilizasyonu, veri toplama ve veri analizi için eksiksiz bir iş akışı sunuyoruz.

AFM-tabanlı Tek-molekül Kuvvetleri Spektroskopisi ile cellulosome Reseptör-ligand Sistemleri Araştırılması

Kimyasal tenli, ya da permeabilize, iskelet kas liflerinin kasılma özelliklerinin analizi tek kas hücre düzeyinde kas fonksiyonunu değerlendirmek için bir güçlü bir araç sunuyor. Bu yazıda hazırlamak için geçerli ve güvenilir bir teknik anahat ve test in vitro iskelet kas lifleri geçirgenleştirildi.

Permeabilize İskelet Kası Fibers tarafından oluşturulan Maksimum İzometrik Kuvvet Ölçümü

Tam elastik özelliklerini çıkarmak için hücre dışı matrisin elastin ve tripsin saflaştırılmış tip I kollajen liflerine Brillouin ışık saçılma spektroskopisinin uygulanması için bir protokol sunuyoruz.

Brillouin Spektroskopisi için Ekstraselüler Matriks Proteini Elyaf Hazırlama

Son zamanlarda, hücre içi kuvvetin proteine özgü çözünürlüğünü sağlayan bir dizi FRET tabanlı kuvvet biyosensörü geliştirilmiştir. Bu protokolde, nükleoskeleton-hücre iskeleti (LINC) kompleksi proteini Nesprin-2G'nin bağlayıcısı için tasarlanan bu sensörlerden birinin, nükleer LINC kompleksi üzerindeki aktomiyosin kuvvetlerini ölçmek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) -force biyosensörlerin kullanılması için Protokol Nükleer LINC Kompleksi karşısında Mekanik Kuvvetleri Ölçmek için

Biz ayrıntılı yordamlar ve mekanik özellikleri ve mekanik unfolding yollar tek protein moleküllerinin bir Atomik kuvvet mikroskobu kullanarak ölçmek için stratejileri açıklar. Ayrıca seçim ve bloklama iyi tek protein molekülü kayıtları için bir başvuru olarak temsilcisi sonuçları göster.

Kuvvet spektroskopisi bir Atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak tek Protein moleküllerinin

Bu iletişim kuralı ile örneklenir bir heterobifunctional silane Bağlantı Aracısı atomik kuvvet mikroskobu dayalı tek molekül kuvvet spektroskopisi için tasarlanmış silikon-oksit yüzeyler için proteinlerin immobilizasyon kovalent açıklar RrgA etkileşim (pilus-1 İpucu adhesin, S. pneumoniae) fibronektin ile.

Proteinler kovalent immobilizasyon için tek molekül kuvvet spektroskopisi

Burada, bir protokol Förster rezonans eşzamanlı kullanımı için protein yük ve floresan kurtarma kuvvet duyarlı ölçüm etkinleştirme protein dynamics ölçmek için photobleaching sonra ölçmek için enerji transferi tabanlı gerilim sensörler mevcut canlı hücreler içinde protein dinamiği.

Kuvvet duyarlı Protein Dynamics floresan teknikleri bir arada kullanarak canlı hücrelerdeki ölçümü

Topluluk kuvvet spektroskopisi (EFS), biyofiziksel ve biyosensing alanlarında bir grup biyomoleküler yapının mekanik olarak açılması ve gerçek zamanlı olarak algılanması için sağlam bir tekniktir.

Kesme Kuvvetleri ile Topluluk Kuvveti Spektroskopisi

Akson streç büyüme yansıtan benzersiz bir doku mühendisliği yöntemiyle kültürünün çok sayıda sinir lifleri uzatmak için geliştirilmiştir; sinirleri büyütme vücudun büyüme ile birlikte uzatmak sayede sinir sistemi gelişimine bir form.

Akson Streç Büyüme: Nöronal Büyüme Mechanotransduction

Öğrenin, yerçekimi kuvvet spektrometresi ile tek moleküllü analiz yapmayı ve moleküler kuvvet ölçümlerini nasıl gerçekleştireceğinizi. Bu yöntem sinirbilim ve biyofizik araştırmalarında değerli bilgiler sunar.

Fibröz Proteinler gerin ve Tedbir Roman Yerçekimi Kuvveti Spektrometresi kullanır gösterilmesi

Daha fazla video keşfet