Membran Proteinleri Konformasyonel Dynamics incelenmesi In situ Site Floresan Etiketleme

Bu prosedürün genel amacı, tekil hücrelerin yüzeyinde bölgeye özgü floresan işaretleme kullanarak membran proteinlerinin konformasyonel dinamiklerini incelemektir. Bu işlem, öncelikle hücre dışı ve transmembran bölgelerin arayüzündeki kalıntıların, kırmızı C ile gösterildiği gibi tek tek sistine mutasyona uğratılmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, bu kalıntının sistinle reaksiyona giren bir florofor ile işaretlenip işaretlenemeyeceğinin belirlenmesi gerekir. Prosedürün ikinci adımı ise sistin mutajenezin ve/veya florofor işaretlemenin, proteinin kinetiğini ve/veya konformasyonel durumunu etkileyip etkilemediğini incelemektir.

Bu işlem, gösterilen düzenek kullanılarak gerçekleştirilir. Prosedürün üçüncü adımı, floresans yoğunluğundaki değişimleri hedef proteinin kinetik parametreleri ile karşılaştırmak ve aralarındaki farkları belirlemektir. Tipik bir floresans izi burada gösterilmiştir.

Prosedürün son adımı, mesafe kısıtlamalarını belirlemek amacıyla voltaj klemp ölçümleriyle eş zamanlı olarak fotoyıkım hızlarını ölçmek için mutasyona uğramış sistein çiftlerini ya donör Flor dörtleri ya da donör akseptör Flor dörtleri ile etiketlemektir. Bu şekil, akseptör yokluğundaki donör fotoyıkım hızlarını siyahla, akseptör varlığındaki donör fotoyıkımını ise kırmızıyla göstermektedir. Nihayetinde, protein konformasyonel değişikliklerinin sonucu olan floresan yoğunluğundaki değişimlerin, voltaj klemp florometrisi aracılığıyla membran proteini fonksiyonu ile ilişkilendirilebildiğini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu yöntem, proteinin konformasyonel durumundaki değişikliklerin plazma membranı boyunca küçük molekül ve iyon transportunu nasıl kolaylaştırdığı gibi, membran iyon transportu alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Prosedüre, sodyum potasyum pompasını Xenopus oosit ekspresyonu için uygun bir vektöre klonlayarak başlayın. Bir sonraki adım, beraberindeki makalede belirtildiği üzere, transmembran ve ekstraselüler domainlerin ara yüzeyinde bulunan kalıntılarda sistein mutasyonları oluşturmaktır.

İşlem tamamlandığında, eşlik eden makalede belirtildiği üzere plazma DNA'sı mRNA'ya transkribe edildikten sonra DNA dizileme ile mutasyonun yerleşimini doğrulayın ve cerrahi işlem öncesinde bir spektrofotometre kullanarak mRNA verimini miktar belirleme yöntemiyle ölçün. Operasyon sırasında kusmayı önlemek için kurbağa 12 saat boyunca aç bırakılmalıdır. Ertesi gün cerrahi işleme başlamak için, kurbağa ayak parmağı sıkıştırmasına tepki vermeyene kadar anestezik solüsyonun içinde bekletin.

Kurbağayı anestezik solüsyondan çıkarın ve bir bebek bezi pedinin emici tarafına sırtı aşağı gelecek şekilde yerleştirin. Kurbağanın nemli kalmasını sağlamak için üzerine ıslak bir kağıt havlu koyun. Ayrıca, kurbağanın gözleri açıksa, bunları salin solüsyonu ile nemli tutun.

Kurbağanın orta hattının bir tarafında küçük bir cerrahi kesi yapın. Yumurtalığı bulun ve kurbağanın dışına çıkarın. Yumurtalığın deriye temas etmemesine dikkat edin.

Overi çıkarın ve ringer çözeltisi içeren bir Petri kabına yerleştirin. Kalan dokuda kanama olup olmadığını kontrol ettikten sonra dokuyu tekrar smic boşluğuna yerleştirin. Kanama meydana gelirse, kanama durana kadar steril bir pamuklu çubukla baskı uygulayın.

Kesi yerini ayrı dikiş yöntemiyle dikerek ameliyatı tamamlayın. Kurbağayı, makas kullanarak anestezi etkisinden kurtulması için barınağına geri koyun. İzole edilen over lobunu daha küçük parçalara ayırın.

Kümelenmeleri, kollajenaz eklenmiş kalsiyumlu ringer solüsyonuna aktarın. Ardından, sindirim solüsyonunu 18 °C'de iki saat boyunca hafifçe çalkalayın. Hücrelerin çoğu ayrıldığında, oositleri kalsiyumsuz ringer solüsyonu ile yıkayın.

Ardından oositleri oda sıcaklığında, kalsiyumsuz ringer solüsyonunda 10 dakika boyunca inkübe edin. Bu aşamada, hücreleri kalsiyumlu ringer solüsyonu ile kapsamlı bir şekilde yıkayın. Son olarak, enjeksiyon öncesi saklama için oositleri kalsiyumlu ringer solüsyonuna aktarın.

Bir sonraki adım için, sentezlenen mRNA'yı -20 °C dondurucudan çıkarın. mRNA'nın 25 ng miktarını 50 nL nihai hacme ekleyin. Ardından, mRNA'yı enjeksiyondan sonra sitlere enjekte edin.

Oositleri ringer çözeltisine ve mililitre başına bir miligram gentamisine yerleştirin ve 18 °C'de, karanlıkta üç ila yedi gün boyunca inkübe edin. Bu işlem, sodyum potasyum pompasının oosit plazma membranında eksprese edilmesini sağlar. Deney günü, oositleri inkübatörden çıkarın ve 45 dakika boyunca yükleme tamponuna, ardından 45 dakika boyunca yükleme sonrası tamponuna yerleştirin.

Bu işlem, sodyum potasyum pompasının ölçümünü kolaylaştırmak için hücre içi sodyum konsantrasyonunu artırır. Floresans ölçümleri için, oositleri TMRM veya FM gibi istenen florofordan 5 µM içeren bir yükleme sonrası tamponunda, karanlıkta 5 ila 10 dakika inkübe edin. Florofor etiketlemesinden sonra, oositleri boya içermeyen yükleme sonrası tamponu ile iyice yıkayın.

Fotobeyazlamayı önlemek için oositleri karanlıkta tutun. İki elektrotlu voltaj klemp ölçümlerine hazırlanmak için, öncelikle mikro elektrotları 3 M potasyum klorür ile doldurun ve direnci test edin. Direnç 0,5 ile 1,5 mega ohm arasında olmalıdır.

Sistein tarama deneyleri için floresan mikroskobunu 5 35 DF 50 uyarım filtresi, 5 65 EFLP emisyon filtresi ve beş 70 DRLP diic aynası ile donatın. Ardından, oosit'i floresan mikroskop tablasındaki bir RC 10 haznesine yerleştirin. Daha sonra, membran potansiyelini sabit bir değerde tutmak için amplifikatörü kullanarak her iki mikroelektrodu nazikçe oosit'in içine yerleştirin.

Çözelti değişimi veya membran potansiyelini değiştirme gibi uygun bir teknik kullanarak proteini aktive ederek membran boyunca iyon akışını ölçün. Eş zamanlı floresans ölçümleri için, donör floroforu uyarmak amacıyla 100 watt'lık bir tungsten ışık kaynağı kullanın ve floresan etiketleme için floresans yoğunluğundaki değişiklikleri tespit etmek amacıyla 0 2 2, A foto DDE'yi sabitleyin. Sistein taramasını takiben.

P clamp 10 yazılımı tarafından kontrol edilen voltaj adımları kullanarak, sabit akımdaki floresan yoğunluk değişimini ölçün. Protokolün ikinci bölümü, mesafe ölçümleriyle birlikte anes atrofi ölçümlerinin alınmasını içerir. Kappa kare değerlerinin aralığını hesaplamak için, bir atrofi rotasyon nedeniyle fluoro four'un göreceli hareketliliğini ölçer.

Hesaplamaların ayrıntıları için ekteki makaleye bakınız. Mesafe kısıtlamalarını ölçmek için, floroforlarla işaretlenebilen erişilebilir iki ekstraselüler sistein kalıntısına sahip bir holo enzim kullanın. Bir mikromolar FM ve dört mikromolar TMRM içeren yükleme sonrası tamponu ekleyin.

Bunlar donör ve akseptördür. Bir grup oosite sadece 1 µM FM ekleyin. Bu sadece donör floresan boyadır.

Diğer oosit grubuna dört adet ekleyin; her iki oosit grubunu da karanlıkta, buz üzerinde 30 dakika boyunca inkübe edin. Bu işlem, akseptör fluoro four ile işaretlenmiş ve işaretlenmemiş hollo enzimlerinin ölçümlerinin yapılmasına olanak tanır. Ardından, mikroskobu 4 75 DF 40 eksitasyon filtresi, 5 30 DF 30 emisyon filtresi ve 5 0 5 DRLP dikroik ayna ile donatın.

Ardından oositi floresan mikroskop tablasındaki hazneye yerleştirin. Sürekli bir solüsyon akışını koruyarak, akseptör floroforun varlığında ve yokluğunda donör beyazlamasının zamana bağlılığını ölçün. Dört. Bu sonuçlar, Förster teorisi kullanılarak sodyum potasyum pompasındaki iki kalıntı arasındaki mesafeyi hesaplamak için kullanılabilir.

Proteinin fonksiyonel olduğundan emin olmak için eş zamanlı olarak iki elektrotlu voltaj klemp ölçümleri yapılmalıdır. P clamp 10'daki klemp X özelliğini kullanarak, en az dört farklı bölge kaydı için donör floroforun fotoyıkım sonuçlarının ortalamasını alın. Protein alt birimlerinin bağıl hareketini ölçmek için akseptör ve donör floroforlar içeren çift sistein konstrüktleri kullanın.

Bu kalıntılardaki floresan yoğunluğu, proteinin konformasyonel durumuna karşı duyarsızdır ve iki flüoresan arasındaki mesafenin bir fonksiyonu olacaktır. Ardından, mikroskoptaki filtre setini 4 75 a F 40 eksitasyon filtresi, 5 95 a F 60 emisyon filtresi ve 5 0 5 DRLP dikroik ayna ile değiştirin. Daha sonra OI'yi floresan mikroskop tablasındaki hazneye yerleştirin.

Ardından, donör 100 watt'lık bir tungsten ışık kaynağı ile uyarılır ve akseptör olan Fluoro four'un floresan yoğunluğu ölçülür. Voltaj ligandı veya çözelti değişimi gibi uygun bir yöntem kullanılarak membran proteini aktive edilir ve eş zamanlı olarak floresan yoğunluğundaki değişim ölçülür. Bu şekil, hücre membranı boyunca gerçekleşen iyon transportu ile floresan yoğunluğundaki değişimler arasındaki korelasyonu göstermektedir.

Üst iz, 10 mikromolar ve 10 milimolar ing varlığında, sodyum test çözeltisi ve potasyum test çözeltisinin mevcudiyetindeki akım kenetleme ölçümlerini göstermektedir. Alt iz, akım kenetleme ölçümleriyle eş zamanlı olarak ölçülen floresans yoğunluğundaki değişimleri göstermektedir. Bu şekil, akseptör florofor dört olan TMRM ile işaretlenmiş iki oositi göstermektedir.

Soldaki oosit vahşi tip sodyum potasyum atpa eksprese ederken, sağdaki oosit tek bir erişilebilir sistein kalıntısına sahip sodyum potasyum APA'ları eksprese etmektedir. Bu şeklin üst izleri, voltaj darbesi üzerine geçici akım verilerini göstermektedir. Alt izler ise voltaj darbesi üzerine floresans yoğunluğundaki değişimlerin gerçek zamanlı kayıtlarını göstermektedir.

Bu şekil, fotobağışçı yıkımının zamana bağlılığını göstermektedir; donör foto-yıkımı, akseptör floroforun yokluğunda ve varlığında ölçülmüştür; fotobağlanma, akseptör florofor olmadan daha hızlı gerçekleşir. Her iz, dört farklı konumdaki kayıtların ortalamasıdır. Bu şekil, konformasyonel değişiklikler üzerine gerçekleşen göreceli alt birim hareketini göstermektedir.

Floresan değişiklikleri kırmızı izlerle ve akım akışı siyah izlerle gösterilmiştir. Solda gösterilen floresan yoğunluğundaki artış, florforların birbirine daha fazla yaklaştığını göstermektedir. Ortada gösterilen floresan yoğunluğundaki hiçbir değişiklik, florfor mesafesinin sabit kaldığını göstermektedir.

Sağda gösterilen floresan yoğunluğundaki azalma, bu prosedür uygulanırken floroforların birbirinden daha fazla uzaklaştığını belirtir. Kinetik ve kararlı durum floresan yoğunluğundaki değişimleri, proteindeki konformasyonel değişikliklerle ilişkilendirmeyi hatırlamak önemlidir.