Name: Batı Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels kullanarak Blot (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 45 s
Description: Öğrenin, Invitrogen NuPAGE sistemi kullanarak western blot tekniğini uygulamayı. Bu yöntem, transfekte hücrelerde protein ekspresyonunu analiz etmek için güvenilir bir biyokimya protokolü sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, Sağlık ve George E. Hewitt Vakfı burs (AP) National Institutes of hibe ile desteklendi.

Jel elektroforezi Teknik not: işlemine başlamadan önce, protein örneklerinin hazır olması. Bu ilk adım sırasında, örnek proteinler denatüre poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) kullanarak molekül ağırlığına göre ayrılır. Protein örneği, 10 dakika boyunca 70 ° C&#39;de ısıtılmış edildikten sonra Lityum Dodesil Sülfat (LDS) yüklü NuPAGE ® LDS örnek denatüre bir devlet arabellek polipeptidlerin korur . Güçlü indirgeyici ajan, ikincil ve üçüncül yapısı (DTT), disülfür bağları kırmak için kaldırmak için birlikte kullanılır. Buna ek olarak, örnek proteinleri negatif yüklü LDS kaplı hale gelir ve bu nedenle jel akrilamid örgü ile pozitif yüklü elektrot doğru hareket ettirin. Bu moleküler ağırlığı (kilo Dalton, kDa ölçülen) göre ayrılması sağlar. Numune hazırlama ve PAGE işlemi için detaylı adım adım protokolleri Invitrogen web sitesi 2 ya da NuPAGE teknik kılavuzu 3 olabilir Teknik ipuçları <ol><li> I) acrylamid jel konsantrasyonu (alt daha iyi çözünürlük ile sonuçlanan daha fazla akrilamid konsantrasyonu ile Invitrogen NuPAGE Bis-Tris süreksiz tampon sistemi, protein ve jel sonraki ayırma aralığı elektroforetik mobilite iki faktöre bağlıdır. molekül ağırlıklı proteinlerin) ve ii) çalışan tampon, MOPS veya MES sondaki iyon. Size ulaşmak istediğiniz ayırma aralığı için uygun kombinasyonu seçmek için, Jel Göç grafik 1 bakın. , Kuyu jel sayısı ve kalınlığı, hacim ve miktar sırasıyla, yük planı örnekleri bağlıdır. </li><li> Kuyulara jel örnekleri yüklediğinizde, en az bir şerit bir moleküler ağırlık marker (veya merdiven) ayrılmıştır. Bu protein standartları Birçok şirket ticari olarak mevcuttur ve genellikle göç takip için izin görünür bantlar oluşturacak şekilde tanımlı molekül ağırlıkları olan lekeli proteinlerin karışımından oluşur. Molekül ağırlıkları jel çözünürlüğü ile uyumlu bir dizi seçin. </li><li> Güzel ve hatta göç desen elde etmek için benzer bir örnek veya 1X LDS örnek tampon hacmi ile jel TÜM kuyu yükleme öneririz. </li></ol> Transfer Teknik Not: transferi adım başlamadan önce, transfer tamponu (% 10 metanol ile 1X) ve soğuk bir odaya 4 ° C ön-cool hazırlar. Proteinler antikor tespiti için erişilebilir hale getirmek için, onlar bir nitroselüloz membran üzerine jel electroblotting aktarılır. Protein bağlanma membran ve protein arasındaki hidrofobik etkileşimler, yanı sıra şarj etkileşimler üzerine kuruludur. (Poliviniliden florid (PVDF) membran de alternatif olarak kullanılabilir. Bu durumda, PVDF membran, metanol içinde kullanmadan önce en az 30 saniye öncesi ıslak olması gerekir.) Laboratuvar Invitrogen XCell II ile donatılmış olup olmadığını Bio-Rad Mini Trans-Blot Elektroforetik Transferi Hücre, ya da referanslar 2-3 transfer prosedürü ayrıntılı bir adım-adım protokolü referans 4 bulunabilir ™ Modül Blot. Bu sürecin bir sonucu olarak, proteinlerin ince bir yüzey tabakasının maruz kalan ve algılama için hazır. Protein jel membran transferi bütünlüğü ve genel etkinliği, geri dönüşümlü Ponceau G boya membran boyama ile kontrol edilebilir. Ponceau G boyama işlemi (isteğe bağlı): <ol><li> Proteinler aktardıktan sonra, bir kuluçka tepsi membran (proteinler yukarı bakacak şekilde) yerleştirin. </li><li> Membran kapak ve yavaşça sallanarak ile en az 30 saniye inkübe yeterli Ponceau G Boyama ekleyin. </li><li> Arka plan netleşene kadar, saf su ile membran durulayın. </li><li> 2-3 dakika distile su ile çalışan membran Destain. </li><li> Engelleme çözümü membran (aşağıya bakın) yerleştirin. </li></ol> Teknik ipuçları: <ol><li> Biz proteinler maruz edildiği örneklerin yan ve yönünü belirtmek için protein aktarmadan önce bir kalem ile membran etiketleme tavsiye ederiz. </li><li> Ponceau S boyama ve molekül ağırlığı belirteçleri Her iki farklı antikorları ile ortaya çıkan parçalar problama için transferinden sonra membran kesmek için kullanılan olabilir </li></ol> İmmuno: Teknik Not: Bu İmmuno işlem sadece bir kılavuz olarak verilmiştir. Optimizasyon her karınca için gerekli olabiliribody özel bilgiler piyasada bulunan antikorların çoğu veri-yaprak (örneğin, çalışma seyreltme, kuluçka süresi, vb.) bulunabilir. Hedef protein bu son işlemi sırasında, belirli bir antikor kullanarak tespit edecek ve film bir grup olarak görünecektir. Grubun yoğunluğu hedef protein mevcut miktarına bağlıdır ise grubun konumu, hedef proteinin moleküler ağırlığı bağlıdır. Tipik olarak, bu üç substeps sonra sağlanır: <ol><li> Engelleme: membran (zarının üzerinde yer alan aşırı alan bir çözelti genel bir protein ile kaplıdır) ile non-spesifik antikor etkileşimleri önlemek için. </li><li> Problama ilgi protein belirli bir tarafından tespit <a title="Primer antikor" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Primary_antibody">birincil antikor</a> . Ilişkisiz primer antikor yıkanıp sonra, membran muhabiri ile bağlantılı farklı bir antikor maruz <a title="Enzim" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Enzyme">enzim</a> , <a title="Horseradish peroksidaz" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Horseradish_peroxidase">horseradish peroksidaz</a> (HRP). Bu ikincil primer antikor türlerinin belirli bir bölümünü (örneğin bir anti-tavşan ikincil antikor herhangi bir tavşan kaynaklı primer antikor bağlamak) karşı antikor yönlendirilir. </li><li> Algılama: Bir kemilüminesan ajan ikincil antikor HRP maruz kaldığında luminesce bir substrat olarak kullanılır. Bu reaksiyon ve probed protein miktarı ile orantılı olarak lüminesans üretir. Işık, daha sonra fotoğraf filmi tarafından tespit edilir. </li></ol> Genel bir adım-adım prosedürü aşağıda verilmiştir. Diğer ayrıntılı yordamlar ECL Plus, Western Blot Tayin Reaktifleri kullanım kılavuzu 5 ya da data-sheet en piyasada bulunan antikorlar ile birlikte bulunabilir. İnkübasyon süresi, antikor seyreltme, ve engelleme ve yıkama çözümleri ampirik olarak her bir antikor için optimize olması. İmmuno prosedürü: <ol><li> Tüm membran kapak PBS% 1 kazein engelleme çözümü yeterli hacimde kuluçka tarafından non-spesifik bağlanma engelleyin. Oda sıcaklığında en az 30 dakika süreyle bir rocker yerleştirin ya da geceleme 4 ° C </li><li> Membran birincil antikor (faiz protein için özel) ile inkübe edin. Primer antikor çözümü engelleme seyreltilmelidir. En antikorlar için, tam bağlama yavaşça sallanarak altındaki oda sıcaklığında 1-2 saat inkübasyondan sonra elde edilir. Alternatif olarak, sinyal gürültü oranı artırmak ° C inkübasyon adımı 4 gece gerçekleştirilen olabilir. </li><li> Solüsyonu (4 ° C ile -20 ° C tekrar tekrar kullanım için atmayın veya tutmak) çıkarın ve membran hızlı bir kez yıkayın. Daha sonra PBS ile 3x10 dakika iyice sallanarak oda sıcaklığında% 0.05 Tween 20 (PBST). </li><li> Membran çözümü engelleme seyreltilmiş bir HRP-coupled ikincil antikor ile inkübe edin. Primer antikor büyüdü türlerin IgG kısmı tanıyan bir antikor seçin. Inkübasyon yavaşça sallanarak altında oda sıcaklığında 1 saat süreyle yapılır. </li><li> Çözüm atın ve membran hızlı bir kez yıkayın. Sonra iyice sallanarak oda sıcaklığında PBST ile 3x10 dakika. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre kemilüminesan algılama geçin. Biz GE Healthcare (özel talimatlar için bkz: 5 referans) ECL Plus Western Blot Tayin Reaktifleri kullanın. </li><li> Saran wrap membran ya da bir otoradyografi kaset içine bir torba ve yer yerleştirin. Herhangi bir aşırı sıvı boşaltma ve tüm hava kabarcıkları kaldırmak için emin olun. </li><li> Karanlık bir odada membran fotoğraf filmi Açığa. 1 dakika maruz kalma süresi ile başlayın ve istenilen sinyal yoğunluğuna göre ayarlamak. </li></ol> Teknik ipuçları: <ol><li> , Non-spesifik bağlayıcı Engelleme bir protein çözelti membran koyarak elde edilir. Biz genellikle% 1 kazein, ancak <a title="Sığır serum albumini" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Bovine_serum_albumin">sığır serum albumin</a> (~% 2 BSA) bir alternatif olarak kullanılabilir veya yağsız kuru süt (~% 5). </li><li> Tris-Tamponlu Salin (TBS), PBS yerine işlem boyunca kullanılabilir. Phosphospecific antikor ile membran prob planlıyorsanız TBS kullanmanızı öneririz. </li><li> Glow-in-the-koyu, otoradyografi kaset alt dokundunuz etiket (örneğin, Stratagene Glogos ® II Autorad Belirteçler) analiz adımı sırasında film ve sizin membran hizalamak için yardımcı olacaktır. </li></ol> Analiz Filmin maruz Şimdi, pratik açıdan değil, Batılıların bir güzel tek bir grup olarak protein ortaya koyduğunu fark edeceksiniz. Additional bantları da non-spesifik primer ve sekonder antikor bağlanma nedeniyle görünebilir. Bu arka plan sinyali İmmuno prosedürünü optimize ederek azaltılabilir. Buna ek olarak, uygun bir kontrol (örneğin, untransfected hücreleri, siRNA-tedavili hücrelerde, vb.) Antikor özgüllüğü ve membran hedef protein tam yerini belirlemek için faydalı olacaktır. Film membran lekeli standart protein bantları pozisyonu işaretlendikten sonra, her molekül ağırlığı günlük arsa bunlara karşılık gelen bağıl hareketlilik (x-ekseni) karşı protein standartları (y-ekseni). Bağıl hareketlilik (Rf) (jel ön) taşındı, protein uzaktan izleme boya veya düşük molekül ağırlıklı işaretleyici göre orijin noktası (jel üst) taşındı mesafe oranı için kullanılan bir terimdir . Regresyon hattının eğimi ve y kesişim noktası değerlerini elde etmek için standart eğri belirleyin. Hedef protein bilinmeyen molekül ağırlığı (boyut), Rf ve aşağıdaki denklemi kullanarak tahmin edilmektedir: log molekül ağırlığı = (eğim) (hedef protein hareketlilik veya Rf) + y kesişim (Ayrıntılı talimatlar için referans 6&#39;ya bakınız). İfade seviye yaklaşımları hedef proteinin yapısal bir protein (örneğin, tubulin veya aktin) ya da bu tür GAPDH gibi bir housekeeping gen ürünü bu grubun yoğunluğunu karşılaştırarak alınır. Bu sözde &quot;yükleme kontrolü&quot; örnekleri arasında değişmez ve belirli bir birincil antikor ile ortaya çıkar. Görüntü daha da göreli miktarda protein boyama, optik yoğunluk açısından sonuçları değerlendirmek ve ölçmek için dansitometrisi tarafından analiz edilebilir.

<ol><li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel+Migration+chart%3A+%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Gel Migration chart: .</a> , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.invitrogen.com/etc/medialib/en/filelibrary/pdf.Par.99253.File.dat/O-063575-NuPage_fin.pdf">http://www.invitrogen.com/etc/medialib/en/filelibrary/pdf.Par.99253.File.dat/O-063575-NuPage_fin.pdf</a> Forthcoming.</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+western-blot+protocol+from+the+Invitrogen+website%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Complete western-blot protocol from the Invitrogen website.</a> , 
		
 <a target="_blank" href="https://commerce.invitrogen.com/index.cfm?fuseaction=iProtocol.unitSectionTree&treeNodeId=A2C5758BC7C3438B01378A0940376C8E">https://commerce.invitrogen.com/index.cfm?fuseaction=iProtocol.unitSectionTree&treeNodeId=A2C5758BC7C3438B01378A0940376C8E</a> Forthcoming.</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NuPAGE+technical+guide%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">NuPAGE technical guide.</a> , 
 
 <a target="_blank" href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/nupage_tech_man.pdf">http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/nupage_tech_man.pdf</a> Forthcoming.</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instruction+Manual%2C+Mini+Trans-Blot+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Instruction Manual, Mini Trans-Blot Cell.</a> , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.bio-rad.com/cmc_upload/0/000/013/280/M1703930E.pdf">http://www.bio-rad.com/cmc_upload/0/000/013/280/M1703930E.pdf</a> Forthcoming.</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ECL+Plus+Western+blotting+detection+reagents+instruction%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">ECL Plus Western blotting detection reagents instruction.</a> , 
 
 <a target="_blank" href="http://www5.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/139B41E53EDC6210C1256EB40044ACE3/$file/RPN2132PL_Rev_D_2006_web.pdf">http://www5.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/139B41E53EDC6210C1256EB40044ACE3/$file/RPN2132PL_Rev_D_2006_web.pdf</a> Forthcoming.</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+protein+molecular+weights+by+SDS+gel+electrophoresis%2C+GE+Healthcare+Website%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Estimation of protein molecular weights by SDS gel electrophoresis, GE Healthcare Website.</a> , 
 
 <a target="_blank" href="http://www1.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/elpho_applications~elpho_applications_1d_protein_analysis~elpho_sds_page~Elpho_1D_SDS+PAGE+2+Estimation+of+protein+molecular+weights+by+SDS+gel+electrophoresis+~3.+Procedure">http://www1.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/elpho_applications~elpho_applications_1d_protein_analysis~elpho_sds_page~Elpho_1D_SDS+PAGE+2+Estimation+of+protein+molecular+weights+by+SDS+gel+electrophoresis+~3.+Procedure</a> Forthcoming.</li>
<li>Yeromin, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identification+of+the+CRAC+channel+by+altered+ion+selectivity+in+a+mutant+of+Orai%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular identification of the CRAC channel by altered ion selectivity in a mutant of Orai.</a> Nature. 443, 226-229 (2006).</li>
<li>Zhang, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-dependent+and+-independent+modes+regulating+CRAC+channel+activity+of+human+Orai1+and+Orai3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Store-dependent and -independent modes regulating CRAC channel activity of human Orai1 and Orai3.</a> J. Biol. Chem. 283, 17662-17671 (2008).</li>
<li>Penna,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRAC+channel+consists+of+a+tetramer+formed+by+Stim-induced+dimerization+of+Orai+dimers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers.</a> Nature. , Forthcoming.</li>
</ol>

Burada sunulan prosedür MES denatüre SAYFA Invitrogen NuPAGE Novex elektroforez sistemi kullanarak bir örnek olarak tampon çalışan bir Bis-Tris jel kullanıyor. Buna ek olarak, bu prekast jel sistemi denatüre veya non-denatüre koşullarının yanı sıra altında protein ayrılmasına izin molekül ağırlıkları geniş bir yelpazede (1-200 kDa Bis-Tris jeller için 36-400 kDa Tris-uygun Asetat jeller). Denemenizi bağlı olarak, burada açıklanan batı blot tekniği sadece bir bölümünü doğrudan jel boyama işlemleri (örneğin, gümüş veya Coomassie boyama) veya ...

batı invitrogen nupage novex bis tris minigels kullanarak blot

Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Western Blot (veya immün) araştırmacılar, bir proteinin ifade doğrulamak için izin veren bir standart laboratuvar prosedürü, farklı örnekleri protein mevcut bağıl miktarını belirlemek ve co-immunoprecipitation deneylerin sonuçlarını analiz. Bu yöntemde, bir hedef protein, doku homojenatından ya da özü belirli bir örnek belirli bir birincil antikor ile tespit edilir. SDS-PAGE denatüre kullanarak molekül ağırlığına göre protein ayırma sağlanır. Bir zar transferinden sonra, hedef protein belirli bir primer antikor ile probed ve kemilüminesans tarafından algılanır. Western-blot tekniği ilk açıklamasını bu yana, prekast jeller ve kullanıcı dostu donanımları dahil olmak üzere çeşitli gelişmeler, uğramıştır. Laboratuvarımızda, Invitrogen ticari olarak kullanılabilir NuPAGE elektroforez sistemi kullanmayı tercih var. Bu yenilikçi bir nötr pH, süreksiz SDS-PAGE, prekast mini-jel sistem. 8 ay ile 1 yıl arasında değişen pre-cast jeller daha uzun bir raf ömrü i) ii) 1 ile 400 kDa molekül ağırlıkları geniş bir ayırma aralığı türüne bağlı olarak: Bu sistem de dahil olmak üzere, geleneksel Laemmli tekniği üzerinde birçok avantaj sunar jel kullanılır;) ve iii çok yönlülük (akrilamid yüzdesi, jel tipi ve çalışan tamponun iyonik bileşimi aralık). Bu video makalede açıklanan prosedür Invitrogen NuPAGE elektroforez sistemi kullanarak bir western-blot gerçekleştirmek için nasıl bir örnek olarak,% 4-12 Bis-Tris degrade jeller ve MES tampon çalışan Bis-Tris süreksiz tampon sistemi kullanır. Laboratuvarımızda, biz bu batı-blot yöntemi kullanılarak çeşitli biyokimyasal uygulamalar için iyi ve tekrarlanabilir sonuçlar elde edilmiştir.

Bu teknik makale Invitrogen gelen ticari olarak kullanılabilir NuPAGE elektroforez Mini Jel sistemi kullanarak standart bir western-blot prosedürü açıklamaktadır.

Batı Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels kullanarak Blot

Western Blotting (veya immünoblotlama), araştırmacıların bir proteinin ekspresyonunu doğrulamasına, ... belirlemesine olanak tanıyan standart bir laboratuvar prosedürüdür.

Merhaba, benim adım OB Pena. California Üniversitesi'nin fizyoloji ve biyofizik bölümündeki Michael Car Laboratuvarı'nda çalışıyorum. Bugün sizlere, Individual Gene'in yeni page sistemini kullanarak nasıl western blot yapılacağını göstereceğim.Bu, çöktürme deneylerinin sonuçlarını kontrol etmek amacıyla protein ekspresyonunu analiz etmek için kullanılan temel bir tekniktir. Western blot teknikleri üç temel aşamadan oluşur: jelin yüklenmesi ve yürütülmesi, proteinin jelden nitrocellulose membrana aktarılması ve membranının immün probing ile analiz edilmesi. Bugün, transfekte hücrelerde bir proteinin ekspresyonunu analiz etmek için bu tekniği kullanacağım.Bu nedenle, protein numuneleri her zaman X için bir numune tamponu içinde yanıt verecek şekilde numuneyi hazırlıyorum. Bu numune tamponu, numuneyi yüklemenize yardımcı olacak bir boya ve numunenin kuyucuğun dibine çökmesine yardımcı olacak gliserol içerir. Ayrıca tampon ve LDS içerir. Bu, proteinleri kaplayabilen negatif yüklü bir deterjandır; böylece proteinler, yüke göre değil, moleküler ağırlıklarına göre elektrik alanında göç ederler.İnaktif bağları koparmak için DTT gibi bazı indirgeyici ajanlar da eklemeniz gerekir. Bu nedenle

western-blotting-using-the-invitrogen-nupage-novex-bis-tris-minigels

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, mavi yerli poliakrilamid jel elektroforezi (BN-PAGE) multiprotein kompleksler (MPCs) karakterizasyonu açıklar. Birinci boyut, diyaliz hücresel lizatları bireysel MPCs tanımlamak için BN-PAGE ile ayrılır. Ikinci bir boyut SDS-PAGE, faiz MPCs daha immün bileşenleri analiz alt gruba ayrılır.

Hücresel lizatları Multiprotein Kompleksleri Analizi Mavi Native Poliakrilamid Jel Elektroforez (BN-PAGE)

Western blotting, doku homojenatından ya da özü belirli bir örnek özel proteinleri tespit etmek için kullanılan analitik bir tekniktir.

Western Blot: Numune Hazırlama Algılama

Bizim protokolü bir ev geliştirme mağazasından satın dönüşüm Invitrogen Nupage Novex minigel kaset ve ucuz malzemeler ile aynı anda birden fazla protein jelleri dökün gösterilmiştir. Bu ekonomik ve akıcı yöntemi, birkaç hafta süreyle 4 ° C'de jeller depolamak için bir yöntem içerir. Piyasada satılan jeller, sık sık protein jeller çalıştırmak laboratuarlarından plastik jel kasetleri yeniden kullanarak önemli maliyet tasarrufu ve çevre yardımcı olabilir.

Ticari kasetleri yeniden kullanılmasıyla Dökme ve Protein Jel Koşu

Bu videoda, doğal protein komplekslerini doku homojenatlarından ayırmak için multimerik PAGE açıklanmaktadır. Teknik, mavi yerel PAGE ve SDS-PAGE tekniklerinin bir karışımıdır. Ayrılan kompleksler, hücre işleyişindeki rolleri için karakterize edilebilir ve incelenebilir.

Doğal protein komplekslerini ayırmak için Multimer-PAGE: bozulmamış multimerik proteinleri doku lizatından ayırmak için Blue Native-PAGE ve SDS-PAGE'den oluşan hibrit bir ayırma tekniği

V3 iş akışı lekesiz jeller kullanan batı lekeli bir prosedürdür. Lekesiz teknoloji, araştırmacıların protein ayırma kalitesini görselleştirmelerine, transfer verimliliğini doğrulamalarına ve en önemlisi güvenilir bir yükleme kontrolü olarak toplam protein nicelemesini kullanarak ilgi proteinindeki değişimi doğrulamalarına olanak tanır.

Batı Blotting'de Pratik, Kullanışlı ve Güvenilir Toplam Protein Yükleme Kontrolü için V3 Lekesiz İş Akışı

Bu protokol Western Blot analizleri gerçekleştirerek son gelişmeleri araştırıyor. Bu yeni değişiklikler 35 dk elektroforez çalışma süresi, 7 dk kuru emme transfer sistemi ve yüksek çözünürlük, kalite, hassasiyet ve Batı verilerin gelişmiş doğruluğu üretir kızılötesi floresan protein algılama ve görüntüleme ile Bis-Tris jel sistemini kullanır.

Town Batı Hızlı: Klasik Western Blot Analizi Üzerine Bir Çağdaş Büküm

İnsan ve fare beyin dokusu için üre / tiyoüre / SDS tamponu kullanılarak ortak bir protein ekstraksiyon protokolü sağlar: 2D-dige ve mini 2DE immunoblotting kendi müteakip özellik tayini ile protein indentification. Bu yöntem, insan biyopsi ve deneysel modellerden gerçekleştirilen daha güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için bir olanak sağlar.

Konsensus Beyin kaynaklı protein, 2D-DIGE ve Mini 2DE İmmünoblotting Hem kullanma İnsan ve Kemirgen Beyin proteomun Çalışmaları Ekstraksiyon Protokolü

Floresan kullanarak western blotlamanın ilerlemesi, kantitatif analizlere olanak tanıyan protein ekspresyonundaki ince değişikliklerin tespit edilmesine izin verdi. Burada, çeşitli türler ve doku tiplerinde bir dizi proteinin tespiti için sağlam bir metodoloji açıklıyoruz. Yaygın teknik sorunların üstesinden gelmek için bir strateji de sağlanmaktadır.

Sorun Giderme Stratejileri Modern Kantitatif Floresan Western Blot A Guide

Burada bir etiket bilgilerini kantitatif kütle spektrometresi kullanılarak protein korelasyon profil ardından afinite protein komplekslerinin saflaştırılması ve mavi doğal PAGE ile onların ayrılması için protokoller, mevcut. Bu yöntem, farklı protein kompleksleri halinde interactomes çözmek için yararlıdır.

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Burada büyük yerli protein: protein ve protein protein bileşimi çözümlemek için bir protokol mevcut: yağlı tohum tecavüzünün nükleik asit kompleksleri (B. napus) mavi birleştiren 3D polyacrylamide Jel Elektroforez (sayfa) yaklaşımı kullanılarak, phloem çıktı yerli (BN) tarafından kitle spektrometrik kimlik ardından iki tane denaturing sayfa.

Phloem Sap örnekleme gelen Brassica napus 3D-sayfa Protein ve Ribonükleoprotein kompleksleri için

Bir iletişim kuralı bitki aydınlatma için thylakoid protein kompleksi organizasyon ve mavi yerel polyacrylamide ile kompozisyon jel elektroforez (BN-sayfa) ve 2D-SDS-sayfa açıklanmıştır. Protokol Arabidopsis thalianaiçin optimize edilmiş ama küçük değişiklikler ile diğer bitki türleri için kullanılabilir.

Thylakoid membran Protein kompleksleri tarafından mavi yerli jel elektroforez Analizi

Öğrenin, Invitrogen NuPAGE sistemi kullanarak western blot tekniğini uygulamayı. Bu yöntem, transfekte hücrelerde protein ekspresyonunu analiz etmek için güvenilir bir biyokimya protokolü sunar.

Batı Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels kullanarak Blot

Daha fazla video keşfet