Name: Dinamik Maske Projeksiyon Fotolitografi kullanarak Sinir Kültür Sistemleri Micropatterned Hidrojeller Fabrikasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-11T23:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 6 s
Description: Öğrenin, dinamik maske projeksiyon fotolitografi kullanarak mikrodesenli çift hidrojel sinir kültür sistemleri nasıl üretilir. DMD ile hızlı desenleme yaparak nöron canlılığı ve nörit çıkışını inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, Prof. Anthony Windebank laboratuar diseksiyon ve kültür DRG kendi uzmanlık paylaşımı için teşekkür etmek, hem de DMD kurulumu ile ilgili yararlı tartışmalar için Prof. Shaochen Chen. Bu araştırma, Tulane Üniversitesi ve hibeler Louisiana Regents Kurulu&#39;ndan tarafından kısmen finanse edildi (LEQSF [2009-10]-RD-A-18) ve NIH (NS065374).

1. DMD Kurulum <ol><li> DMD kurulu, UV ışık kılavuzu (kolimatör) ve 4x objektif lens titreşim izolasyonu masaya dikey olarak monte edilir. </li><li> UV ışık kılavuzu ışık 45 ° aynalar, 24 ° aynalar düzleminin altında (Şekil 1) düzlemine göre açıyla ayna dizisi vurur şekilde ayarlanmış olmalıdır. </li><li> DMD uzaklık objektif lens odak uzaklığı lens ile ilgili karşılık gelir, böylece objektif lens monte edilir. </li><li> Objektif lens, mikroskop aracılığıyla odaklanmış ışık DMD yansıyan görülebilmesi gibi ters bir mikroskop altında yerleştirilir. Polimerizasyon yüzey objektif lens arasındaki mesafe yaklaşık olarak objektif çalışma mesafesi uygun olmalıdır. Mikroskop aşamasında sonra ince Görüntüye odaklanmak için bu mesafeyi ayarlamak için kullanılabilir. Bu mesafe, seçilen polimerizasyon yüzeye bağlı olarak değişebilir. </li></ol> 2. Doku Eksplant Kültürler Çift Hidrojel oluşturur A. DRG eksplant yapışma <ol><li> Kat membran kendisi özen Yağmur-X ile 6-kuyu kollajen kaplı hücre kültürü ekler (Corning), duvarları. (Alternatif olarak, hidrofobik bir bariyer kalem olabilir.) </li><li> 37 ° C ve% 5 CO 2 'de bir kuluçka yapışma orta 1.5 mL gecede Hidrat ekler. Yapışma orta,% 10 fetal sığır serumu,% 1 Penisilin / streptomisin, 0.5mm L-glutamin ve 20 mcg / ml NGF neurobasal orta. </li><li> E-15 sıçan yavrular hasat embriyonik dorsal kök gangliyon (DRG). DRG dörde kadar eklemek için, kollajen kaplı 6-iyi ekler üzerine kaplanmış olmalıdır. </li><li> Membran bağlılık DRG izin vermek için, 2 saat süreyle ekler inkübe edin. </li></ol> B. Dinamik maske fotopolimerizasyon Dijital micromirror cihazı (DMD), seçici ayna pozisyonu dayalı ışığı yansıtan projeksiyon televizyonlarda buna benzer bireysel aynalar, 1024 x 768 dizi. Bizim amaçlarımız için, DMD Belirtilebilen hidrojel geometrileri basit ve hızlı bir şekilde oluşturarak, photocrosslinkable hidrojeller üzerine desen ultraviyole (UV) ışık kullanılır. Şekil 1 DMD ve UV ışık yolu kurulumu anlatıyor. DMD bağımsız bir birim olmasına rağmen, cihaz aynı zamanda birçok mevcut mikroskopları ile kullanım için entegre edilebilir. <ol><li> Tüm aşırı sıvı eklemek çıkarın ve polimerizasyon orta eklemek içinde 500 mcL ekleyin. Polimerizasyon orta,% 10 PEG (MW 1000) ve 0.5% Irgacure 2959 20 mcg / ml NGF ve% 1 Kalem / Strep ile desteklenmiş neurobasal ortamda çözünmüş içerir. </li><li> Yağmur-X işlenmiş cam slayt DMD cihaz altındaki ekleme yerleştirin. </li><li> ALP-3 temel GUI programı kullanmak suretiyle, DMD "photomask" olarak kullanılmak üzere uygun siyah-beyaz görüntü yükleyin. Bizim amaçlarımız için, çatallanan şekli neurite rehberlik sistemlerinin uygulanması için izin seçildi. </li><li> Ters bir görünüm için mikroskop kullanarak, photomask DMD yansıtan bir görünür ışık kaynağı kullanılarak uygun bir konuma sahip doku eksplantlar hizalayın. </li><li> UV ışık kaynağı görünür ışık kaynağı Switch ve crosslinking yeterli kadar PEG çözüm aydınlatmak. (Koşulları için verilen ve 5.0 Watt / cm 2 olayın DMD, crosslinking az 55 saniye içinde tamamlanabilir.) Eklemek dört DRG için tekrarlayın. </li><li> Her ekleme, steril DPBS ve% 1 Kalem-Strep ile üç kez yıkayın. </li><li> 1.5mL besi hücre kültürü ekler altına ekleyin ve 30 dakika için bir kuluçka gelmesini sağlayınız. Büyüme orta,% 2 B-27,% 1 Kalem / Strep, 0.5mm L-glutamin ve 20 mikrogram / ml NGF içeren neurobasal orta. </li></ol> C. Sekonder hidrojel Puramatrix <ol><li> Nöronal uygulamaları için,% 1 Puramatrix steril H 2 O% 0.15 üreticinin talimatlarına göre seyreltilir ve 1 mcg / mL çözünen laminin ile desteklenebilir. </li><li> Tüm fazla medya, steril bir pamuk uçlu aplikatör, Kimwipe ya da mikropipet kullanarak, DRG eksplantlar içeren PEG boşlukları, kaldırılması gerekir. </li><li> Puramatrix mikropipet ile PEG boşlukları dışına taşırmadan boş alanı doldurmak amacıyla eklenir. Boşluk hacmi bağlı olarak genellikle 1 mcL inşa başına kullanılan ~. </li><li> Puramatrix fizyolojik tuz çözeltisi ile temas halinde hemen kendini montaj işlemi başlar, yani şişmiş PEG, ancak 1.5 mL besi toplam jelleşme sağlamak için ekleme altına eklenir ve bir saat süreyle inkübatör yerleştirilir. </li><li> Başlangıçta, Puramatrix hafif asidik pH denge izin bir saat sonra ortamı değiştirmek. </li><li> Medya değişiklikler yaklaşık olarak her 48 saat gereklidir. Tüm medya olduğunu, dikkatli olunmekanik olarak zayıf Puramatrix bütünlüğünü korumak için, ekleme altına eklendi. </li></ol> Agaroz <ol><li> Nöronal uygulamalar için, agaroz% 1'lik bir büyüme ortamında çözüm seyreltilmiş ve agaroz tamamen eriyene kadar (~ 1 saat) 60 ° C su banyosuna yerleştirilir. Çözüm, sonra 1 mcg / mL çözünen laminin ile tamamlanmaktadır. </li><li> Tüm aşırı medya PEG boşlukları uzaklaştırılmalıdır. </li><li> Agaroz PEG boşlukları dışına taşırmadan boş alanı doldurmak için eklenir. Boşluğun hacmi bağlı olarak genellikle 1 mcL inşa başına kullanılan ~. </li><li> Büyüme ortamının 1.5 mL 6 plaka önceden soğutulmuş (8 ° C), ve agaroz içeren ekler agaroz izin soğutulmuş ortama aktarılır ve 8 ° C'de en az üç dakika boyunca buzdolabında muhafaza edilir jel. </li><li> Son olarak, ekler, 1.5 ml (37 ° C), önceden ısıtılmış büyüme orta transfer ve 37 kuvöz muhafaza ° C, her 48 saatte gerekli ortam değişiklikleri ile. </li></ol> 3. Çift Hidrojel 3D Hücre Kapsüllemesi Çift hidrojel encapsulation kendi montaj jel kullanırken uygundur. Photocrosslinkable jel, bu durumda PEG, örneğin Puramatrix veya agaroz, öz-montaj jel geometrik tanıtımı için yapısal bir destek olarak hizmet vermektedir. Bu yöntemlerden bazıları, özellikle photomask jel ve seçim türü, özellikle istediğiniz uygulamayı bağlı olacaktır. <ol><li> DMD uygun bir maske yükleyin. Bizim uygulama, hücre hayatta kalmak için, biz sadece hücre görüntüleme yardım Puramatrix silindirik bir sunum seçti. Araştırmacılar, hücre sinyal eğitim kemotaktik moleküllerin difüzyon izin bölmeli bir geometri ilginizi çekebilir. Ayrıca, bir arter kaba bir yaklaşım, kan damarı araştırma olası uygulama temsil etmek için gösterilmiştir. </li><li> Yağmur X kaplı slayt DMD altında polyester hücre kültürü Yağmur X ile insert, yer ve duvarları davranın. </li><li> Eklemek için polimerizasyon orta 500 mcL ekleyin. 55 saniye süreyle UV ışınlarına maruz PEG crosslinking uyarır. </li><li> Steril DPBS ve% 1 Kalem-Strep ile üç kez yıkayın. </li><li> PEG boşlukları tüm Fazla medyayı çıkartın. </li><li> Pelet içine istenilen yoğunlukta hücre aşağı spin. Bakım Puramatrix bir tuz çözeltisi ile temas halinde hemen kendini montaj başlar başlamaz, önce karıştırma hücre pelletini tüm orta kaldırmak için alınması gerekir. Askıya Alma steril H 2 O seyreltilmiş% 0,15 Puramatrix içinde hücrelerin% 10 sakaroz ile desteklenmelidir. </li><li> PEG içinde boşluklar içinde Puramatrix / hücre / sakaroz karışımı enjekte edilir. </li><li> 1.5 mL eklemek altında büyümenin orta ekleyin ve bir saat için kuvöz içinde jel izin. </li><li> Bir saat sonra ortam değiştirin, ve bundan sonra her 48 saatte ~. </li></ol> 4. Tek Hidrojel 3D Hücre Kapsüllemesi Tek bir hidrojel kapsülleme hücreleri photocrosslinkable hidrojel içinde incelenebilir bir durum için uygun olacaktır. <ol><li> DMD uygun bir maske yükleyin. Hücre sağkalım çalışmalar için, yine bir silindir temsil edecek bir temel dairesel maske seçti. Metodu 4 gösterilen benzer Maskeler tekrar uygun bir araştırma alanı için uygulanabilir. </li><li> Yağmur X kaplı slayt DMD altında polyester hücre kültürü Yağmur X ile insert, yer ve davranın. </li><li> Herhangi istenilen konsantrasyonda hücreler homojen dağılımını sağlamak için iyice karıştırılması,% 10 PEG solüsyonu direkt olarak ilave edilebilir. </li><li> Eklemek için polimerizasyon orta 500 mcL ekleyin. 55 saniye süreyle UV ışınlarına maruz PEG crosslinking uyarır. </li><li> Steril DPBS ve% 1 Kalem-Strep ile üç kez yıkayın. </li><li> Değişen her ~ 2 gün, altına ve üstüne ekleme bir büyüme ortamı ile doldurun. </li></ol> 5. İnce Film Hidrojel Polimerizasyon <ol><li> DMD uygun bir maske yükleyin. </li><li> Yağmur X kaplı slayt kollajen kaplı polyester hücre kültürü Yağmur-X ile insert, yer ve davranın. </li><li> Insert (6 plaka ekler ~ 250-300 mcL) sadece alt kapağı için yeterli polimerizasyon orta ekleyin. Medya, oda sıcaklığında 30-45 dakika ekleme membran girmesine izin verin. </li><li> Mikropipet veya Kimwipe insert fazla polimerizasyon orta çıkarın. Eklemek tamamen alt kapağı için yeterli miktarda UV-şeffaf yağ ekleyin. Eklemek polimerizasyon orta doyurarak ekleme membran üzerinde ayrı bir tabaka oluşturur petrol için, yeterince uzun süre oda sıcaklığında 15-30 dakika oturmak için izin verin. </li><li> DMD altında ekleme ve slayt yerleştirin. UV ışınlarına maruz kalma PEG crosslinking neden. Çünkü PEG tabakasının inceliği, crosslinking DMD 5.0 Watt / cm 2 olayın en az 15 saniye içinde tamamlanmalıdır. </li><li steril dpbs ve kalem-strep eklemek kez y bir kal sebat endi ise tween gibi hafif deterjan tamponu eklenebilir.><li> 6-iyi doku kültürü plakası ekleme saklayın. Istenilen konsantrasyonda askıda hücrelere büyüme orta ekle ve istenilen hücre yoğunluğu, hücre kültürü eklemek içinde hücre süspansiyonu elde etmek için yeterli bir hacmi pipetle. Sonra, tamamen hücre canlılığını korumak için (~ 1.5 mL) eklemek için aşağıdaki yeterli büyüme ortamı ekleyin. </li><li> 48 saat geçtikten sonra herhangi bir unadhered hücreleri çıkarmak için, steril DPBS ve% 1 Kalem-Strep eklemek üç kez yıkayın. Yaklaşık olarak her 48 saatte bir ortam değiştirin. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Çift hidrojel örnekleri içeren DRG eksplantlar Şekil 2'de gösterilmiştir oluşturur. Hücresel göç ve neurite uzantısı hücre müsamahakar çift hidrojel bölgeye inşa sınırlı olduğunu dikkat edin. Şekil 3 çift hidrojel yapıları içinde benzer bir kapsüllü ayrışmış hücreleri gösteriyor. DMD photomask dinamik yapısı nedeniyle, kapsülleme kullanılabilir geometri, optik boyutları ve çözünürlüğü sınırlıdır. Hücre kapsülleme tek bir photopolymerizable hidrojel, PEG içinde de mümkün olduğunu, ölü / canlı canlılığı testi Şekil 4'te kanıtladığı gibi yapıldı. PEG içinde kapsüller PEG sinir hücreleri için ideal bir ortamı temsil etmiyor, sadece bir örnek olarak geliyordu. Bu nedenle, PEG yapıları gerçekleştirilen hücre canlılığı anlaşılır düşük. Son olarak, ince PEG filmler, hücre kültürü ekler, hücre yapışması için desenli sınırlayıcı bir tabaka olarak kullanan örnekler Şekil 5'te gösterilmiştir. Ayrıca, olası bir "kötü" sonuçlarının örnekleri Şekil 6'da sunulmaktadır. Sonuçlar, olası kullanımlarının laboratuvarda geliştirilen yöntemlerden yalnızca küçük bir bölümünü temsil eder. Onlar bizim yaklaşımımız kolaylığı, çok yönlülük ve canlılığı göstermek amacıyla, araştırmacılar kendi olası adaptasyonlar geliştirmek için "prensip kanıtı" olarak tedavi edilebilir. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 fotolitografi için kullanılan ışık yolu şematik gösterimi. Ankastre: 45 ° ve 24 ° ayna dizi uçağın altında bir açıyla DMD UV ışık yanar. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 çift hidrojel yapıları içeren DRG Etiketli büyümesi ve yayılması. AD), Beta III tubulin (yeşil), DAPI boyanan hücre çekirdeğine (mavi) ile etiketlenmiş neurites ile polimerize PEG yapıları (gri) tasvir görüntüler. DRG eksplantlar Puramatrix bulunan ve çatallanma (ler) doğru büyüyen neurites desen dairesel bölgelerinde bulunmaktadır. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 büyüme ortamında 48 saat sonra canlı bir hücre belirteci ile Calcein AM etiketli hücreleri içeren Çift hidrojel oluşturur. AD) Çeşitli PEG şekiller, ayrışmış DRG nöron (~ 5x10 3 hücre / ml) içeren Puramatrix ile dolu. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 Tek hidrojel içeren büyüme ortamında 24 saat sonra (5x10 3 hücre / ml) ethidium homodimer-1 (kırmızı) ile etiketlenmiş Calcein AM (yeşil) ve ölü hücreleri ile etiketlenmiş canlı hücreler inşa. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5 Hücre kısıtlayıcı PEG ayrışmış hücrelerin seçici geçirgen destekleyen kollajen kaplı membran uymak için bir "test deseni" kullanılarak ince bir film olarak polimerize. Ethidium homodimer-1 (kırmızı) ile ölü hücrelerden etiketli ise A, B) Canlı hücreler, Calcein AM (yeşil) ile 48 saat sonra etiketlenir. Minimum hücre adezyon ince PEG filmi içeren alan oluşur. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig6.jpg" alt="Şekil 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 6"> Şekil 6 istenmeyen sonuçlar Temsilcisi görüntüleri. A) PEG Kısmi polimerizasyon, kullanışsız bir PEG yapı. Yanlış polimerizasyon menisküs, ön-polimer orta, yetersiz miktarda polimerizasyon orta, yetersiz UV ışınlarına maruz kalma ya da optik yanlış odak varlığı nedeniyle oluşabilir. B) Beta III tubulin (yeşil), DAPI boyanan hücre çekirdeğine (mavi) ile etiketlenmiş neurites ile polimerize PEG yapıları (gri) tasvir Resim. Neurites desenli PEG kanalların dışında da büyümeyi başardık. Bu durum sık sık oluşur Puramatrix enjeksiyon sırasında PEG kısmının üstüne taşıyor.

<ol><li>Abbott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture%3A+biology%27s+new+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell culture: biology's new dimension.</a> Nature. 424, 870-872 (2003).</li>
<li>Schindler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living+in+three+dimensions%3A+3D+nanostructured+environments+for+cell+culture+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Living in three dimensions: 3D nanostructured environments for cell culture and regenerative medicine.</a> Cell Biochem Biophys. 45, 215-227 (2006).</li>
<li>Maltman, D. J., Przyborski, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+three-dimensional+cell+culture+technology+aimed+at+improving+the+accuracy+of+in+vitro+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Developments in three-dimensional cell culture technology aimed at improving the accuracy of in vitro analyses.</a> Biochemical Society Transactions. 38, 1072-1075 (2010).</li>
<li>Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+isn%27t+flat%3A+taking+cancer+biology+to+the+next+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Life isn't flat: taking cancer biology to the next dimension.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 42, 8-9 (2006).</li>
<li>Irons, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+neural+constructs%3A+a+novel+platform+for+neurophysiological+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional neural constructs: a novel platform for neurophysiological investigation.</a> Journal of Neural Engineering. 5, 333-341 (2008).</li>
<li>Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+in+rotating+bioreactors+promotes+maintenance+of+cardiac+myocyte+electrophysiology+and+molecular+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Cultivation in rotating bioreactors promotes maintenance of cardiac myocyte electrophysiology and molecular properties.</a> Tissue Eng. 9, 1243-1253 (2003).</li>
<li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294, 1708-1712 (2001).</li>
<li>Cushing, M. C., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Materials+science.+Hydrogel+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Materials science. Hydrogel cell cultures.</a> Science. 316, 1133-1134 (2007).</li>
<li>Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodegradable+hydrogels+for+dynamic+tuning+of+physical+and+chemical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Photodegradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties.</a> Science. 324, 59-63 (2009).</li>
<li>Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirci, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics.</a> Nanomedicine (Lond). 5, 469-484 (2010).</li>
<li>Luo, Y., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photolabile+hydrogel+for+guided+three-dimensional+cell+growth+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">A photolabile hydrogel for guided three-dimensional cell growth and migration.</a> Nature Materials. 3, 249-253 (2004).</li>
<li>Wylie, R. G., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+micropatterning+of+amines+within+an+agarose+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Two-photon micropatterning of amines within an agarose hydrogel.</a> Journal of Materials Chemistry. 18, 2716-2721 (2008).</li>
<li>Ji, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+three-dimensional+hyaluronic+acid+nanofibrous+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Electrospun three-dimensional hyaluronic acid nanofibrous scaffolds.</a> Biomaterials. 27, 3782-3792 (2006).</li>
<li>Moeller, H. C., Mian, M. K., Shrivastava, S., Chung, B. G., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microwell+array+system+for+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A microwell array system for stem cell culture.</a> Biomaterials. 29, 752-763 (2008).</li>
<li>Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viability+and+electrophysiology+of+neural+cell+structures+generated+by+the+inkjet+printing+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Viability and electrophysiology of neural cell structures generated by the inkjet printing method.</a> Biomaterials. 27, 3580-3588 (2006).</li>
<li>Liu Tsang, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+3D+hepatic+tissues+by+additive+photopatterning+of+cellular+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Fabrication of 3D hepatic tissues by additive photopatterning of cellular hydrogels.</a> FASEB J. 21, 790-801 (2007).</li>
<li>Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+tectonics%3A+A+comprehensive+construction+platform+for+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microfluidic tectonics: A comprehensive construction platform for microfluidic systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13488-13493 (2000).</li>
<li>Lu, Y., Mapili, G., Suhali, G., Chen, S. C., Roy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+digital+micro-mirror+device-based+system+for+the+microfabrication+of+complex%2C+spatially+patterned+tissue+engineering+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">A digital micro-mirror device-based system for the microfabrication of complex, spatially patterned tissue engineering scaffolds.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 77, 396-405 (2006).</li>
<li>Naiser, T., Mai, T., Michel, W., Ott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+maskless+microscope+projection+photolithography+system+and+its+application+in+light-directed+fabrication+of+DNA+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Versatile maskless microscope projection photolithography system and its application in light-directed fabrication of DNA microarrays.</a> Review of Scientific Instruments. 77, 063711-063711 (2006).</li>
</ol>

Burada açıklanan yöntem basit ve tekrarlanabilir bir hücre kültürü sistemleri isteyen herhangi bir araştırmacı tarafından kullanılan olabilir. Teorik olarak, mevcut photopolymerizable hidrojeller çok çeşitli nedeniyle, çevre tüm doku eksplantlarında da dahil olmak üzere herhangi bir hücre tipi, kullanmak için izin için uygun olabilir. Ayrıca, çift hidrojel sistemi, kendi amorf şekiller oluşturma eğilimindedir kendini polimerize hidrojeller, sunumu gelişmiş mekansal kontrolü için olanak sağlar. Ortaya çıkan &quot;2.5D&quot; micropatterned hidrojel yapıları uygun mikroskopik değerlendirme sağlayan bir 2D yapılandırma sunulan sinir büyüme için 3 boyutlu bir matris sağlar. Substrat jeller polimerize olan, aynı zamanda, deneysel tasarım daha fazla kontrol için izin, çeşitli olabilir. Yöntemleri cam slaytlar (veriler gösterilmemiştir) polimerizasyonu ile karşılaştırıldığında geliştirilmiş canlılığı (Şekil 4) Görüldüğü gibi, hücre kültürü geçirgen destekler ile kullanım için optimize edilmiş. Ancak, diğer polimerizasyon yüzeyler farklı uygulamalar için daha uygun olabilir: cam üzerine imalat örneğin Mikroakiskan deneyleri veya hücre agrega oluşumları, kullanılan slaytlar. Bu kültür sistemleri ile tecrübemiz zorluk potansiyel alanların belirlenmesine yol açmıştır. İlk olarak, dikkatli teknikleri, yapıları kısırlık korumak için gereklidir. DMD kurulum hantal doğası nedeniyle, steril koşullar altında polimerizasyon adımları çalıştırmak için zordur. Bu konuda mücadele etmek için, yöntemleri açıklanan durulama adım yardımcı olur ve tüm medya antibiyotik kullanılmalıdır. Ayrıca, polimerize inşasının son şekli kalınlığı ve ön-polimer karışımı sıvı davranışı son derece bağımlı ve jel oluşturur (Şekil 6) çok ince ya da eksik polimerize bir menisküs varlığı neden olabilir. Iki adım, hücre kültürü ekler içinde bir menisküs oluşumunu en aza indirmek için alınabilir. Kalın hidrojeller (&gt; 200 mm), Yağmur-X eklemek iç duvar etrafında basit bir kaplama yeterli. Ancak, ince yapıları (&lt;200 mikron) kısaca, yukarıda açıklanan, bir yağ tabakası hem menisküs en aza indirmek ve serbest radikal polimerizasyonu oksijen su verme reddetmek için gereklidir. Çözünürlük özelliği boyutu giderek daha kalın jeller ile gerçekleştirilen bir azalma ile, kalınlığına bağlı olarak tespit edildi. Kararda ayrıca özellik hidrojel olumlu ya da olumsuz bir rahatlama temsil edip etmediğini bağlı olarak değişmiştir. Ancak, minimum özellik boyutları ile ~ 100 mm optik odaklama gibi sadece mikroskop hedefleri kullanarak ölçekli yapıları için yeterli bir çözünürlük elde etti. Burada açıklanan çift hidrojel yapıları neurite büyüme ve rehberlik temel in-vitro modellerin oluşumu için mükemmel bir temeli temsil ettiği deneyler göstermiştir. Istihdam micropatterning tekniği, mevcut yöntemleri 18,19 bir adaptasyon, ama bizim set-up, tasarlamak, uygulamak için basit bir vurguladı ve, çift hücre kültürü ekler hidrojel yapıları üretimi için optimize edilmiş hücre kültürü ekler de hücre canlılığı geliştirmek için hayati önem önceden yapışık doku eksplantlar etrafında crosslinking. Sonuçların gösterildiği laboratuar kapsamı ile sınırlı olmakla birlikte, bu yayında açıklanan yöntemleri 3D hücre kültürü imalatı için nispeten ucuz, hızlı ve kullanımı kolay bir yöntem arıyor araştırmacılar için yararlı olacağına inanıyoruz modelleri.

<table><tbody><tr><td>Dijital Mikroayna Cihazı</td><td>Texas Instruments</td><td>DLPD4X00KIT</td><td></td></tr><tr><td>Kolajen Kaplı Transwell Geçirgen Destek</td><td>Corning</td><td>3491</td><td>Makalede Hücre Kültürü İnserti olarak da adlandırılmıştır</td></tr><tr><td>Polyester Transwell Geçirgen Destek</td><td>Corning</td><td>3412</td><td>Makalede Hücre Kültürü İnserti olarak da adlandırılmıştır</td></tr><tr><td>Neurobasal Medyum</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Invitrogen</td><td>16000-036</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>Sinir Büyüme Faktörü</td><td>Invitrogen</td><td>13257-019</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplementi</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Puramatrix</td><td>BD Biosciences</td><td>354250</td><td></td></tr><tr><td>PEG 1000</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>15178</td><td></td></tr><tr><td>Irgacure 2959</td><td>Ciba Specialty Chemicals</td><td>0298913AB</td><td></td></tr><tr><td>Yağ</td><td>Hem kanola yağı hem de silikon yağı kullanılmıştır</td><td></td><td>UV geçirgen olması ve +/- menisküs oluşumunu minimize etmesi gerekir</td></tr><tr><td>OmniCure Series 1000</td><td>EXFO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rain-X</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dinamik maske projeksiyon fotolitografi kullanarak sinir kültür sistemleri micropatterned hidrojeller fabrikasyon

Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

Giderek, desenli hücre kültürü ortamları hücresel özelliklerini incelemek için, ilgili bir teknik haline, ve birçok araştırmacı, 3 boyutlu ortamlar için 1-3 in vivo nitelikleri daha iyi taklit in vitro deneylerde temsil etmek için ihtiyaç inanıyoruz. Kanser araştırma 4, sinir mühendislik 5, kalp fizyolojisi 6, ve hücre-matriks etkileşimini 7,8 gibi alanlarda yapılan çalışmalar, hücre davranış, geleneksel monolayer kültür ve 3D yapıları arasında önemli farklılıklar göstermiştir. Hidrojeller nedeniyle çeşitli, çok yönlülük ve 9-12 işlevsellik ile terzi moleküler kompozisyon yeteneği 3D ortamlar olarak kullanılır. Elektrospinning 13, elastomer pulları 14 da dahil olmak üzere hücre destekleyici matrisler olarak yapıları oluşturulması için çok sayıda teknikleri vardır, mürekkep püskürtmeli baskı 15, katkı photopatterning 16, statik photomask projeksiyon-litografi 17, dinamik ve maske microstereolithography 18. Ne yazık ki, bu yöntemlerin birden fazla üretim adımları ve / veya geleneksel hücre ve doku kültürü yöntemleri kolayca adapte ekipman içerir. Bu protokol istihdam tekniği kullanarak UV başlatılan serbest radikal polimerizasyonu yoluyla uyarılan crosslinking geometrik özel poli (etilen glikol) (PEG) hidrojeller, dinamik photomasks oluşturmak için bir dijital micromirror cihazı (DMD), son iki yöntemden uyarlar. &quot;2.5D&quot; yapıları, sinir büyüme için kısıtlı 3D ortamı sağlar. Biz PEG Puramatrix veya agaroz yapılan bir başka şekilsiz ama hücre izin kendinden montaj jel hücre kısıtlayıcı bir bölgedeki tedarik yapısı olarak hizmet veren bir çift-hidrojel yaklaşımı, istihdam. Bu süreç, konvansiyonel hücre kültürü yöntemleri ve substratları ile kullanmak için son derece tekrarlanabilir ve kolay adapte olan bir hızlı, basit bir adım imalat. Tüm doku embriyonik dorsal kök gangliyon (DRG) eksplantlar, neurite akıbet gibi deneysel testleri için çift hidrojel yapıları içine dahil edilebilir. Ayrıca, ayrışmış hücreleri photocrosslinkable veya kendi kendine polimerize hidrojel kapsüllü olabilir, ya da seçici geçirgen destek zarı, hücre kısıtlayıcı photopatterning kullanarak yapıştırılır. DMD kullanarak, hidrojel, kalın ~ 1mm kadar yapıları, ancak ince bir film tabakası (&lt;200 mikron) PEG yapıları serbest radikal polimerizasyon reaksiyonu oksijen su verme ile sınırlı kalmıştır yarattı. Biz daha sonra ince PEG yapısı polimerizasyon izin polimerizasyon sıvı üzerindeki yağ tabakası kullanan bir teknik geliştirdi. Bu protokol, biz microfabricated sinir hücre ve doku kültürleri üretimi için 3D hidrojel sistemleri süratli yaratılmasını anlatmak. Burada gösterdi çift hidrojel yapıları nörobilim hücre sağkalım, göç, ve / veya neurite büyüme ve rehberlik içeren çalışmalar için faydalı in vitro modeller çok yönlü temsil eder . Ayrıca, protokol hidrojeller ve hücrelerin birçok türleri için çalışmak gibi, potansiyel uygulamalar çeşitli ve geniş, her ikisi de.

Hızlı, düzenli hücre kültürü yüzeylerde dinamik maske projeksiyon litografi için bir dijital micromirror cihaz kullanarak microfabricated sinir kültür sistemleri üretimi için basit teknikleri açıklanmıştır. Bu kültür sistemleri doğal biyolojik mimarisi daha iyi temsil olabilir, ve açıklanan teknikleri çok çeşitli uygulamalar için adapte olabilir.

Dinamik Maske Projeksiyon Fotolitografi kullanarak Sinir Kültür Sistemleri Micropatterned Hidrojeller Fabrikasyon

Desenli hücre kültürü ortamları, hücresel özelliklerin incelenmesinde giderek daha ilgili bir teknik haline gelmektedir ve pek çok araştırmacı ...

Bu prosedürün genel amacı, nöronal çalışmalar için mikro desenli, çift hidrojel bir hücre kültürü sistemi oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle embriyonik dorsal kök ganglionları gibi doku implantlarının geçirgen hücre kültürü insertlerine ekilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, dinamik bir foto maske olarak dijital mikro ayna cihazı veya DMD kullanılarak, foto çapraz bağlanabilir bir hidrojel içerisinde mikro bir desen oluşturulur.Bunu, ayrıştırılmış hücrelerin bir süspansiyonunu içerebilen, saf haldeki kendi kendine düzenlenen hidrojelin eklenmesi takip eder. Hücresel analizden önce uygun inkübasyon süresi gereklidir. Nihayetinde, DMD tarafından tanımlanan belirli geometrik konfigürasyonlar aracılığıyla nöronal hücre canlılığını ve nörit uzamasını gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, geçirgen hücre kültürü insertleri gibi hemen hemen her türlü substrata uyum sağlayacak şekilde, dinamik bir foto kütlenin hızla oluşturulabilmesi, değiştirilebilmesi ve uzaktan yansıtılabilmesidir. Bu yöntem nöral sistemler hakkında bilgi sağlayabilmenin yanı sıra; hücre sinyalleşmesi, hücre migrasyonu, hücreden hücreye temas veya morfogenez gibi belirtilebilir geometrik kısıtlamalardan fayda sağlayabilecek diğer sistemlere de uygulanabilir. DMD kartı, UV ışıkları, kılavuz ve 4x objektif lensin tamamı bir titreşim izolasyon masası üzerine dikey olarak monte edilmiştir.DMD'den yansıyan odak ışığı mikroskop aracılığıyla görselleştirilebilecek şekilde, ters bir mikroskop objektif lensinin altına yerleştirilir. DMD kurulumuna ilişkin ek ayrıntılar için lütfen beraberindeki yazılı protokole bakınız. İlk olarak, X explan kültürlerini almak üzere altı kuyucuklu kolajen kaplı hücre kültürü insertlerini hazırlayın; hücre kültürü insertlerinin duvarlarını, Rain X'i membranın kendisine uygulamamaya dikkat ederek Rain X ile kaplayın.Ardından insertlere 1,5 milliliters aian medyum ekleyin ve 37 °C ve %5 karbon dioksit ortamında gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, E 15 sıçan yavrularından embriyonik dorsal kök ganglionlarını topladıktan sonra, kolajen kaplı her bir altı kuyucuklu inserte dört adede kadar DRG ekleyin ve DRG'lerin membrana yapışmasını sağlamak için 37 °C ve %5 karbon dioksit ortamında iki saat boyunca inkübe edin.İnkübasyon süresinin ardından DRG'ler fotopolimerizasyon için hazır olacaktır. Dijital mikro ayna aygıtı (DMD), aynanın konumuna göre ışığı seçici olarak yansıtan 1024'e 768 boyutlarında tekil aynalardan oluşan bir dizidir. Bu prosedürde DMD, bağlanabilir hidrojeller olan foto CRO'lar üzerine ultraviyole ışığı desenlemek için kullanılır ve böylece belirlenebilir hidrojel geometrileri basit ve hızlı bir şekilde oluşturulur.DMD'miz bağımsız bir ünite olsa da, cihaz mevcut birçok mikroskopla entegre edilerek de kullanılabilir. Öncelikle, DRGX bitkilerini inkübatörden çıkarın ve insert içindeki tüm fazla sıvıyı aspire edin. Ardından, insert'in içine 500 microliters polimerizasyon medyumu ekleyin.DRGX bitkilerini içeren insertleri rain extre cam lamı üzerine aktarın ve lamı DMD'nin altına yerleştirin. Fotoğraf maskesi olarak kullanılacak siyah beyaz görüntüyü DMD'ye yüklemek için ALP three temel grafik kullanıcı arayüzü programını kullanın. Bu durumda, ters mikroskop ve DI görünür ışık kaynağı kullanılarak nörit kılavuzlama sistemlerinin uygulanabilmesi için çatallı bir şekil seçilmiştir.DMD'den yansıyan ışığı kılavuz olarak kullanarak, doku kesitini foto maske üzerindeki uygun konuma hizalayın. Ardından, görünür ışık kaynağını bir UV ışık kaynağı ile değiştirin. Hücre kültürünün içindeki polimerizasyon ortamını aydınlatın.PEG çapraz bağlanması tamamlanana kadar bekletin. Eklemdeki her bir DRG için işlemi tekrarlayın. Ardından, her bir eklemi %1 penisilin streptomisin içeren steril dcos fosfat tamponlu salin ile üç kez yıkayın.Son olarak, hücre kültürü insertlerinin altına 1,5 milliliters büyüme medyumu ekleyin ve 37 degrees Celsius sıcaklık ile %5carbon dioxide içeren bir doku kültürü inkübatöründe 30 dakika boyunca dengelenmeye bırakın. İnkübasyon süresi boyunca, saf matrisi 30 dakika boyunca sonike edin. Peptidleri çözmek için, temin edilen %1solution steril su ile %0,15 seviyesine seyreltin ve mililitre başına bir microgram çözünür laminin ile takviye edin.30 dakika sonra kültürleri inkübatörden çıkarın ve insertteki tüm fazla medyumu aspire edin. Ardından, mikroskop altında boşluğu gözlemlerken, DRGX eksplan içeren PEG yapısındaki boşaltılmış alanın içindeki medyumu aspire edin ve X eksplanın etrafındaki boşluğa yaklaşık 1 µL saf matris çözeltisi pipetleyin. Saf matrisin peg boşluğundan taşmadığından emin olun.Ardından, insertin altına 1.5 milliliters büyüme besiyeri pipetleyin ve kültürleri 37 °C ve %5 carbon dioxide koşullarında doku kültürü inkübatörüne bir saatliğine yerleştirin. Bu sürenin sonunda tam tutunmayı sağlamak için büyüme besiyerini yenileyin ve ardından kültürleri inkübatöre geri koyun. Büyüme besiyeri, her 48 saatlik kültür süresinden sonra yenilenir.DRGX bitkileri içeren çift hidrojel yapı örnekleri burada gösterilmiştir. DRGX bitkileri, büyüme ve proliferasyon belirteçleri için işaretlenmiştir. Polimerize PEG yapı gri renkte görünmekte, beta three tubulin ile işaretlenmiş DRG NEURITLERİ yeşil renkte görünmekte ve DPI boyası hücre çekirdeklerini mavi renkte boyamaktadır.Hücresel migrasyonun ve retikül uzanımının, çift hidrojel yapısının hücreye izin veren bölgesiyle sınırlı olduğu görülmektedir. Çift hidrojel enkapsülasyonu, herhangi bir kendi kendine organize olan jel ve fotokroslinklenebilir jel kullanıldığında uygundur. Bu durumda PEG, kendi kendine organize olan jelin geometrik sunumu için yapısal bir destek görevi görür.Örneğin, saf matris veya aris. Jel tipi ve foto maske seçimi, hedeflenen özel uygulamaya bağlı olacaktır. Polyester hücre kültürü insertinin duvarlarını, daha önce gösterildiği gibi Rain X ile işlemden geçirin.İnserti Rain X kaplı bir lam üzerine aktarın ve DMD altına yerleştirin. Ardından, inserte 500 µL polimerizasyon medyumu ekleyin. Bu sağkalım deneyi için DMD üzerine uygun maskeyi yükleyin.Hücrelerin görüntülenmesine yardımcı olmak için saf matristen oluşan silindirik bir sunum kullanılır. Çapraz bağlama işleminden sonra, peg çapraz bağlanmasını indüklemek için inserti 55 saniye boyunca UV ışığına maruz bırakın. Yeni oluşan boşluğu steril DPBS ve %1 pen strep ile yıkayın.Boşluktaki tüm fazla sıvıyı uzaklaştırmak için bir mikro pipet veya steril pamuklu aplikatör kullanın. Saf Matrixx'i 30 dakika boyunca sonikasyona tabi tutarak hazırlayın; ardından steril su ile %0,15 konsantrasyona seyreltin ve mililitre başına bir mikrogram çözünür laminin ile %10 sükroz ekleyin. Ardından, kültüre edilecek hücreleri santrifüjle çöktürün.Besiyerini hücre peletinden tamamen aspire edin ve peleti %0,15'lik pure matrix çözeltisi içerisinde mililitre başına yaklaşık beş x 10³ hücre konsantrasyonunda yeniden süspande edin. Pure matrix, tuz çözeltisi ile temas ettiğinde kendi kendine montajlanmaya başladığı için tüm besiyerinin hücre peletinden aspire edilmesi kritik öneme sahiptir. Ardından, takviye edilmiş pure matrix hücre karışımından yaklaşık 1 µL'yi peg boşluğuna pipetleyin.Bu hacim, genellikle pipet 1.5 mililitre büyüme ortamını insertin altına eklemeden boş alanı doldurmak için yeterlidir. Ardından, tam jelleşmeyi sağlamak için saf matriks ikincil hidrojeli 37 °C ve %5 karbondioksit içeren doku kültürü inkübatörüne bir saatliğine yerleştirin. Bu sürenin sonunda, mekanik olarak zayıf olan saf matrise zarar vermemeye dikkat ederek ortamı aspire edin ve insertin altına taze ortam ekleyin.Kültürleri doku kültürü inkübatörüne geri yerleştirin ve her 48 saatlik kültür süresinin ardından medyayı değiştirin. Burada, çeşitli çiftli hidrojel konstrüktler içerisine enkapsüle edilmiş canlı DRG nöronlarına örnekler yer almaktadır. Büyüme medyumunda 48 saat bekletildikten sonra hücreler, yeşil renkte görünen bir canlı hücre markörü olan kalsiyum am ile işaretlenmiştir.Burada, DMD foto maskesinin dinamik doğası nedeniyle, enkapsülasyon için mevcut olan geometri yalnızca optiklerin boyutları ve çözünürlüğü ile sınırlıdır. Hücrelerin, polyester hücre kültürüne uygun şekilde foto çapraz bağlanabilir bir hidrojelin içinde incelenebildiği durumlarda tek bir hidrojel enkapsülasyonu uygundur. Rain X ile yerleştirin ve Rain X kaplı bir lam üzerine, DMD'nin altına yerleştirin.Daha önce olduğu gibi, kültürlenecek hücreleri istenen konsantrasyonda doğrudan polimerizasyon ortamına pipetleyin ve homojen dağılım sağlamak için iyice karıştırın. Ardından, polimerizasyon ortamı hücre karışımından 500 µL'yi insert içerisine pipetleyin. Uygun maskeyi seçip DMD üzerine yükleyin ve UV ışığına 55 saniye boyunca maruz bırakarak PEG çapraz bağlanmasını başlatın.Hücre sağkalım çalışmaları için, bir silindiri temsil etmek amacıyla temel bir dairesel maske kullanılır; inserti steril DPBS ve %1 pen strep ile üç kez yıkayın, ardından insertin altına 1,5 milliliters büyüme besiyeri ve üstüne inserti tamamen daldıracak kadar büyüme besiyeri ekleyin; 37 degrees Celsius ve %5 carbon dioxide koşullarında, her 48 saatte bir besiyeri değişimleri yaparak inkübe edin. Burada, peg içine kapsüllenmiş canlı disosiye kortikal nöronların bir örneği yer almaktadır. Canlı hücreler kalsiyum am ile işaretlenmiş olup yeşil görünürken, ölü hücreler ahy homodimer one ile işaretlenmiş olup kırmızı görünmektedir.PEG ile enkapsülasyon sadece bir örnek olarak verilmiştir; zira PEG, nöral hücreler için ideal bir ortamı temsil etmez. Seçilen geometri, hücre canlılığını incelemek için basit bir yöntem sunar ancak geniş bir yapı yelpazesine uyarlanabilir. Sınırlı hücrenin spesifik paternlerini oluşturmak için ince film hidrojeller kullanılabilir.Tekrar, polyester hücre kültürü insertini daha önce olduğu gibi rain X ile işleyin ve rain X işleminden geçmiş bir lam üzerine yerleştirin. Ardından, işlem görmüş hücre kültürü insertinin tabanına 250 ila 300 µL polimerizasyon medyumu pipetleyin. Bu hacim, insertin tabanını yeni ucu ucuna kaplamak için yeterlidir; medyumun insert membranına nüfuz etmesini sağlamak için oda sıcaklığında 30 ila 45 dakika inkübe edin ve ardından insertteki fazla medyumu bir mikro pipet ile aspire edin.Ardından, alanı tamamen kaplayacak şekilde insertin tabanına yeterli miktarda UV şeffaf yağ pipetleyin. Inserti, yağın polimerizasyon ortamının üzerinde belirgin bir tabaka oluşturması için yeterli olan 15 ila 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Insert membranını doyurduktan sonra DMD üzerine uygun bir maske yükleyin.Insert ve lamı DMD altına yerleştirdikten sonra UV ışığına maruz bırakarak PEG çapraz bağlanmasını indükleyin. Inserti üç kez steril DPBS ve %1 pen strap ile yıkayın; yıkama işleminden sonra inserti altı kuyucuklu bir doku kültürü plakasına aktarın, kültüre edilecek hücreleri toplayın ve peletleyin. Besiyerini aspire edin ve hücre peletini, mililitre başına 10⁴ ile 10⁶ hücre arasındaki istenen konsantrasyonda büyüme besiyeri içerisinde yeniden süspande edin.Ardından, istenen hücre yoğunluğunu elde etmek için hücre kültür insertinin içine yeterli hacimde hücre süspansiyonu pipetleyin. Hücre canlılığını tam olarak korumak için insertin altına yeterli miktarda büyüme medyumu ekleyin. 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında 48 saat boyunca inkübe edin.Yapışmamış hücreleri uzaklaştırmak için insert'i steril DPBS ve %1 pen strep ile üç kez yıkayın. Ardından kuyucuklara taze büyüme medyumu ekleyin. Plakayı doku kültürü inkübatörüne geri yerleştirin ve her 48 saatte bir medyum değişimi yapın.Burada, hücre kısıtlayıcı PEG, disosiye hücreleri geçirgen desteklerin kolajen kaplı membranına seçici olarak yapıştırmak için bir test deseni kullanılarak ince bir film şeklinde polimerize edilmiştir. Hücreler 48 saatlik inkübasyonun ardından işaretlenmiştir. Calcein-AM ile işaretlenen canlı hücreler yeşil görünürken, ethidium homodimer-1 ile işaretlenen ölü hücreler kırmızı görünür.İnce PEG filminin bulunduğu alanda minimal hücre yapışmasının gerçekleştiği görülebilir. Bu, istenmeyen bir sonuç örneğidir. PEG'nin kısmi polimerizasyonu, kullanılamaz bir PEG yapısının oluşmasına neden olmuştur.Pre-polimer ortamındaki menisküs varlığı, yetersiz polimerizasyon miktarı, yetersiz UV maruziyeti veya optiklerin hatalı odağı nedeniyle hatalı polimerizasyon meydana gelebilir. Bu, A-D-R-G-X bitki kültürünün zayıf bir çift hidrojel 3B enkapsülasyonuna örnektir. Bu görüntüde, yeşil renkte görünen nöritlerin desenli peg kanallarının dışına doğru büyüyebildiği görülmektedir.Bu durum genellikle enjeksiyon sırasında saf matrisin PEG kısmının üzerine taşmasıyla meydana gelir. Bu prosedürü takip ederek, elektrofizyoloji veya fenotipik ekspresyon gibi ek soruları yanıtlamak için patch clamping veya immünohistokimya gibi diğer standart yöntemler uygulanabilir.Bu videoyu izledikten sonra, nöronal hücre kültürleri çalışmalarında tekli veya çiftli hidrojel sistemlerin geometrik sunumunu belirlemek için dinamik maske projeksiyon fotolitografisinin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

fabrication-micropatterned-hydrogels-for-neural-culture-systems-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Tek bir nöron mikroakışkan arraying ve biyomalzeme kaplamaların içinde-çip plazma desenlendirme için su maskeleme için protokoller anlatılmıştır. Yüksek birbirine eş hücre kültürleri en az girişler kullanılarak hazırlanabilir.

Tek Hücre Hassas Nevronik Co-kültürler hazırlanması

Mikro desenli hidrojel levhaların üretimini, bağımsız bir biçimde monte edilebilen ve manipüle edilebilen basit bir işlem kullanarak açıklıyoruz. Bu modüler hidrojel tabakalar kullanılarak, kontrollü bir hücresel mikro çevre ile basit bir makro ölçekli 3D hücre kültürü sistemi oluşturulabilir.

Micropatterned Makro ölçekli 3D Hücresel Mimarlık Modüler Hidrojel Levhaların İnşaatı

Burada, yüksek verimli tek hücre izolasyonu ve uzun süreli klonal kültüre izin vermek için yeni bir mikro kuyu tasarım konseptini kullanan mikroakışkan bir platformla tek hücreleri izole etmek ve kültürlemek için bir protokol sunuyoruz.

Yüksek verim Tek hücreli İzolasyonu ve Kültür mikroakışkan Platformu

Üç boyutlu hücre kültürü uygulamaları için sentetik hidrojel matrislerinin ışık aracılı oluşumu ve ardından biyokimyasal modellemesi için sıralı bir süreci tanımlıyoruz. Hidrojellerin sitouyumlu fototıklama kimyası ile yapımı ve modifikasyonu gösterilmiştir. Ek olarak, bu hidrojeller içindeki kalıpları ölçmek ve gözlemlemek ve hücre canlılığını belirlemek için basit teknikler sunulmaktadır.

Hücre Kültürü Uygulamaları için Hidrojeller Işık aracılı Oluşumu ve Desenlendirme

İletişim kuralları hydrazone toplu ölçek, microscale ve Nano, ikincisi jel nano tanecikleri ve nanofibers hazırlanması için polimer reaksiyonlar, cross-linking göre parçalanabilir thermoresponsive hydrogels imalatı için açıklanmıştır.

Parçalanabilir Thermoresponsive Hydrogels birden fazla uzunluğu ölçeklerde yolu ile reaktif ekstrüzyon, havacilik, kendinden montajlı imalatı ve Electrospinning

Bu rapor, biyolojik araştırmalar için mikroakışkan kanalları hücreler ve substratlarla doldurmak için düşük basınçlı vakum kullanan basit, uygulaması kolay bir tekniği açıklamaktadır.

Desenlendirme Proteinlerin ve Hücreleri Çok Yönlü Yöntemi

Bu protokol, sınırlı biyomühendislik geçmişi olanlar için basit ve erişilebilir bir litografi içermeyen mikrodesenleme yöntemini tanıtır. Bu yöntem, hücre morfolojilerini modüle etmek için ilgi çekici bir şekilde hücre dışı matris proteinleri mikrodesen için özelleştirilmiş lazer kesim şablonlar kullanır. Mikro desenleme prosedürü indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler kullanılarak gösterilmiştir.

Lazer Kesim Şablonlar Kullanılarak Basit Litografisiz Tek Hücreli Mikrodesenleme

Burada sunulan protokol, memeli hücrelerindeki sitoskeletal yapıları incelemek için hücre şeklini standartlaştıran mikropatternlerin otomatik olarak üretilmesini sağlar. Bu kullanıcı dostu teknik, piyasada bulunan görüntüleme sistemleri ile kurulabilir ve standart hücre biyolojisi laboratuvarlarına erişilemeyen özel ekipman gerektirmez.

Kızılötesi Lazer Destekli Mikropatterning ile Hücre Geometrisinin Kontrolü

Yumuşak hidrojeller üzerindeki hücre dışı matris proteinlerinin nokta dizilerinin tek bir çıkarma modelleme adımıyla mikrotemaslı baskıya dayanan hücresel çekiş kuvvetlerini ölçmek için standart bir yöntemdeki iyileştirmeleri açıklıyoruz. Bu yöntem, hücre kümesi şeklini kontrol etmek için gerekli olan ada desenlerinin daha basit ve daha tutarlı bir şekilde üretilmesini sağlar.

Mikrodesen Traksiyon Mikroskobu için Desen Oluşturma

Geleneksel olarak, hücre kültürü, hücrelerin doğal ortamını in vivo olarak zayıf bir şekilde taklit eden düzlemsel substratlar üzerinde gerçekleştirilir. Burada, fizyolojik olarak ilgili kavisli geometrilere ve mikro desenli hücre dışı proteinlere sahip hücre kültürü substratları üretmek için bir yöntem tanımladık ve bu hücre dışı ipuçlarının hücresel olarak algılanmasına sistematik araştırmalara izin veriyoruz.

Üç Boyutlu Hücre Kültürü Substratlarının UV-Fotodesenlenmesi ile Multicue Hücresel Mikro Ortamların Oluşturulması

Mikrometre ölçeğinde 3D baskı, nöronal hücre kültürleri için polimerik cihazların hızlı prototiplenmesini sağlar. Bir prensip kanıtı olarak, nöronlar arasındaki yapısal bağlantılar, nörit büyümesini etkileyen bariyerler ve kanallar oluşturularak kısıtlanırken, bu tür manipülasyonun işlevsel sonuçları hücre dışı elektrofizyoloji tarafından gözlemlendi.

Mikro Ölçekli Nöronal Hücre Kültürü Cihazlarının İki Foton Polimerizasyonu 3D Baskısı

Öğrenin, dinamik maske projeksiyon fotolitografi kullanarak mikrodesenli çift hidrojel sinir kültür sistemleri nasıl üretilir. DMD ile hızlı desenleme yaparak nöron canlılığı ve nörit çıkışını inceleyin.

Dinamik Maske Projeksiyon Fotolitografi kullanarak Sinir Kültür Sistemleri Micropatterned Hidrojeller Fabrikasyon

Daha fazla video keşfet