Görüntüleme C. elegans Embriyolar Epifluorescent Mikroskop ve Açık Kaynak Yazılım

Bu protokol, yaygın olarak bulunan mikroskoplar ve açık kaynaklı yazılımlar kullanılarak erken CL egan embriyolarında Norky DIC optiği veya floresan ile dinamik olayların nasıl görüntüleneceğini gösterir. Protokol, CL gans embriyolarının nasıl diseksiyon edileceğini ve görüntüleme için nasıl monte edileceğini açıklamakla başlar. Ardından, en yüksek ayrıntıda optimum görüntüleri sağlamak için DIC veya masky optiklerinin uygun kurulumu gözden geçirilir.

Geniş alan epi floresan ve aydınlatmanın kalibrasyonu, açık kaynaklı yazılımla birlikte iyi floresan görüntü verilerinin toplanması için de gözden geçirilmiştir. İyi bir mikroskopi, gelişmekte olan bir embriyodaki hücresel dinamikleri görselleştirebilir. Bu yöntemin görsel çizimleri, terminoloji kafa karıştırıcı olabileceğinden ve uygun tekniği yazılı olarak tanımlamak zor olduğundan, D iic Optik'i düzgün bir şekilde kurmak zor olduğundan kritik

Ek olarak, araştırmacılar floresan görüntüleme yaparken ışığa maruz kalmayı en aza indirmeye dikkat etmelidir. Fototoksisiteyi ve fotobleachingi sınırlamak için Embriyoları görüntülemeye hazırlamak için önce iki montaj solüsyonu yapın. Biri erimiş vazelin, diğeri ise tamponda %2 ila %3 ararottur.

Görüntülenecek yapılar çok kırılgansa, kaynamayı önlemek için dikkatli olunarak daha yoğun arolar yapılabilir. Her iki stok çözeltisi de mikrodalgada eritilir ve daha sonra dört ila beş mililitrelik alikotlar olarak saklanır. Görüntüleme gününde, 65 ila 70 santigrat derece ısı bloğunda bir Vazelin çözeltisi alikotunu eritin ve mikrodalgada bir alikot ortaya çıkan çözeltiyi eritin.

Yine, kaynatmaktan kaçının. Daha sonra bu çözeltileri erimiş halde tutmak için bir ısı bloğunda saklayın. Ardından, iki slaytın üstünü ve altını bir laboratuvar bandı şeridi ile örtün ve iki bantlanmış slayt arasına temiz bir slayt yerleştirin.

Şimdi temiz sürgünün üzerine birkaç damla erimiş aros sıkın ve üzerini başka bir temiz sürgüyle örtün. Aros, solucan pedi hazırlanmış olarak ince kare bir ped halinde yayılır. İki yetişkin solucanı 18 x 18 milimetrelik bir kapak kaymasında dokuz ila 12 mikrolitrelik bir tampon damlasına aktarmak için bir diseksiyon kapsamı ve bir platin tel çekme kullanın.

Sonra kes. Embriyoları agarro tarafı aşağı bakacak şekilde serbest bırakmak için solucanları bir iğne veya neşter ile açın. Sonsuz pedi 18 x 18 milimetrelik kapak kızağının üzerine yerleştirin ve sarkan agarları jiletle uzaklaştırın.

Son olarak, kapak kızağını kapatmak için, erimiş Vazelin solüsyonunu bir boya fırçası veya kürdan ile çevresi boyunca uygulayın. Hücreler artık görüntüleme için hazırdır. Slaytı mikroskoba koyarken, iki polarizörün birbirine dik olarak hizalandığından emin olun.

Hem duvarların hem de prizmaların ışık yolunun dışında olduğundan emin olun. Alan karanlık değilse, kondansatörün altındaki polarizörü şu ana kadar döndürün. 10 kez hedefini kullanarak embriyoları bulun.

Görüntüleme alanında birden fazla embriyo elde etmek için genç embriyo grupları için solucan gövdelerinin yanına bakın. En iyi görüntüler için solucanın içindeki embriyolardan kaçının. En iyi embriyolar yerleştirildikten sonra, daha yüksek bir güç hedefine geçin.

Şimdi filtre küpünü DIC'ye geçirin. Ardından, üst objektif walstone prizmasını ışık yoluna yerleştirin ve objektife uygun alt walstone prizmasını seçmek için tartı kondansatör üzerinde döndürün. Prizmalar yerindeyken, bu taretin altındaki kaydırıcıyı merceğin sayısal diyafram açıklığına uyacak şekilde ayarlayın.

Optimum Kohler aydınlatmasını elde etmek için, kondansatör diyaframının kenarı en keskin görünene kadar kondansatörü odaklayın. En keskin, açık siyah arasındaki sınırın en net veya odakta olduğu zamandır. En iyi kontrastı elde etmek için, kaydırıcı üzerindeki düğmeyi çevirerek elma duvarını ve prizmayı ayarlayın.

Şimdi mikroskop neredeyse kullanıma hazır. Sıra bilgisayardaki ek görüntüleme parametrelerini micromanager ve açık kaynak kodlu yazılımlarla kontrol etmeye geliyor. Kamera kazancını sıfıra ayarlayarak başlayın.

Ardından dosyaları 16 bit tiff olarak değil, sekiz bit olarak kaydetmeye geçin. TIFF dosyaları daha sonra Image J gibi açık kaynaklı yazılımlar tarafından analiz edilebilir.Ardından, ışık seviyesini en parlak piksellerin doygunluk seviyelerinin hemen altında olduğu yere ayarlayın. Her şey doğru bir şekilde yapıldıysa, görüntü belirli bir açıyla parlıyor gibi görünen ışıkla 3D görünecektir.

Artık görüntü mükemmel göründüğüne göre, görüntülemek istediğiniz embriyoları seçin ve ilgilendiğiniz bir bölge çizin. Mikroskobun bir odak motoru varsa, her seferinde birden fazla odak düzlemi toplamak için kullanın. Çok boyutlu alım penceresini açın, ve odakta bazı boyunduruk granülleri bulunan ilk ve son odak düzlemini bulmak için odak düğmesini ayarlayarak Z yığını üst ve alt düzlemini ayarlayın.

Adım boyutunu ayarlayın. Bu, toplanan odak düzlemlerinin sayısını tanımlayacaktır. Şimdi, tüm odak düzlemlerini elde etmek için yeterince uzun bir zaman aralığı ayarlayın.

Maksimum zaman noktaları çok yükseğe ayarlanabilir, böylece yazılım manuel olarak durdurulana kadar görüntü alır. İşlemin izlenebilmesi için yazılımı yalnızca en son alınan görüntüyü gösterecek şekilde ayarlayın. Şimdi görüntülere bir dosya adı verin ve görüntüleri almaya başlayın.

Görüntü analizi, bir sonraki bölümün sonunda kısaca gözden geçirilecektir. Bir GFP filmi oluşturmak, dört D veya Musky DIC yapmaya çok benzer, ancak floresan parçalanmasının yazılım kontrolünü içeren bir yapılandırma dosyası kullanılır. Bunun yerine, embriyolar yerleştirildiğinde, üst walstone prizmasının ışık yolunda olmadığından emin olun ve filtre küpünü F-I-T-C-G-F-P olarak değiştirin.

Bu, Yazılım kullanılarak başlangıçta otomatik olarak ayarlanmadıysa, kamera kazancının 255 olarak ayarlandığından emin olun. Bir görüntü dosyası 16 bit tiff formatına ayarlanmıştır. Şimdi iletilen ışık kaynağını kapatın ve canlı görüntülemeye tıklayın.

Floresan sinyali için iyi bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için UV ışık kaynağının yoğunluğunu ve maruz kalma süresini ayarlayın, ancak hücreleri korumak için ışığa maruz kalmayı minimumda tutun. Ardından, zaman aralığını ayarlayın. Zaman noktalarının sayısı ve odak düzlemlerinin sayısı artık daha önce açıklandığı gibi görüntü alımına devam ediyor.

Filmleri analiz etmek için açık kaynaklı yazılım kullanın. Micromanager eklentisi yüklü Image J Çok büyük filmler de loci eklentisi kullanılarak Image J'ye aktarılabilir. Bu, ne maskeli, ne de DIC optiklerle yakalanan vahşi tip bir embriyodur.

Posterior sağ altta ve ventral sol alttadır. Film, her 15 saniyede bir toplanan tek odak düzlemi görüntülerinden oluşan bir dizi gösterir. Oynatma saniyede 14 kare olarak ayarlanmıştır.

Bu embriyo, ilk embriyonik bölünme sırasında floresan ifade eder, burada posterior sağ üsttedir. Bu film, her 10 saniyede bir tek bir odak düzlemindeki değişiklikleri gösterir. Bu videoyu izledikten sonra, dinamik olayları incelemek için hem DIC Naski optiği hem de epi floresan kullanarak canlı embriyoların nasıl görüntüleneceğini iyi anlamış olmalısınız.

En iyi görüntüleri elde etmek için DIC Nomar optiklerinin nasıl kurulacağını daha iyi anladığınızı ve epi floresan aydınlatma kullanarak yüksek kaliteli floresan verileri elde edebileceğinizi ve her zaman daha gelişmiş mikroskoplara bağımlı olmadığınızı fark edeceğinizi umuyoruz. Bu görüntüleme tekniklerini, hücre bölünmesi veya gelişimi sırasında en sevdiğiniz olaylar için genetik gereksinimleri daha fazla araştırmak için belirli gen işlevinden yoksun embriyoları incelemek için de uygulayabilirsiniz.