Name: Asimetrik Reseptör Desenler Hücre Rolling Yörüngeler incelenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-13T16:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 24 s
Description: Öğrenin, HL-60 hücrelerinin asimetrik reseptör desenlerdeki rolling yörüngelerini mikro temas baskı ve akış odası kullanarak analiz etmeyi. Bu yöntem etiketsiz hücre ayrımı için substrat mühendisliğine katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu proje, MIT&#39;de Deshpande Teknolojik Yenilik Merkezi (RK ve JMK) ve Kimyasal ve Biyolojik Ayrımları programı ile RK NSF KARİYER ödül 0.952.493 tarafından desteklenmiştir. Biz Asker Nanoteknolojiler (ISN) ve tesislerin kullanımı için MIT&#39;de Microsystems Teknoloji Laboratuvarı (MTL) Institute for teşekkür ederim.

1. Haddeleme HL60 hücre 1.1. Desenli Yüzeyler imalatı. <ol><li> Altın kaplamalı cam slaytlar PEG moleküllerinin kendi kendini monte mono tabakaları (SAMs) alternatif yapmak microcontact baskı (μCP) 4-7 kullanma: α = 10, eğim açısı ile reseptör desenleri tanımlanan microcontact baskı polidimetilsiloksan (PDMS) pulları Üretiyor SU-8 kalıplama işlemi °. 20 dakika boyunca altın piranha çözüm (sülfürik asit 03:01 karışımı% 30 hidrojen peroksit) ile yüzeyi temizleyin ve sonra, bol DI su ile 24.5 ° C önceden az yüzey durulayın. Etanol 5mM PEG solüsyonu ile Mürekkep PDMS damgası. 20 dakika boyunca hava damga kurulayın. 40 saniye süreyle yavaşça altın yüzeyinde pul koymak ve altın yüzey arasında iyi bir iletişim ve damgası olduğundan emin olun. Aşırı basınç gerek yoktur. Etanol ile yüzey N 2 akışı altında durulayın ve kurulayın. </li><li> Yüzey 24,5 az 3 saat boyunca perfüzyon odası (Elektron Mikroskobu Bilimleri) kullanarak ° C desen P-selektin ile diğer alanlar. P-selektin çözüm (15 mg / DPBS mL) içinde inkübe Yüzey bol DPBS ile durulayın. </li><li> Dolgu BSA (DPBS 1 mg / ml) ile yüzey 1 saat non-spesifik etkileşimleri engellemek için. Yüzey bol DPBS ile durulayın. </li></ol> 1.2. Hücre Akış Odası Rolling Deneyler. <ol><li> HL60 hücreleri (~ 10 5 hücre / ml) (genişliği w = 1,0 cm, uzunluğu = 6 cm; Glycotech, Inc yüksekliği h = 0,0127 cm) dikdörtgen bir akış odasında desenli yüzeyler üzerinde bir süspansiyon Akış 24.5 ° C 75 mcL / dak akış hızı üretmek için yaklaşık 0.5 dyn / cm 2 (~ 0.05 Pa) karşılık gelen kayma gerilmesi, bir şırınga pompası (Dünya Hassas Aletler, SP230IW) kullanın . Kayma gerilmesi τ uçağın Poiseuille hacimsel debisi Q μ kinematik viskozitesi (0.001002 Pa ler) τ = 6μQ/wh 2, akış denklemi kullanarak hesaplayın, w akışını odasının genişliği ve h yüksekliği akış odasına. </li><li> 300 süreleri için genellikle saniyede 1 kare hızında, 4 kullanarak yapışkan P-selektin yüzeyler ile etkileşim haddeleme HL60 hücreleri kaydetmek için monte edilmiş bir kamera (Andor IXON 885) × amacı ile bir inverted mikroskop (Nikon TE2000-U) kullanın s Her kayma gerilmesi büyüklüğü ve desen eğim açısı için üç bağımsız deneyler, gerçekleştirin. Her deneyden elde edilen ortalama değerler ortalama ve standart sapma gibi mevcut veri. </li><li> Veri Analizi. Görüntü dizileri bir parçacık desenli hat kenarlarında parçaları üretmek için ücretsiz 8 izleme kullanılan özelleştirilmiş bir Matlab (Mathworks, Inc.) Programı tarafından analiz edin. P-selektin bandının sonuna kadar uzanan parçalar seçilir ve iki düz çizgi parçaları ile donatılmış akışı ile uyumlu bir desen kenarı ile uyumlu diğer. Bu iki parça daha sonra kenarına hız haddeleme, ve düz bir bölgeye hız haddeleme, kenar izleme uzunluğunu hesaplamak için kullanılır. </li></ol> 2. Temsilcisi Sonuçlar: <img src="/files/ftp_upload/2640/2640fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil (A) 4 × amacı kullanarak yapışkan P-selektin yüzeylerde HL60 haddeleme etkileşimleri video dönüştürülür mikroskop görüntülerini bir gösterir. Parlak ve koyu bölgeler sırasıyla, P-selektin reseptör ve PEG bölgelere karşılık gelir. Şekil (B) özelleştirilmiş bir Matlab programı kullanılarak elde parçalarını gösterir. Kenar eğim açısı 10 ° ve kayma gerilmesi 0.5 dyn / cm 2 idi. (C-2), kenar izleme uzunluğu, l e, deplasman, d ve kenarında ve haddeleme hızları sırasıyla bantlar, V e ve V p, içinde, (C-1) Şekil olarak açıklanmıştır. Şekil gösterir kenar izleme uzunluğu dağılımı (kaydedilen hücrelerinin sayısı). Insets l e ortalama değer ve kenarında haddeleme hızı (V e) ve (V p), eğim açısı, bantları içinde α = 10 ° ve sıvı shear stresin büyüklüğü 0.5 dyn / cm 2 civarında . Hata çubukları, bir standart sapma, n = 3, her durum için çoğaltmak denemeleri (3 çoğaltmak yüzeyler) temsil

<ol><li>Karnik, R., Hong, S., Zhang, H., Mei, Y., Anderson, D. G., Karp, J. M., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomechanical+control+of+cell+rolling+in+two+dimensions+through+surface+Patterning+of+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Nanomechanical control of cell rolling in two dimensions through surface Patterning of receptors.</a> Nano Lett. 8 (4), 1153-1158 (2008).</li>
<li>Lee, C. H., Bose, S., Van Vliet, K. J., Karp, J. M., Karnik, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+Lateral+Displacement+of+HL60+Cells+Rolling+on+Asymmetric+P-selectin+Patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Examining Lateral Displacement of HL60 Cells Rolling on Asymmetric P-selectin Patterns.</a> Langmuir. 27 (1), 240-249 (2011).</li>
<li>Norman, K. E., Moore, K. L., McEver, R. P., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+rolling+in-vivo+is+mediated+by+p-selectin+glycoprotein+ligand-1%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Leukocyte rolling in-vivo is mediated by p-selectin glycoprotein ligand-1.</a> Blood. 86 (12), 4417-4421 (1995).</li>
<li>Bernard, A., Delamarche, E., Schmid, H., Michel, B., Bosshard, H. R., Biebuyck, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printing+patterns+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Printing patterns of proteins.</a> Langmuir. 14 (9), 2225-2229 (1998).</li>
<li>James, C. D., Davis, R. C., Kam, L., Craighead, H. G., Isaacson, M., Turner, J. N., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+protein+layers+on+solid+substrates+by+thin+stamp+microcontact+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Patterned protein layers on solid substrates by thin stamp microcontact printing.</a> Langmuir. 14 (4), 741-744 (1998).</li>
<li>Mrksich, M., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+self-assembled+monolayers+to+understand+the+interactions+of+man-made+surfaces+with+proteins+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Using self-assembled monolayers to understand the interactions of man-made surfaces with proteins and cells.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 25, 55-78 (1996).</li>
<li>Tan, J. L., Tien, J., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcontact+printing+of+proteins+on+mixed+self-assembled+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Microcontact printing of proteins on mixed self-assembled monolayers.</a> Langmuir. 18 (2), 519-523 (2002).</li>
<li>Matlab Particle Tracking. , Avaliable from: 
	
 <a target="_blank" href="http://physics.georgetown.edu/matlab/">http://physics.georgetown.edu/matlab/</a> Forthcoming.</li>
<li>Lee, D., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcontact+Printing+of+P-Selectin+Increases+the+Rate+of+Neutrophil+Recruitment+Under+Shear+Flow%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Microcontact Printing of P-Selectin Increases the Rate of Neutrophil Recruitment Under Shear Flow.</a> Biotechnology Progress. 24 (5), 1052-1059 Forthcoming.</li>
<li>Greenberg, A. W., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+separation+mediated+by+differential+rolling+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Cell separation mediated by differential rolling adhesion.</a> Biotechnol. Bioeng. 73 (2), 111-124 (2001).</li>
<li>Higuchi, A., Tsukamoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+separation+of+hepatocytes+and+fibroblasts+through+surface-modified+polyurethane+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Cell separation of hepatocytes and fibroblasts through surface-modified polyurethane membranes.</a> J. Biomed. Mater. Res. Part A. 71A (3), 470-479 (2004).</li>
<li>Alexeev, A., Verberg, R., Balazs, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+surfaces+segregate+compliant+microcapsules%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Patterned surfaces segregate compliant microcapsules.</a> Langmuir. 23 (3), 983-987 (2007).</li>
</ol>

Biz microcontact baskı 2 kullanılarak üretilen asimetrik reseptör desenli yüzeyler hücre haddeleme yörüngeleri incelemek için bir protokol tanımlanmıştır. PEG ve P-selektin alanlar arasında belirgin kontrast gösteren desenli yüzey optik mikroskop görüntüleri damgalama başarılı olup olmadığını teyit etmek için kullanılabilir. Keskin, düz kenarlar damgalama iyi yapıldığında görülebilir. Hard damga basarak desen hassas sınırlar damga deformasyona neden olabilir. Dalgalı kenarları mürekkep konsantrasyonu çok yüks...

<table><tbody><tr><td>İnsan promyelositik lösemi hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CCL-240</td><td>HL60 hücreleri</td></tr><tr><td>Altın kaplama cam lamlar</td><td>EMF</td><td>TA134</td><td>Altın lamlar</td></tr><tr><td>(1-Merkaptoundek-11-il)tetra(etilen glikol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>674508</td><td>PEG</td></tr><tr><td>Rekombinant insan P-selektin</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>ADP3-050</td><td>P-selektin</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>Rockland Immunochemicals</td><td>BSA-50</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s fosfat tamponlu salin</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>21-030</td><td>DPBS</td></tr><tr><td>Sülfürik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>Hidrojen peroksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>316989</td><td></td></tr></tbody></table>

asimetrik reseptör desenler hücre rolling yörüngeler incelenmesi

Studying Cell Rolling Trajectories on Asymmetric Receptor Patterns

Yanal deplasman asimetrik reseptör desenleri üzerinde yuvarlanan bir akış akışa dik hücreleri, hücreler 1 etiket ayırma ve analiz için yeni cihazlar geliştirilmesi için bir fırsat sunar . Bu tür cihazlar sürekli akış ayrılması, ya da farklı hücre fenotipleri veya reseptör ekspresyonu düzeyleri birbirinden ayırt etmek yapışma modüle reseptör desen yanal deplasman kullanabilirsiniz. Hücre reseptör-desenli yüzeyler üzerinde yuvarlanma yörüngeleri doğasını anlamak yüzeyleri ve bu tür cihazların tasarım mühendisliği için gerekli. Burada, biz, hücre haddeleme yapışma 2 destekleyen asimetrik reseptör desen hücre haddeleme yörüngeleri eğitim için bir protokol göstermektedir . İyi tanımlanmış, P-selektin reseptörleri mikron çaplı bir desen, bir akış odasında dahil edildi altın kaplı slaytlar üzerinde baskı microcontact kullanılarak imal edildi. PSGL-1 ligand 3 ifade HL60 hücreleri desenli çizgiler bir alan boyunca aktı ve ters bir aydınlık alan mikroskobu görüntülendi. Hücreler lateral çökme 1 desen eğimli kenarları boyunca rulo ve paletli. Her hücre, tipik olarak belirli bir mesafe (kenar izleme uzunluğu olarak tanımlanır) desen kenarlarında haddelenmiş kenarına kopuk ve bir alt-desen yatışma. Bu dekolmanı zor akışını odasına çıkmak için girişten itibaren bir hücrenin tüm yörünge takip hale getirse de, parçacık izleme yazılımı, tek bir reseptör üzerinde hareket olduğu zaman yuvarlanma sırasında hücrelerin yörüngeleri analiz ve verim desenli hat. Yörüngeleri, daha sonra hücre haddeleme hızları ve her hücre için farklı desen izleme kenar uzunlukları dağılımları elde etmek için incelendi. Bu protokol, hücre reseptör desen haddeleme yörüngeleri ölçülmekte ve desen açısı ve kayma gerilmesi gibi bu mühendislik parametrelerini ilgili yararlıdır. Bu tür veriler, etiket hücre ayırma ve analiz için mikroakışkan cihazların tasarımı için faydalı olacaktır.

Biz asimetrik reseptör-desenli yüzeyler üzerinde hücre haddeleme yörüngelerini gözlemlemek ve analiz etmek için bir protokol açıklar. Ortaya çıkan veriler etiket ücretsiz cep ayırma ve analiz için reseptör-desenli yüzeylerin mühendisliği için yararlıdır.

Asimetrik Reseptör Desenler Hücre Rolling Yörüngeler incelenmesi

Asimetrik reseptör desenleri üzerinde yuvarlanarak hücrelerin akış hattına dik yönde yanal olarak yer değiştirmesi, yeni ... geliştirilmesi için bir fırsat sunmaktadır.

Bu protokol, etiketsiz hücre ayırımı ve analizi için reseptör desenli altlıkların mühendisliğini kolaylaştırmak amacıyla, asimetrik reseptör desenleri üzerindeki hücre yuvarlanma yörüngelerini gözlemler ve analiz eder; işlem, altın bir altlık üzerine PEG moleküllerinin mikro temas baskısı ile uygulanarak ardışık kendiliğinden düzenlenen tek tabakalı desenlerin oluşturulmasıyla başlar ve ardından altlığın P selectin reseptörleri ile doldurulmasıyla devam eder. Ardından, altlık akış odasına yerleştirilir. HL 60 hücreleri odanın içine akıtılır.HL 60 hücrelerinin P selectin desenleri üzerindeki yuvarlanma etkileşiminin bir görüntü dizisini kaydedin ve videodan dönüştürülen görüntüleri analiz edin. Yuvarlanan hücre kenar izleme uzunluğu ile düzlem, bölge ve kenardaki yuvarlanma hızlarının yörüngeleri bir MATLAB programı kullanılarak elde edilebilir. Bu yöntem, HO 60 hücrelerinin kayma akışında asimetrik reseptör desenleri üzerinde nasıl hareket ettiğine dair bilgi sağlayabilir.Bu yöntem, diğer hücre yüzey etkileşimlerinin nicelleştirilmesi, reseptör desenleri üzerindeki yörüngelerinin gözlemlenmesi yoluyla hücrelerin doğrudan analizi ve hücre ayırma için mikro ayak basma cihazlarının ta

studying-cell-rolling-trajectories-on-asymmetric-receptor-patterns

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu rapor, görsel bir tasviri lökosit leşimlerini kayma fizyolojik stres altında çalışmak için paralel plaka akış segment analizi sağlar. Bu yöntem, tetik lökosit endotel hücre yüzeyleri üzerinde yuvarlanan E-selektin, endotel (E)-selektin ve lökosit ligandlar rolünü araştırmak için özellikle yararlıdır.

Mikrovasküler Endotel Fizyolojik E-selektin aracılığı ile Lökosit Rolling Analizi

Canlı hücre göç çalışmaları için bir mikroskop odasında yapıştırıcı ve çözünür degradelerin montajı için bir yöntem tarif edilmiştir. Mühendislik ortamı çözümü degradelerle antifouling yüzeyleri ve yapıştırıcı parçaları birleştirir ve bu nedenle bir rehberlik ipuçları göreli önemini belirlemek için izin verir.

Floresan Mikroskobu ile Görüntüleme Hücre Göç Yapıştırıcı ve Çözünür Degradeler oluşturma

Bu çalışma, önemli fizyolojik olarak ilgili kesme akımı altında, hücre haddeleme çalışmalar artırıp, çok oyuklu bir plaka mikroakışkan sistemi kullanılır. Silsilesini ve hastalarda hücre ekzojen popülasyonlarının sistemik olarak uygulanmasını takiben hücre hedeflemesi önemini homing çok adımlı, hücre haddeleme önemi göz önüne alındığında, bu sistem, hücre bazlı tedaviyi geliştirmek için bir tarama platform olarak potansiyel sunmaktadır.

Sistematik Analizi In Vitro Hücre Rolling

Bu protokol, canlı hücrelerin yüzeyindeki tek reseptörleri görselleştirmek ve izlemek ve böylece reseptör yanal hareketliliğini, reseptör komplekslerinin boyutunu analiz etmek ve ayrıca geçici reseptör-reseptör etkileşimlerini görselleştirmek için toplam iç yansıma floresan mikroskobunun nasıl kullanılacağını açıklar. Bu protokol diğer zar proteinlerine genişletilebilir.

Tek molekül Floresan Mikroskopi Reseptör Dinamiği Yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal Analizi

Görsel kemotaksis deneyleri kemoatraktan aracılı yönlü hücre göçü nasıl kontrol ökaryotik hücreler daha iyi anlaşılması için gereklidir. 1) Gerçek zamanlı, çoklu kemotaksis deneyleri yüksek çözünürlüklü izleme ve 2) aynı anda kemoatraktan degrade görselleştirmek ve nötrofil gibi HL60 hücrelerinde sinyal olaylarının zamanmekansal dinamiği: Burada ayrıntılı yöntemler açıklanmaktadır.

Görüntüleme G Nötrofil gibi HL60 Hücreleri Kemotaksis ve Sinyal Olaylar Reseptör aracılı Protein-çiftli

Burada, tek parçacık kantitatif değerlendirilmesi Difüzyon katsayıları, Floresans mikroskobu tarafından algılanan tek parçacıkların hareket ve küme boyutları türleri sağlar görüntü analizi izleme için bir iletişim kuralı mevcut.

Görüntü membran reseptörleri Floresans mikroskobu tarafından küme boyutunu ve Difüzyon analizi için protokol işleme

Bu protokolün amacı, canlı hücrelerdeki yüzey reseptör dinamiklerini dört boyutlu olarak görselleştirmek için Kafes Işık Sayfası Mikroskobu'nun nasıl kullanılacağını göstermektir. Burada CD4+ primer T hücrelerindeki T hücre reseptörleri gösterilmiştir.

Yüzey T-Hücre Reseptör Dinamiklerini Dört Boyutlu Olarak Kafes Işık Sayfası Mikroskobu Kullanarak Görselleştirme

Mekanik kuvvetler hücre göçlerini kontrol etmek için önemlidir. Bu protokol, hücre yapısı ve göç değişiklikleri ortaya çıkarmak için yerel bir sertlik gradyan ile hücreleri uyarmak için bir cam mikropipette ve bir mikromanipülatör kullanılarak deforme edilebilir elastik hidrojellerin kullanımını göstermektedir.

Hücresel Hareketin Mekanik Kontrolünün Ve İlgili Sinyal Olaylarının Değerlendirilmesi için Tek Hücreli Durotaksis Tsay

Bu protokolde canlı hücre mikroskopisi esas alınarak yapılan test yayılan bir hücrenin deneysel prosedürlerini sunuyoruz. Floresan etiketli hücrelerin tarafsız segmentasyonu ve hücre yayılması sırasında lamellipodia dinamiklerinin nicel analizi için açık kaynaklı bir hesaplama aracı sunuyoruz.

Hücre Yayma Sırasında Hücre Kenarı Dinamiklerinin Nicel Analizi

Bu protokol, hızlı hücre yuvarlaması yapışması sırasında yapışma olaylarını görüntüleyene kadar yapışma ayak izi testini gerçekleştirmek için deneysel prosedürleri sunar.

Yapışma Ayak İzi Tahlili ile Hücre Yuvarlanmasında Görüntüleme Moleküler Yapışması

Bu protokol, yayılan hücrelerin kenarındaki çıkıntıların dinamik parametrelerini (çıkıntılar, geri çekmeler, fırfırlar) ölçmeyi amaçlamaktadır.

Canlı Hücre Mikroskobu ile Yayılma Sırasında Hücre-Kenar Çıkıntı Dinamiğinin Ölçülmesi

Öğrenin, HL-60 hücrelerinin asimetrik reseptör desenlerdeki rolling yörüngelerini mikro temas baskı ve akış odası kullanarak analiz etmeyi. Bu yöntem etiketsiz hücre ayrımı için substrat mühendisliğine katkı sağlar.

Asimetrik Reseptör Desenler Hücre Rolling Yörüngeler incelenmesi

Daha fazla video keşfet