Membran Proteinleri Konformasyonel Dynamics incelenmesi In situ Site Floresan Etiketleme

Biz tek hücreleri üzerinde floresan kullanarak yapı değişiklikleri siteye özgü analizi ile birlikte membran proteinlerinin iyon taşıma kinetiği ölçen bir yöntem anlatacağım. Bu teknik, iyon kanalları ve iyon pompaları uyarlanabilir ve protein altbirimden arasındaki mesafe sınırlamaları belirlemek için kullanılabilir.

Bu prosedürün genel amacı, tek hücrelerin yüzeyinde bölgeye yönelik floresan etiketlemeyi kullanan zar proteinlerinin doğrulama dinamiklerini incelemektir. Bu, ilk olarak, kırmızı C.It ile gösterildiği gibi, hücre dışı ve transmembran alanların arayüzündeki kalıntıların sistine ayrı ayrı mutasyona uğratılmasıyla gerçekleştirilir, daha sonra bu kalıntının bir sistin reaksiyona giren floro dört ile etiketlenip etiketlenemeyeceğini belirlemek için gereklidir. Prosedürün ikinci adımı, sistin, mutajenez ve/veya floro dört etiketlemesinin proteinin kinetiğini ve/veya doğrulama durumunu etkileyip etkilemediğini incelemektir.

Bu, gösterilen kurulum kullanılarak gerçekleştirilir. Prosedürün üçüncü adımı, floresan yoğunluğundaki değişiklikleri hedef proteinin kinetik parametreleriyle karşılaştırmak ve karşılaştırmaktır. Burada tipik bir floresan izi gösterilmektedir.

Prosedürün son adımı, mesafe kısıtlamalarını belirlemek için voltaj kelepçesi ölçümleriyle birlikte foto yıkım oranlarını ölçmek için mutasyona uğramış sistein çiftlerini donör Fluor dörtlü veya donör alıcı Fluor dörtlü ile etiketlemektir. Bu şekilde donör foto imha oranları siyah renkte vericinin yokluğunda vericinin yokluğunda foto imha oranları, alıcı varlığında ise kırmızı renkte görülmektedir. Sonuç olarak, protein doğrulama değişikliklerinin bir sonucu olan floresan yoğunluğundaki değişikliklerin, voltaj kelepçesi florometrisi yoluyla membran protein fonksiyonu ile ilişkilendirilebileceğini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu yöntem, proteinin doğrulama durumundaki değişikliklerin plazma zarı boyunca küçük molekül ve iyon taşınmasını nasıl kolaylaştırdığı gibi, zar iyonunun taşınması alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Sodyum potasyum pompasını xop direkleri, Lavis oosit ekspresyonu için uygun bir vektöre klonlayarak işleme başlayın. Bir sonraki adım, ekteki makalede belirtildiği gibi, transmembran ve hücre dışı alanlar arasındaki arayüzde bulunan kalıntılarda sistein mutasyonları yapmaktır.

Bittiğinde, plazma DNA'sını ekteki makalede belirtildiği gibi mRNA'ya kopyaladıktan sonra DNA dizilimi ile mutasyonun yerleştirildiğini doğrulayın, ameliyattan önce bir spektrofotometre kullanarak mRNA'nın verimini ölçün. Operasyon sırasında kusmayı önlemek için kurbağa 12 saat aç bırakılmalıdır. Ertesi gün ameliyata başlamak için, kurbağa bir ayak parmağı tutamına tepki vermeyene kadar kurbağayı anestezik solüsyona daldırın.

Kurbağayı anestezik solüsyondan çıkarın ve sırt tarafı aşağı bakacak şekilde bir bebek bezi pedinin emici tarafına yerleştirin. Kurbağayı nemli tutmak için kurbağanın üzerine ıslak bir kağıt havlu koyun. Ayrıca, kurbağanın gözleri açıksa, tuzlu su çözeltisi ile nemli tutun.

Kurbağanın orta hattının bir tarafında küçük bir kesi yapın. Yumurtalığı bulun ve kurbağanın dışına getirin. Yumurtalığı cilde dokundurmaktan kaçının.

Yumurtalığı çıkarın ve zil çözeltisi içeren bir Petri kabına yerleştirin. Smic boşluğuna geri yerleştirmeden önce kalan dokuda kanama olup olmadığını kontrol edin. Kanama olursa, durana kadar steril bir Q ucu ile baskı uygulayın.

Kesintili bir dikiş paterni kullanarak kesiyi dikerek ameliyatı bitirin. Makas kullanarak anesteziden kurtulmak için kurbağayı yuvasına geri koyun. İzole edilmiş yumurtalık lobunu daha küçük parçalara bölün.

Topakları ringer çözeltisine ve kollajenaz ile kalsiyuma aktarın. Daha sonra, sindirim solüsyonunu 18 santigrat derecede iki saat boyunca hafifçe çalkalayın. Sitlerin çoğu ayrıldığında, oositleri zil çözeltisi eksi kalsiyum ile yıkayın.

Daha sonra oositleri oda sıcaklığında eksi kalsiyum içeren zil çözeltisinde 10 dakika inkübe edin. Bu noktada, sitleri halkalar artı kalsiyum çözeltisi içinde iyice yıkayın. Daha sonra oositleri enjeksiyondan önce saklamak için zil çözeltisine ve kalsiyuma aktarın.

Bir sonraki adım için, sentezlenen mRNA'yı eksi 20 santigrat derece dondurucudan alın. 50 nanolitrelik son hacme 25 nanogram mRNA ekleyin. Daha sonra enjeksiyondan sonra mRNA'yı sitlere enjekte edin.

Oositleri zil çözeltisine ve mililitre gentamisin başına bir miligram içine yerleştirin ve karanlıkta 18 santigrat derecede üç ila yedi gün boyunca inkübe edin. Bu, sodyum potasyum pompasının oosit plazma zarı içinde ifade edilmesini sağlar. Deney günü, oositleri inkübatörden çıkarın ve 45 dakika boyunca yükleme tamponuna ve ardından 45 dakika boyunca yükleme sonrası tampona koyun.

Bu, sodyum potasyum pompasının ölçümünü kolaylaştırmak için hücre içi sodyum konsantrasyonunu arttırır. Floresan ölçümleri için, sitleri, karanlıkta beş ila 10 dakika boyunca TMRM veya FM gibi istenen floroforun beş mikromolar unu içeren bir yükleme sonrası tamponda inkübe edin. Flora dört etiketlemesinden sonra, oositleri boya içermeyen post tamponu ile iyice yıkayın.

Foto ağartmayı önlemek için yumurtaları karanlıkta tutun. İki elektrot voltajına hazırlanmak için, kelepçe ölçümleri, mikro elektrotları üç molar potasyum klorür ile doldurarak ve direnci test ederek başlayın. Direnç 0,5 ile 1,5 mega ohm arasında olmalıdır.

Sistein tarama deneyleri için, floresan mikroskobunu bir 5 35 DF 50 uyarma filtresi, bir 5 65 EFLP emisyon filtresi ve bir beş 70 DRLP diic ayna ile donatın. Ardından, okteyi floresan mikroskop tablasındaki bir RC 10 odasına yerleştirin. Ardından, membran potansiyelini sabit bir değerde tutmak için amplifikatörü kullanarak her iki mikro elektrotu da okte yavaşça yerleştirin.

Çözelti değişimi veya zar potansiyelini değiştirme gibi uygun bir teknik kullanarak proteini aktive ederek zar boyunca iyon akısını ölçün. Eşzamanlı floresan ölçümleri için, donör floroforu uyarmak için 100 watt'lık bir tungsten ışık kaynağı kullanın ve floresan etiketleme için floresan yoğunluğundaki değişiklikleri tespit etmek için 0 2 2, bir fotoğraf DDE'yi sabitleyin. Sistein taramasını takiben.

P clamp 10 yazılımı tarafından kontrol edilen voltaj adımlarını kullanarak sabit akımda floresan yoğunluğundaki değişikliği ölçün. Protokolün ikinci kısmı, mesafe ölçümlerinin yanı sıra atropi ölçümlerinin de alınmasını içerir. Kappa kare değerlerinin aralığını hesaplamak için, bir atropi, floro dördünün dönme nedeniyle göreceli hareketliliğini ölçer.

Hesaplamaların ayrıntıları için ekteki makaleye bakın. Mesafe kısıtlamalarını ölçmek için, floro dörtlü ile etiketlenebilen iki erişilebilir hücre dışı sistein kalıntısına sahip bir holo enzimi kullanın. Bir mikromolar FM ve dört mikromolar TMRM içeren yükleme sonrası tamponu ekleyin.

Bu verici ve alıcıdır. Floro dörtlü ila bir grup oosit, yalnızca bir mikromolar FM ekler. Bu sadece donör floro.

Dört ila başka bir oosit grubu, her iki oosit grubunu karanlıkta 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırır. Bu, ölçümlerin bir alıcı floro dörtlü ile ve alıcı floro dörtlü olmadan etiketlenmiş hollo enzimlerinden yapılmasına izin verir. Ardından, mikroskobu bir 4 75 DF 40 uyarma filtresi, bir beş adet 30 DF 30 emisyon filtresi ve bir 5 0 5 DRLP dikroik ayna ile donatın.

Daha sonra oositi floresan mikroskobu sahnesindeki odaya yerleştirin. Sürekli bir çözelti akışının sürdürülmesi, alıcı floranın varlığında ve yokluğunda donör ağartmanın zamana bağımlılığını ölçün. Dört. Bu sonuçlar, forester'ın sodyum potasyum pompasını kullanan iki kalıntı arasındaki mesafeyi hesaplamak için kullanılabilir.

Denklem iki elektrot voltaj kelepçesi ölçümleri, proteinin işlevsel olduğundan emin olmak için aynı anda yapılmalıdır. P kelepçe 10'daki kelepçe X özelliğini kullanarak, en az dört oh bölgesi kaydı için donör floro dördünün fotoğraf imhasının sonuçlarını ortalama. Protein alt birimlerinin nispi hareketini ölçmek için, alıcı ve verici floro dörtlüsü içeren çift sistein yapıları kullanın.

Bu kalıntılardaki floresan yoğunluğu, proteinin onay durumuna duyarsızdır ve iki dörtlü arasındaki mesafenin bir fonksiyonu olacaktır. Ardından, mikroskoptaki filtre setini 4 75 a F 40 uyarma filtresi, 5 95 a F 60 emisyon filtresi ve 5 0 5 DRLP dikroik ayna ile değiştirin. Ardından OI'yi floresan mikroskobu tablasındaki hazneye yerleştirin.

Daha sonra, verici 100 watt'lık bir tungsten ışık kaynağı ve alıcının floresan yoğunluğu ile uyarılır. Floro dört, voltaj ligandı veya çözelti değişimi gibi uygun bir yöntem kullanılarak ölçülür, membran proteinini aktive eder ve aynı anda floresan yoğunluğundaki değişikliği ölçer. Bu şekil, hücre zarı boyunca iyon taşınmasının korelasyonunu ve floresan yoğunluğundaki değişiklikleri göstermektedir.

Üst iz, 10 mikromolar ve 10 milimolar ing varlığında sodyum test çözeltisi ve potasyum test çözeltisi varlığında akım kelepçesi ölçümlerini gösterir. Daha düşük iz, mevcut kelepçe ölçümleriyle birlikte ölçülen floresan yoğunluğundaki değişiklikleri gösterir. Bu şekil, alıcı floro dört olan TMRM ile etiketlenmiş iki oositi göstermektedir.

Soldaki oosit, vahşi tip sodyum potasyum atpa'yı ifade ederken, sağdaki oosit, erişilebilir bir sistein kalıntısı olan sodyum potasyum APA'larını ifade eder. Bu şeklin üst izleri, voltaj darbesi üzerine geçici akım verilerini gösterir. Daha düşük izler, voltaj darbesi üzerine floresan yoğunluğu değişikliklerinin gerçek zamanlı kayıtlarını gösterir.

Bu şekil, foto ağartma donörünün foto yıkımının zamana bağımlılığının ölçüldüğünü göstermektedir, alıcı floro dörtünün yokluğunda ve varlığında, foto ağartma bir alıcı floro dört olmadan daha hızlı gerçekleşir. Her izleme, dört oh site kaydının ortalamasıdır. Bu şekil, onay değişiklikleri üzerine göreceli alt birim hareketini gösterir.

Floresan değişiklikleri kırmızı izlerde gösterilir ve akım akışı siyah izlerde gösterilir. Solda gösterilen floresan yoğunluğundaki artış, flora tabanlarının birbirine yaklaştığını gösterir. Ortada gösterilen floresan yoğunluğunda herhangi bir değişiklik olmaması, Fluor dört mesafesinin sabit kaldığını gösterir.

Sağda gösterilen floresan yoğunluğundaki bir azalma, Fluor dörtlüsünün bu prosedürü denerken birbirinden daha fazla uzaklaştığını gösterir. Kinetik ve kararlı durum floresan yoğunluğundaki değişiklikleri proteindeki doğrulayıcı değişikliklerle ilişkilendirmeyi hatırlamak önemlidir.