Name: Membran Proteinleri Konformasyonel Dynamics incelenmesi In situ Site Floresan Etiketleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Öğrenin, tek hücrelerde floresan etiketleme kullanarak membran proteinlerinin konformasyonel dinamiklerini ve iyon taşıma kinetiğini nasıl inceleyebilirsiniz. Bu yöntem, voltaj kelepçe florometrisi ile protein fonksiyonunu anlamanıza yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<ol><li>Cole, K. S., Moore, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+Ion+Current+in+the+Squid+Giant+Axon%3A+Dynamic+Characteristic%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Potassium Ion Current in the Squid Giant Axon: Dynamic Characteristic.</a> Biophys. J. 1, 1-14 (1960).</li>
<li>Taglialatela, M., Toro, L., Stefani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+voltage+clamp+to+record+small%2C+fast+currents+from+ion+channels+expressed+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Novel voltage clamp to record small, fast currents from ion channels expressed in Xenopus oocytes.</a> Biophys. J. 61, 78-82 (1992).</li>
<li>Dempski, R. E., Friedrich, T., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta+subunit+of+the+Na%2B%2FK%2B-ATPase+follows+the+conformational+state+of+the+holoenzyme%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The beta subunit of the Na+/K+-ATPase follows the conformational state of the holoenzyme.</a> J. Gen. Physiol. 125, 505-520 (2005).</li>
<li>Miller, A. J., Zhou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+oocytes+as+an+expression+system+for+plant+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22BBA+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Xenopus oocytes as an expression system for plant transporters.</a> BBA - Biomembranes. 1465, 343-358 (2000).</li>
<li>Cha, A., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+Voltage-Dependent+Conformational+Changes+in+the+Shaker+K%2B+Channel+with+Fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Characterizing Voltage-Dependent Conformational Changes in the Shaker K+ Channel with Fluorescence.</a> Neuron. 19, 1127-1140 (1997).</li>
<li>Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Physical+Measure+of+Conformational+Rearrangement+Underlying+Potassium+Channel+Gating%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct Physical Measure of Conformational Rearrangement Underlying Potassium Channel Gating.</a> Science. 271, 213-216 (1996).</li>
<li>Koch, H. P., Larsson, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-scale+molecular+motions+accomplish+glutamate+uptake+in+human+glutamate+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Small-scale molecular motions accomplish glutamate uptake in human glutamate transporters.</a> J. Neurosci. 25, 1730-1736 (2005).</li>
<li>Dempski, R. E., Hartung, K., Friedrich, T., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorometric+Measurements+of+Intermolecular+Distances+between+the+%CE%B1-+and+%CE%B2-Subunits+of+the+Na%2B%2FK%2B-ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorometric Measurements of Intermolecular Distances between the α- and β-Subunits of the Na+/K+-ATPase.</a> J. Biol. Chem. 281, 36338-36338 (2006).</li>
<li>Geys, S. A., Bamberg, E., Dempski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-Dependent+Effects+on+the+Conformational+Equilibrium+of+the+Na%2B%2CK%2B-ATPase+As+Monitored+by+Voltage+Clamp+Fluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ligand-Dependent Effects on the Conformational Equilibrium of the Na+,K+-ATPase As Monitored by Voltage Clamp Fluorometry.</a> Biophys. J. 96, 4561-4561 (2009).</li>
<li>Geibel, S., Kaplan, J. H., Bamberg, E., Friedrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+Dynamics+of+the+Na%2B%2FK%2B-ATPase+Probed+by+Voltage+Clamp+Fluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Conformational Dynamics of the Na+/K+-ATPase Probed by Voltage Clamp Fluorometry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 964-969 (2003).</li>
<li>Lorenz, L., Pusch, M., Jentsch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heteromultimeric+CLC+chloride+channels+with+novel+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Heteromultimeric CLC chloride channels with novel properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 13362-13366 (1996).</li>
<li>Mruk, K., Kobertz, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+Novel+Activator+of+KCNQ1-KCNE1+K%2B+Channel+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Discovery of a Novel Activator of KCNQ1-KCNE1 K+ Channel Complexes.</a> Biophys. J. 177a, (2009).</li>
<li>Kyte, J., Doolittle, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+diplaying+the+hydropathic+character+of+a+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A method for diplaying the hydropathic character of a protein.</a> J. Mol. Biol. 157, 105-132 (1982).</li>
<li>Rakowski, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charge+movement+by+the+Na%2FK+pump+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Charge movement by the Na/K pump in Xenopus oocytes.</a> J. Gen. Physiol. 101, 117-144 (1993).</li>
<li>Tsunoda, S. P., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glu+87+of+Channelrhodopsin-1+Causes+pH-dependent+Color+Tuning+and+Fast+Photocurrent+Inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Glu 87 of Channelrhodopsin-1 Causes pH-dependent Color Tuning and Fast Photocurrent Inactivation.</a> Photochem. Photobiol. 85, 564-569 (2009).</li>
<li>Cha, A., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+implications+of+fluorescence+quenching+in+the+Shaker+K%2B+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Structural implications of fluorescence quenching in the Shaker K+ channel.</a> J. Gen. Physiol. 112, 391-391 (1998).</li>
<li>Förster, T. Ann Physik. 2, 55-75 (1948).</li>
<li>Dong, X., Stothard, P., Forsythe, I. J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PlasMapper%3A+a+web+server+for+drawing+and+auto-annotating+plasmid+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">PlasMapper: a web server for drawing and auto-annotating plasmid maps.</a> Nucleic Acids Res. 32, W660-W664 (2004).</li>
</ol>

Biz tarif deneysel yaklaşım siteye özgü fluorofor etiketleme ve iki elektrot voltajı, membran proteinlerin yapı ve fonksiyon arasındaki ilişkiyi araştırmak için kelepçe birleştirir. Bu teknik, iyon taşıma sırasında membran proteinlerinin konformasyonel dinamikleri zaman çözüme bilgiler elde etmek için kullanılabilir. Ayrıca, bu yaklaşım, iyon pompaları, iyon kanalları ve taşıyıcıları gibi çeşitli proteinlerin ile çalışmak için uygun olabilir. Belirli bir kalıntı konformasyonel dinamiklerini araştırıyor ek olarak, bir holoenzyme içinde mesafe sınırlamaları belirlemek için floresan rezonans enerji transferi için de kullanmak mümkündür. Kalıntılarının yanı olarak ölçüm altbirimden arasındaki göreceli hareketi arasındaki uzaklıkları belirlenmesi yolluk mekanizmaları ile ilgili anahtar sorular çözmeye yardımcı olabilir.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif / Ekipman </th><th> Şirket </th><th> Reaktif / Ekipman </th><th> Şirket </th></tr><tr><td> 100W Tungsten Işık Kaynağı </td><td> Carl Zeiss Microimaging </td><td> floresein-5-maleimide </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> 1B150F-4 </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> Yüksek Saf-PCR Ekstraksiyon Kiti </td><td> Roche </td></tr><tr><td> 3,0-4,0 Ethicon Vicryl </td><td> Johnson &amp; Johnson </td><td> mMessage mMachine Kit </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> 475AF40 eksitasyon filtresi </td><td> Omega Optik </td><td> MS-222 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> 505DRLP dikroik aynalar </td><td> Omega Optik </td><td> Nucleospin Plazmid seti </td><td> MACHEREY-Nagel </td></tr><tr><td> MACHEREY-Nagel </td><td> Omega Optik </td><td> Nanodrop 2000c Sprectrophotometer </td><td> Thermo Scientific </td></tr><tr><td> 535DF50 eksitasyon filtresi </td><td> Omega Optik </td><td> PC-10 Mikropipet Çektirme </td><td> Narishige </td></tr><tr><td> 560DRLP dikroik aynalar </td><td> Omega Optik </td><td> 10 Yazılım pCLAMP </td><td> Akson Aletleri </td></tr><tr><td> 565ALP emisyon filtresi </td><td> Omega Optik </td><td> PfuTurbo DNA Polimeraz </td><td> Strategene </td></tr><tr><td> 565EFLP emisyon filtresi </td><td> Omega Optik </td><td> PIN-022A Photodiode </td><td> Birleşik Dedektör Teknolojileri </td></tr><tr><td> 570DRLP dikroik aynalar </td><td> Omega Optik </td><td> Polarize Filtreler </td><td> Linos Phtonics Inc. </td></tr><tr><td> Linos Phtonics Inc. </td><td> Omega Optik </td><td> QuickChange Site Yönetmen Mutagenisis Seti </td><td> Stratagene </td></tr><tr><td> Axio Examiner Floresan Mikroskobu </td><td> Carl Zeiss MicroImaging GMBH </td><td> RC-10 Floresans Odası </td><td> Warner Aletleri </td></tr><tr><td> Warner Aletleri </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> tetramethylrhodamine-6-maleimide </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Digidata 1440A veri toplama sistemi </td><td> Akson Aletleri </td><td> TOP10 Electrocompetent hücre </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> DPN I </td><td> New England Biolabs </td><td> Turbo Tec-05X amplifikatör </td><td> NPI </td></tr></tbody></table>

membran proteinleri konformasyonel dynamics incelenmesi in situ site floresan etiketleme

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

İki elektrot voltajı kelepçe elektrofizyoloji (TEVC), iyon kanalları 2, iyon pompaları 3, ve nakliyecileri 4 de dahil olmak üzere geniş bir yelpazede zarı proteinleri iyon transport1 mekanizmasını araştırmak için güçlü bir araçtır. Son gelişmeler, aynı anda tek hücre yüzeyinde bu proteinlerin belirli artıkları ve fonksiyon konformasyonel dinamiklerini incelemek için TEVC yanında siteye özgü fluorofor etiketleme kombine var. Biz membran proteinlerin aynı anda, voltaj kelepçe Florimetri kullanılarak floresans ve akım değişiklikleri izleme konformasyonel dinamiklerini incelemek için bir yöntem anlatacağım. Bu yaklaşım, site özellikle aşağıdaki sistein değiştirme ve site yönetmenliğini fluorofor etiketleme 5,6 membran proteinlerinin moleküler hareket incelemek için kullanılabilir. Ayrıca, bu yöntem, özel kalıntıları arasındaki mesafe 7,8 kısıtlamaları belirlemek için bir yaklaşım sağlar . Bu ilgi iki mutasyona uğramış sistein kalıntıları için, verici ve alıcı fluorophores seçici ekleyerek elde edilir. Kısacası, bu deneyler Xenopus Leavis oosit yüzeyinde istenen proteinin fonksiyonel ifade yapılmaktadır. Bu oositlerin geniş yüzey alanı facile fonksiyonel ölçümleri ve sağlam bir floresan sinyal 5 sağlar. Bu kolayca membran proteinlerinin 4 mekanizma hakkında daha fazla bilgi sağlayabilir, pH, ligand katyon / anyon gibi ekstrasellüler koşulları değiştirmek için de mümkündür . Son olarak, son gelişmeler, aynı zamanda ikinci bir protein 9 ile birlikte ifade seçin iç iyonlarının manipülasyon sağlamıştır. Bizim protokol birden fazla parça açıklanmıştır. İlk olarak, fluorofor etiketleme transmembran ve ekstrasellüler etki alanı arayüzünde bulunan kalıntılarının sistein tarama mutagenez ilerledi. Daha sonraki deneyler, protein konformasyonel değişiklik üzerine floresan (&lt;% 5) 3 büyük değişiklikler göstermektedir artıkları belirlemek için tasarlanmıştır. İkincisi, floresan yoğunluğu bu değişiklikler için 10 protein işlevine konformasyonel dinamikleri ilişkili membran proteini kinetik parametreleri karşılaştırıldı. Bu hedef proteinin moleküler hareket sıkı bir biyofiziksel analiz sağlar. Son olarak, iki artıkları holoenzyme donör photodestruction yöntemler kullanarak mesafe kısıtlamaları belirlemek amacıyla bir donör ve alıcı fluorofor ile etiketlenmiş olabilir. Verici ve alıcı fluorofor ile etiketleme aşağıdaki protein alt birimlerinin göreli hareketlerini izlemek için de mümkündür.

Biz tek hücreleri üzerinde floresan kullanarak yapı değişiklikleri siteye özgü analizi ile birlikte membran proteinlerinin iyon taşıma kinetiği ölçen bir yöntem anlatacağım. Bu teknik, iyon kanalları ve iyon pompaları uyarlanabilir ve protein altbirimden arasındaki mesafe sınırlamaları belirlemek için kullanılabilir.

Membran Proteinleri Konformasyonel Dynamics incelenmesi In situ Site Floresan Etiketleme

İki elektrotlu voltaj klemp elektrofizyolojisi (TEVC), çok çeşitli membran... için iyon taşıma mekanizmasını araştırmada güçlü bir araçtır1...

Bu prosedürün genel amacı, tekil hücrelerin yüzeyinde bölgeye özgü floresan işaretleme kullanarak membran proteinlerinin konformasyonel dinamiklerini incelemektir. Bu işlem, öncelikle hücre dışı ve transmembran bölgelerin arayüzündeki kalıntıların, kırmızı C ile gösterildiği gibi tek tek sistine mutasyona uğratılmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, bu kalıntının sistinle reaksiyona giren bir florofor ile işaretlenip işaretlenemeyeceğinin belirlenmesi gerekir. Prosedürün ikinci adımı ise sistin mutajenezin ve/veya florofor işaretlemenin, proteinin kinetiğini ve/veya konformasyonel durumunu etkileyip etkilemediğini incelemektir.Bu işlem, gösterilen düzenek kullanılarak gerçekleştirilir. Prosedürün üçüncü adımı, floresans yoğunluğundaki değişimleri hedef proteinin kinetik parametreleri ile karşılaştırmak ve aralarındaki farkları belirlemektir. Tipik bir floresans izi burada gösterilmiştir.Prosedürün son adımı, mesafe kısıtlamalarını belirlemek amacıyla voltaj klemp ölçümleriyle eş zamanlı olarak fotoyıkım hızlarını ölçmek için mutasyona uğramış sistein çiftlerini ya donör Flor dörtleri ya da donör akseptör Flor dörtleri ile etiketlemektir. Bu şekil, akseptör yokluğundaki donör fotoyıkım hızlarını siyahla, akseptör varlığındaki donör fotoyıkımını ise kırmızıyla göstermektedir. Nihayetinde, protein konformasyonel değişikliklerinin sonucu olan floresan yoğunluğundaki değişimlerin, voltaj klemp florometrisi aracılığıyla membran proteini fonksiyonu ile ilişkilendirilebildiğini gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bu yöntem, proteinin konformasyonel durumundaki değişikliklerin plazma membranı boyunca küçük molekül ve iyon transportunu nasıl kolaylaştırdığı gibi, membran iyon transportu alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Prosedüre, sodyum potasyum pompasını Xenopus oosit ekspresyonu için uygun bir vektöre klonlayarak başlayın. Bir sonraki adım, beraberindeki makalede belirtildiği üzere, transmembran ve ekstraselüler domainlerin ara yüzeyinde bulunan kalıntılarda sistein mutasyonları oluşturmaktır.İşlem tamamlandığında, eşlik eden makalede belirtildiği üzere plazma DNA'sı mRNA'ya transkribe edildikten sonra DNA dizileme ile mutasyonun yerleşimini doğrulayın ve cerrahi işlem öncesinde bir spektrofotometre kullanarak mRNA verimini miktar belirleme yöntemiyle ölçün. Operasyon sırasında kusmayı önlemek için kurbağa 12 saat boyunca aç bırakılmalıdır. Ertesi gün cerrahi işleme başlamak için, kurbağa ayak parmağı sıkıştırmasına tepki vermeyene kadar anestezik solüsyonun içinde bekletin.Kurbağayı anestezik solüsyondan çıkarın ve bir bebek bezi pedinin emici tarafına sırtı aşağı gelecek şekilde yerleştirin. Kurbağanın nemli kalmasını sağlamak için üzerine ıslak bir kağıt havlu koyun. Ayrıca, kurbağanın gözleri açıksa, bunları salin solüsyonu ile nemli tutun.Kurbağanın orta hattının bir tarafında küçük bir cerrahi kesi yapın. Yumurtalığı bulun ve kurbağanın dışına çıkarın. Yumurtalığın deriye temas etmemesine dikkat edin.Overi çıkarın ve ringer çözeltisi içeren bir Petri kabına yerleştirin. Kalan dokuda kanama olup olmadığını kontrol ettikten sonra dokuyu tekrar smic boşluğuna yerleştirin. Kanama meydana gelirse, kanama durana kadar steril bir pamuklu çubukla baskı uygulayın.Kesi yerini ayrı dikiş yöntemiyle dikerek ameliyatı tamamlayın. Kurbağayı, makas kullanarak anestezi etkisinden kurtulması için barınağına geri koyun. İzole edilen over lobunu daha küçük parçalara ayırın.Kümelenmeleri, kollajenaz eklenmiş kalsiyumlu ringer solüsyonuna aktarın. Ardından, sindirim solüsyonunu 18 °C'de iki saat boyunca hafifçe çalkalayın. Hücrelerin çoğu ayrıldığında, oositleri kalsiyumsuz ringer solüsyonu ile yıkayın.Ardından oositleri oda sıcaklığında, kalsiyumsuz ringer solüsyonunda 10 dakika boyunca inkübe edin. Bu aşamada, hücreleri kalsiyumlu ringer solüsyonu ile kapsamlı bir şekilde yıkayın. Son olarak, enjeksiyon öncesi saklama için oositleri kalsiyumlu ringer solüsyonuna aktarın.Bir sonraki adım için, sentezlenen mRNA'yı -20 °C dondurucudan çıkarın. mRNA'nın 25 ng miktarını 50 nL nihai hacme ekleyin. Ardından, mRNA'yı enjeksiyondan sonra sitlere enjekte edin.Oositleri ringer çözeltisine ve mililitre başına bir miligram gentamisine yerleştirin ve 18 °C'de, karanlıkta üç ila yedi gün boyunca inkübe edin. Bu işlem, sodyum potasyum pompasının oosit plazma membranında eksprese edilmesini sağlar. Deney günü, oositleri inkübatörden çıkarın ve 45 dakika boyunca yükleme tamponuna, ardından 45 dakika boyunca yükleme sonrası tamponuna yerleştirin.Bu işlem, sodyum potasyum pompasının ölçümünü kolaylaştırmak için hücre içi sodyum konsantrasyonunu artırır. Floresans ölçümleri için, oositleri TMRM veya FM gibi istenen florofordan 5 µM içeren bir yükleme sonrası tamponunda, karanlıkta 5 ila 10 dakika inkübe edin. Florofor etiketlemesinden sonra, oositleri boya içermeyen yükleme sonrası tamponu ile iyice yıkayın.Fotobeyazlamayı önlemek için oositleri karanlıkta tutun. İki elektrotlu voltaj klemp ölçümlerine hazırlanmak için, öncelikle mikro elektrotları 3 M potasyum klorür ile doldurun ve direnci test edin. Direnç 0,5 ile 1,5 mega ohm arasında olmalıdır.Sistein tarama deneyleri için floresan mikroskobunu 5 35 DF 50 uyarım filtresi, 5 65 EFLP emisyon filtresi ve beş 70 DRLP diic aynası ile donatın. Ardından, oosit'i floresan mikroskop tablasındaki bir RC 10 haznesine yerleştirin. Daha sonra, membran potansiyelini sabit bir değerde tutmak için amplifikatörü kullanarak her iki mikroelektrodu nazikçe oosit'in içine yerleştirin.Çözelti değişimi veya membran potansiyelini değiştirme gibi uygun bir teknik kullanarak proteini aktive ederek membran boyunca iyon akışını ölçün. Eş zamanlı floresans ölçümleri için, donör floroforu uyarmak amacıyla 100 watt'lık bir tungsten ışık kaynağı kullanın ve floresan etiketleme için floresans yoğunluğundaki değişiklikleri tespit etmek amacıyla 0 2 2, A foto DDE'yi sabitleyin. Sistein taramasını takiben.P clamp 10 yazılımı tarafından kontrol edilen voltaj adımları kullanarak, sabit akımdaki floresan yoğunluk değişimini ölçün. Protokolün ikinci bölümü, mesafe ölçümleriyle birlikte anes atrofi ölçümlerinin alınmasını içerir. Kappa kare değerlerinin aralığını hesaplamak için, bir atrofi rotasyon nedeniyle fluoro four'un göreceli hareketliliğini ölçer.Hesaplamaların ayrıntıları için ekteki makaleye bakınız. Mesafe kısıtlamalarını ölçmek için, floroforlarla işaretlenebilen erişilebilir iki ekstraselüler sistein kalıntısına sahip bir holo enzim kullanın. Bir mikromolar FM ve dört mikromolar TMRM içeren yükleme sonrası tamponu ekleyin.Bunlar donör ve akseptördür. Bir grup oosite sadece 1 µM FM ekleyin. Bu sadece donör floresan boyadır.Diğer oosit grubuna dört adet ekleyin; her iki oosit grubunu da karanlıkta, buz üzerinde 30 dakika boyunca inkübe edin. Bu işlem, akseptör fluoro four ile işaretlenmiş ve işaretlenmemiş hollo enzimlerinin ölçümlerinin yapılmasına olanak tanır. Ardından, mikroskobu 4 75 DF 40 eksitasyon filtresi, 5 30 DF 30 emisyon filtresi ve 5 0 5 DRLP dikroik ayna ile donatın.Ardından oositi floresan mikroskop tablasındaki hazneye yerleştirin. Sürekli bir solüsyon akışını koruyarak, akseptör floroforun varlığında ve yokluğunda donör beyazlamasının zamana bağlılığını ölçün. Dört. Bu sonuçlar, Förster teorisi kullanılarak sodyum potasyum pompasındaki iki kalıntı arasındaki mesafeyi hesaplamak için kullanılabilir.Proteinin fonksiyonel olduğundan emin olmak için eş zamanlı olarak iki elektrotlu voltaj klemp ölçümleri yapılmalıdır. P clamp 10'daki klemp X özelliğini kullanarak, en az dört farklı bölge kaydı için donör floroforun fotoyıkım sonuçlarının ortalamasını alın. Protein alt birimlerinin bağıl hareketini ölçmek için akseptör ve donör floroforlar içeren çift sistein konstrüktleri kullanın.Bu kalıntılardaki floresan yoğunluğu, proteinin konformasyonel durumuna karşı duyarsızdır ve iki flüoresan arasındaki mesafenin bir fonksiyonu olacaktır. Ardından, mikroskoptaki filtre setini 4 75 a F 40 eksitasyon filtresi, 5 95 a F 60 emisyon filtresi ve 5 0 5 DRLP dikroik ayna ile değiştirin. Daha sonra OI'yi floresan mikroskop tablasındaki hazneye yerleştirin.Ardından, donör 100 watt'lık bir tungsten ışık kaynağı ile uyarılır ve akseptör olan Fluoro four'un floresan yoğunluğu ölçülür. Voltaj ligandı veya çözelti değişimi gibi uygun bir yöntem kullanılarak membran proteini aktive edilir ve eş zamanlı olarak floresan yoğunluğundaki değişim ölçülür. Bu şekil, hücre membranı boyunca gerçekleşen iyon transportu ile floresan yoğunluğundaki değişimler arasındaki korelasyonu göstermektedir.Üst iz, 10 mikromolar ve 10 milimolar ing varlığında, sodyum test çözeltisi ve potasyum test çözeltisinin mevcudiyetindeki akım kenetleme ölçümlerini göstermektedir. Alt iz, akım kenetleme ölçümleriyle eş zamanlı olarak ölçülen floresans yoğunluğundaki değişimleri göstermektedir. Bu şekil, akseptör florofor dört olan TMRM ile işaretlenmiş iki oositi göstermektedir.Soldaki oosit vahşi tip sodyum potasyum atpa eksprese ederken, sağdaki oosit tek bir erişilebilir sistein kalıntısına sahip sodyum potasyum APA'ları eksprese etmektedir. Bu şeklin üst izleri, voltaj darbesi üzerine geçici akım verilerini göstermektedir. Alt izler ise voltaj darbesi üzerine floresans yoğunluğundaki değişimlerin gerçek zamanlı kayıtlarını göstermektedir.Bu şekil, fotobağışçı yıkımının zamana bağlılığını göstermektedir; donör foto-yıkımı, akseptör floroforun yokluğunda ve varlığında ölçülmüştür; fotobağlanma, akseptör florofor olmadan daha hızlı gerçekleşir. Her iz, dört farklı konumdaki kayıtların ortalamasıdır. Bu şekil, konformasyonel değişiklikler üzerine gerçekleşen göreceli alt birim hareketini göstermektedir.Floresan değişiklikleri kırmızı izlerle ve akım akışı siyah izlerle gösterilmiştir. Solda gösterilen floresan yoğunluğundaki artış, florforların birbirine daha fazla yaklaştığını göstermektedir. Ortada gösterilen floresan yoğunluğundaki hiçbir değişiklik, florfor mesafesinin sabit kaldığını göstermektedir.Sağda gösterilen floresan yoğunluğundaki azalma, bu prosedür uygulanırken floroforların birbirinden daha fazla uzaklaştığını belirtir. Kinetik ve kararlı durum floresan yoğunluğundaki değişimleri, proteindeki konformasyonel değişikliklerle ilişkilendirmeyi hatırlamak önemlidir.

examining-conformational-dynamics-membrane-proteins-situ-with-site

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video makalede, triptofan floresan membran protein katlanması Gibbs serbest enerji elde etmek için deneysel prosedür.

Membran Protein katlanması, Termodinamik Floresans Spektroskopisi ile ölçülür.

Biz canlı hücre konfokal görüntüleme vasıtasıyla, endoplazmik retikulum (ER) içerisinde yerleşik transfekte floresan protein dağılımı ve hareketliliği incelemek için kullanılan görüntüleme yaklaşımı tarif eder. Biz de ultrastruktural bu subselüler bölmesinin mimarisi üzerine kendi ifade etkisini analiz.

Kültür Hücrelerinin retikulum Subdomain&#39;ler Görselleştirme

Plazma zarı proteinlerinin ve lipitlerinin mekansal dağılımı ve zamansal dinamikleri biyolojide sıcak bir konudur. Burada bu sorun, kavramsal olarak tek parçacık izlemenin aynı fiziksel miktarlarını sağlayan bir uzaysal-zamansal görüntü dalgalanma analizi ile ele alınmaktadır, ancak küçük moleküler etiketler ve standart mikroskopi kurulumları kullanır.

Ticari Mikroskop Canlı Hücre Zarları Moleküler Difüzyon Kanunu Hızlı Floresans Görüntüleme Gönderen

Burada, canlı hücrelerdeki integral zar proteinlerinin oryantasyonunu ve topolojisini belirlemek için bir protokol sunuyoruz. Bu basit protokol, ilgilenilen protein ile GFP arasındaki kimeraların seçici proteaz duyarlılığına dayanır.

Floresan Proteaz Koruma Kullanma Membran Protein topolojisini belirlenmesi (FPP)

Birçok protein, zar yüzeylerine bağlandığında işlevlerini yerine getirir. Ekstrinsik proteinlerin nanodisk membranları üzerindeki bağlanması, transmisyon elektron mikroskobu ile dolaylı olarak görüntülenebilir. Negatif leke sodyum fosfotungstat tarafından indüklenen nanodisklerin karakteristik istiflenmesinin (rouleau), ekstrinsik proteinin bağlanmasıyla önlendiğini gösteriyoruz.

Yöntem gözünüzde canlandırın ve Transmisyon Elektron Mikroskobu Membran Etkileşen Proteinler Analiz için

Bu protokol, hücresel bir ortamda reseptörlere gerçek zamanlı olarak adenin nükleotid bağlanmasını ölçmek için bir yöntem sunar. Bağlanma, trinitrofenil nükleotid türevleri ile kanonik olmayan, floresan amino asit ile etiketlenmiş protein arasındaki Förster rezonans enerji transferi (FRET) olarak ölçülür.

Sağlam, fonksiyonel membran proteinlerine bağlanan nükleotidin gerçek zamanlı olarak ölçülmesi

Bu çalışma, doğal olmayan amino asit (UAA) dahil etme yoluyla bölgeye özgü etiketleme kullanarak G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler) üzerinde tek moleküllü floresan rezonans enerji transferi (smFRET) deneyleri gerçekleştirmek için ayrıntılı bir prosedür sunmaktadır. Protokol, smFRET numune hazırlama, deneyler ve veri analizi için adım adım bir kılavuz sağlar.

Tek Moleküllü FRET Kullanarak Membran Reseptörlerinin Konformasyonel Dinamiğinin Görselleştirilmesi

Bu protokol, bireysel iyon kanallarını izlemek ve desteklenen lipit membranlarındaki aktivitelerini belirlemek için TIRF mikroskopisinin nasıl kullanılacağını açıklar, böylece yanal membran hareketi ile kanal fonksiyonu arasındaki etkileşimi tanımlar. Membranların nasıl hazırlanacağını, verilerin nasıl kaydedileceğini ve sonuçların nasıl analiz edileceğini açıklar.

Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) Mikroskobu Kullanılarak Lipid Çift Katmanlarında Yanal Mobilite ve İyon Kanalı Aktivitesinin Tek Moleküllü Görüntülenmesi

Burada, konfokal mikroskopi modunda tek molekül seviyesinde zamanla çözülen floresan anizotropi kullanarak biyomoleküllerin yerel esnekliğini ve dinamiklerini incelemek için protokolü sunuyoruz.

Biyomoleküllerde Yerel Esnekliği Karakterize Etmek için Tek Moleküllerden Zamanla Çözülen Floresan Anizotropisi

Bu makale, katı destekli lipid çift katmanlarında tek protein izleme için örnekler nasıl oluşturulacağına dair ayrıntılı bir açıklama sunmaktadır. Ayrıca, tek molekül hassasiyeti ve hızlı kare hızına sahip basit bir floresan mikroskobu da açıklar. Son olarak, tek protein yörüngelerinin çıkarılması prosedürünü özetliyoruz.

Lipid çift katmanlarında tek proteinlerin floresan mikroskopisi kullanılarak takibi

Öğrenin, tek hücrelerde floresan etiketleme kullanarak membran proteinlerinin konformasyonel dinamiklerini ve iyon taşıma kinetiğini nasıl inceleyebilirsiniz. Bu yöntem, voltaj kelepçe florometrisi ile protein fonksiyonunu anlamanıza yardımcı olur.

Membran Proteinleri Konformasyonel Dynamics incelenmesi In situ Site Floresan Etiketleme

Daha fazla video keşfet