Dinamik Maske Projeksiyon Fotolitografi kullanarak Sinir Kültür Sistemleri Micropatterned Hidrojeller Fabrikasyon

Bu prosedürün genel amacı, nöronal çalışmalar için mikro desenli, çift hidrojel bir hücre kültürü sistemi oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle embriyonik dorsal kök ganglionları gibi doku implantlarının geçirgen hücre kültürü insertlerine ekilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, dinamik bir foto maske olarak dijital mikro ayna cihazı veya DMD kullanılarak, foto çapraz bağlanabilir bir hidrojel içerisinde mikro bir desen oluşturulur.

Bunu, ayrıştırılmış hücrelerin bir süspansiyonunu içerebilen, saf haldeki kendi kendine düzenlenen hidrojelin eklenmesi takip eder. Hücresel analizden önce uygun inkübasyon süresi gereklidir. Nihayetinde, DMD tarafından tanımlanan belirli geometrik konfigürasyonlar aracılığıyla nöronal hücre canlılığını ve nörit uzamasını gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, geçirgen hücre kültürü insertleri gibi hemen hemen her türlü substrata uyum sağlayacak şekilde, dinamik bir foto kütlenin hızla oluşturulabilmesi, değiştirilebilmesi ve uzaktan yansıtılabilmesidir. Bu yöntem nöral sistemler hakkında bilgi sağlayabilmenin yanı sıra; hücre sinyalleşmesi, hücre migrasyonu, hücreden hücreye temas veya morfogenez gibi belirtilebilir geometrik kısıtlamalardan fayda sağlayabilecek diğer sistemlere de uygulanabilir. DMD kartı, UV ışıkları, kılavuz ve 4x objektif lensin tamamı bir titreşim izolasyon masası üzerine dikey olarak monte edilmiştir.

DMD'den yansıyan odak ışığı mikroskop aracılığıyla görselleştirilebilecek şekilde, ters bir mikroskop objektif lensinin altına yerleştirilir. DMD kurulumuna ilişkin ek ayrıntılar için lütfen beraberindeki yazılı protokole bakınız. İlk olarak, X explan kültürlerini almak üzere altı kuyucuklu kolajen kaplı hücre kültürü insertlerini hazırlayın; hücre kültürü insertlerinin duvarlarını, Rain X'i membranın kendisine uygulamamaya dikkat ederek Rain X ile kaplayın.

Ardından insertlere 1,5 milliliters aian medyum ekleyin ve 37 °C ve %5 karbon dioksit ortamında gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, E 15 sıçan yavrularından embriyonik dorsal kök ganglionlarını topladıktan sonra, kolajen kaplı her bir altı kuyucuklu inserte dört adede kadar DRG ekleyin ve DRG'lerin membrana yapışmasını sağlamak için 37 °C ve %5 karbon dioksit ortamında iki saat boyunca inkübe edin.

İnkübasyon süresinin ardından DRG'ler fotopolimerizasyon için hazır olacaktır. Dijital mikro ayna aygıtı (DMD), aynanın konumuna göre ışığı seçici olarak yansıtan 1024'e 768 boyutlarında tekil aynalardan oluşan bir dizidir. Bu prosedürde DMD, bağlanabilir hidrojeller olan foto CRO'lar üzerine ultraviyole ışığı desenlemek için kullanılır ve böylece belirlenebilir hidrojel geometrileri basit ve hızlı bir şekilde oluşturulur.

DMD'miz bağımsız bir ünite olsa da, cihaz mevcut birçok mikroskopla entegre edilerek de kullanılabilir. Öncelikle, DRGX bitkilerini inkübatörden çıkarın ve insert içindeki tüm fazla sıvıyı aspire edin. Ardından, insert'in içine 500 microliters polimerizasyon medyumu ekleyin.

DRGX bitkilerini içeren insertleri rain extre cam lamı üzerine aktarın ve lamı DMD'nin altına yerleştirin. Fotoğraf maskesi olarak kullanılacak siyah beyaz görüntüyü DMD'ye yüklemek için ALP three temel grafik kullanıcı arayüzü programını kullanın. Bu durumda, ters mikroskop ve DI görünür ışık kaynağı kullanılarak nörit kılavuzlama sistemlerinin uygulanabilmesi için çatallı bir şekil seçilmiştir.

DMD'den yansıyan ışığı kılavuz olarak kullanarak, doku kesitini foto maske üzerindeki uygun konuma hizalayın. Ardından, görünür ışık kaynağını bir UV ışık kaynağı ile değiştirin. Hücre kültürünün içindeki polimerizasyon ortamını aydınlatın.

PEG çapraz bağlanması tamamlanana kadar bekletin. Eklemdeki her bir DRG için işlemi tekrarlayın. Ardından, her bir eklemi %1 penisilin streptomisin içeren steril dcos fosfat tamponlu salin ile üç kez yıkayın.

Son olarak, hücre kültürü insertlerinin altına 1,5 milliliters büyüme medyumu ekleyin ve 37 degrees Celsius sıcaklık ile %5carbon dioxide içeren bir doku kültürü inkübatöründe 30 dakika boyunca dengelenmeye bırakın. İnkübasyon süresi boyunca, saf matrisi 30 dakika boyunca sonike edin. Peptidleri çözmek için, temin edilen %1solution steril su ile %0,15 seviyesine seyreltin ve mililitre başına bir microgram çözünür laminin ile takviye edin.

30 dakika sonra kültürleri inkübatörden çıkarın ve insertteki tüm fazla medyumu aspire edin. Ardından, mikroskop altında boşluğu gözlemlerken, DRGX eksplan içeren PEG yapısındaki boşaltılmış alanın içindeki medyumu aspire edin ve X eksplanın etrafındaki boşluğa yaklaşık 1 µL saf matris çözeltisi pipetleyin. Saf matrisin peg boşluğundan taşmadığından emin olun.

Ardından, insertin altına 1.5 milliliters büyüme besiyeri pipetleyin ve kültürleri 37 °C ve %5 carbon dioxide koşullarında doku kültürü inkübatörüne bir saatliğine yerleştirin. Bu sürenin sonunda tam tutunmayı sağlamak için büyüme besiyerini yenileyin ve ardından kültürleri inkübatöre geri koyun. Büyüme besiyeri, her 48 saatlik kültür süresinden sonra yenilenir.

DRGX bitkileri içeren çift hidrojel yapı örnekleri burada gösterilmiştir. DRGX bitkileri, büyüme ve proliferasyon belirteçleri için işaretlenmiştir. Polimerize PEG yapı gri renkte görünmekte, beta three tubulin ile işaretlenmiş DRG NEURITLERİ yeşil renkte görünmekte ve DPI boyası hücre çekirdeklerini mavi renkte boyamaktadır.

Hücresel migrasyonun ve retikül uzanımının, çift hidrojel yapısının hücreye izin veren bölgesiyle sınırlı olduğu görülmektedir. Çift hidrojel enkapsülasyonu, herhangi bir kendi kendine organize olan jel ve fotokroslinklenebilir jel kullanıldığında uygundur. Bu durumda PEG, kendi kendine organize olan jelin geometrik sunumu için yapısal bir destek görevi görür.

Örneğin, saf matris veya aris. Jel tipi ve foto maske seçimi, hedeflenen özel uygulamaya bağlı olacaktır. Polyester hücre kültürü insertinin duvarlarını, daha önce gösterildiği gibi Rain X ile işlemden geçirin.

İnserti Rain X kaplı bir lam üzerine aktarın ve DMD altına yerleştirin. Ardından, inserte 500 µL polimerizasyon medyumu ekleyin. Bu sağkalım deneyi için DMD üzerine uygun maskeyi yükleyin.

Hücrelerin görüntülenmesine yardımcı olmak için saf matristen oluşan silindirik bir sunum kullanılır. Çapraz bağlama işleminden sonra, peg çapraz bağlanmasını indüklemek için inserti 55 saniye boyunca UV ışığına maruz bırakın. Yeni oluşan boşluğu steril DPBS ve %1 pen strep ile yıkayın.

Boşluktaki tüm fazla sıvıyı uzaklaştırmak için bir mikro pipet veya steril pamuklu aplikatör kullanın. Saf Matrixx'i 30 dakika boyunca sonikasyona tabi tutarak hazırlayın; ardından steril su ile %0,15 konsantrasyona seyreltin ve mililitre başına bir mikrogram çözünür laminin ile %10 sükroz ekleyin. Ardından, kültüre edilecek hücreleri santrifüjle çöktürün.

Besiyerini hücre peletinden tamamen aspire edin ve peleti %0,15'lik pure matrix çözeltisi içerisinde mililitre başına yaklaşık beş x 10³ hücre konsantrasyonunda yeniden süspande edin. Pure matrix, tuz çözeltisi ile temas ettiğinde kendi kendine montajlanmaya başladığı için tüm besiyerinin hücre peletinden aspire edilmesi kritik öneme sahiptir. Ardından, takviye edilmiş pure matrix hücre karışımından yaklaşık 1 µL'yi peg boşluğuna pipetleyin.

Bu hacim, genellikle pipet 1.5 mililitre büyüme ortamını insertin altına eklemeden boş alanı doldurmak için yeterlidir. Ardından, tam jelleşmeyi sağlamak için saf matriks ikincil hidrojeli 37 °C ve %5 karbondioksit içeren doku kültürü inkübatörüne bir saatliğine yerleştirin. Bu sürenin sonunda, mekanik olarak zayıf olan saf matrise zarar vermemeye dikkat ederek ortamı aspire edin ve insertin altına taze ortam ekleyin.

Kültürleri doku kültürü inkübatörüne geri yerleştirin ve her 48 saatlik kültür süresinin ardından medyayı değiştirin. Burada, çeşitli çiftli hidrojel konstrüktler içerisine enkapsüle edilmiş canlı DRG nöronlarına örnekler yer almaktadır. Büyüme medyumunda 48 saat bekletildikten sonra hücreler, yeşil renkte görünen bir canlı hücre markörü olan kalsiyum am ile işaretlenmiştir.

Burada, DMD foto maskesinin dinamik doğası nedeniyle, enkapsülasyon için mevcut olan geometri yalnızca optiklerin boyutları ve çözünürlüğü ile sınırlıdır. Hücrelerin, polyester hücre kültürüne uygun şekilde foto çapraz bağlanabilir bir hidrojelin içinde incelenebildiği durumlarda tek bir hidrojel enkapsülasyonu uygundur. Rain X ile yerleştirin ve Rain X kaplı bir lam üzerine, DMD'nin altına yerleştirin.

Daha önce olduğu gibi, kültürlenecek hücreleri istenen konsantrasyonda doğrudan polimerizasyon ortamına pipetleyin ve homojen dağılım sağlamak için iyice karıştırın. Ardından, polimerizasyon ortamı hücre karışımından 500 µL'yi insert içerisine pipetleyin. Uygun maskeyi seçip DMD üzerine yükleyin ve UV ışığına 55 saniye boyunca maruz bırakarak PEG çapraz bağlanmasını başlatın.

Hücre sağkalım çalışmaları için, bir silindiri temsil etmek amacıyla temel bir dairesel maske kullanılır; inserti steril DPBS ve %1 pen strep ile üç kez yıkayın, ardından insertin altına 1,5 milliliters büyüme besiyeri ve üstüne inserti tamamen daldıracak kadar büyüme besiyeri ekleyin; 37 degrees Celsius ve %5 carbon dioxide koşullarında, her 48 saatte bir besiyeri değişimleri yaparak inkübe edin. Burada, peg içine kapsüllenmiş canlı disosiye kortikal nöronların bir örneği yer almaktadır. Canlı hücreler kalsiyum am ile işaretlenmiş olup yeşil görünürken, ölü hücreler ahy homodimer one ile işaretlenmiş olup kırmızı görünmektedir.

PEG ile enkapsülasyon sadece bir örnek olarak verilmiştir; zira PEG, nöral hücreler için ideal bir ortamı temsil etmez. Seçilen geometri, hücre canlılığını incelemek için basit bir yöntem sunar ancak geniş bir yapı yelpazesine uyarlanabilir. Sınırlı hücrenin spesifik paternlerini oluşturmak için ince film hidrojeller kullanılabilir.

Tekrar, polyester hücre kültürü insertini daha önce olduğu gibi rain X ile işleyin ve rain X işleminden geçmiş bir lam üzerine yerleştirin. Ardından, işlem görmüş hücre kültürü insertinin tabanına 250 ila 300 µL polimerizasyon medyumu pipetleyin. Bu hacim, insertin tabanını yeni ucu ucuna kaplamak için yeterlidir; medyumun insert membranına nüfuz etmesini sağlamak için oda sıcaklığında 30 ila 45 dakika inkübe edin ve ardından insertteki fazla medyumu bir mikro pipet ile aspire edin.

Ardından, alanı tamamen kaplayacak şekilde insertin tabanına yeterli miktarda UV şeffaf yağ pipetleyin. Inserti, yağın polimerizasyon ortamının üzerinde belirgin bir tabaka oluşturması için yeterli olan 15 ila 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Insert membranını doyurduktan sonra DMD üzerine uygun bir maske yükleyin.

Insert ve lamı DMD altına yerleştirdikten sonra UV ışığına maruz bırakarak PEG çapraz bağlanmasını indükleyin. Inserti üç kez steril DPBS ve %1 pen strap ile yıkayın; yıkama işleminden sonra inserti altı kuyucuklu bir doku kültürü plakasına aktarın, kültüre edilecek hücreleri toplayın ve peletleyin. Besiyerini aspire edin ve hücre peletini, mililitre başına 10⁴ ile 10⁶ hücre arasındaki istenen konsantrasyonda büyüme besiyeri içerisinde yeniden süspande edin.

Ardından, istenen hücre yoğunluğunu elde etmek için hücre kültür insertinin içine yeterli hacimde hücre süspansiyonu pipetleyin. Hücre canlılığını tam olarak korumak için insertin altına yeterli miktarda büyüme medyumu ekleyin. 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında 48 saat boyunca inkübe edin.

Yapışmamış hücreleri uzaklaştırmak için insert'i steril DPBS ve %1 pen strep ile üç kez yıkayın. Ardından kuyucuklara taze büyüme medyumu ekleyin. Plakayı doku kültürü inkübatörüne geri yerleştirin ve her 48 saatte bir medyum değişimi yapın.

Burada, hücre kısıtlayıcı PEG, disosiye hücreleri geçirgen desteklerin kolajen kaplı membranına seçici olarak yapıştırmak için bir test deseni kullanılarak ince bir film şeklinde polimerize edilmiştir. Hücreler 48 saatlik inkübasyonun ardından işaretlenmiştir. Calcein-AM ile işaretlenen canlı hücreler yeşil görünürken, ethidium homodimer-1 ile işaretlenen ölü hücreler kırmızı görünür.

İnce PEG filminin bulunduğu alanda minimal hücre yapışmasının gerçekleştiği görülebilir. Bu, istenmeyen bir sonuç örneğidir. PEG'nin kısmi polimerizasyonu, kullanılamaz bir PEG yapısının oluşmasına neden olmuştur.

Pre-polimer ortamındaki menisküs varlığı, yetersiz polimerizasyon miktarı, yetersiz UV maruziyeti veya optiklerin hatalı odağı nedeniyle hatalı polimerizasyon meydana gelebilir. Bu, A-D-R-G-X bitki kültürünün zayıf bir çift hidrojel 3B enkapsülasyonuna örnektir. Bu görüntüde, yeşil renkte görünen nöritlerin desenli peg kanallarının dışına doğru büyüyebildiği görülmektedir.

Bu durum genellikle enjeksiyon sırasında saf matrisin PEG kısmının üzerine taşmasıyla meydana gelir. Bu prosedürü takip ederek, elektrofizyoloji veya fenotipik ekspresyon gibi ek soruları yanıtlamak için patch clamping veya immünohistokimya gibi diğer standart yöntemler uygulanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, nöronal hücre kültürleri çalışmalarında tekli veya çiftli hidrojel sistemlerin geometrik sunumunu belirlemek için dinamik maske projeksiyon fotolitografisinin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.