Asimetrik Reseptör Desenler Hücre Rolling Yörüngeler incelenmesi
13 Şubat 2011
Biz asimetrik reseptör-desenli yüzeyler üzerinde hücre haddeleme yörüngelerini gözlemlemek ve analiz etmek için bir protokol açıklar. Ortaya çıkan veriler etiket ücretsiz cep ayırma ve analiz için reseptör-desenli yüzeylerin mühendisliği için yararlıdır.
Bu protokol, etiketsiz hücre ayırımı ve analizi için reseptör desenli substratların mühendisliğini kolaylaştırmak amacıyla, asimetrik reseptör desenleri üzerindeki hücre yuvarlanma yörüngelerini gözlemler ve analiz eder; işleme, altın bir substrat üzerine PEG moleküllerinin mikro temas baskılama yöntemiyle uygulanarak kendi kendine düzenlenen tek tabakaların ardışık desenlerinin oluşturulması ve ardından substratın P selektin reseptörleri ile geri doldurulmasıyla başlanır. Daha sonra, substrat akış hücresine yerleştirilir. HL 60 hücreleri hücre içerisine akıtılır.
HL 60 hücrelerinin P selectin desenleri üzerindeki yuvarlanma etkileşiminin bir görüntü dizisini kaydedin ve videodan dönüştürülen görüntüleri analiz edin. Yuvarlanan hücrenin kenar izleme uzunluğu ve düzlem, bölge ile kenar üzerindeki yuvarlanma hızlarının yörüngeleri bir MATLAB programı kullanılarak elde edilebilir. Bu yöntem, HL 60 hücrelerinin kesme akışı altındaki asimetrik reseptör desenleri üzerinde nasıl hareket ettiğine dair bilgi sağlayabilir.
Bu yöntem, diğer hücre yüzeyi etkileşimlerinin nicelleştirilmesi, reseptör desenleri üzerindeki yörüngelerinin gözlemlenmesi yoluyla hücrelerin doğrudan analizi ve hücre ayırımı için mikro ayak izi cihazlarının tasarımı için uygulanabilir. Mikro temas baskılama, altın substrat üzerinde peg moleküllerinin kendi kendine düzenlenen tek tabakalarından oluşan ardışık desenler oluşturmak için kullanılır.
Öncelikle PDMS damgayı, etanol içindeki beş milimolar PEG çözeltisi ile mürekkeple kaplayın. Yüzeyi 20 dakika boyunca kurutun. Damgayı altın yüzeye nazikçe 40 saniye boyunca yerleştirin ve altın yüzey ile damga arasında iyi bir temas olduğundan emin olun.
Fazla basınca gerek yoktur. Yüzeyi etanol ile durulayın ve bir azot akımı altında kurutun. Şimdi bir perfüzyon kamerası kullanarak, kalan alanları P selectin ile desenlemek için substratları 15 µg/mL P selectin çözeltisi ile oda sıcaklığında üç saat boyunca inkübe edin; ardından kamerayı durulayın ve spesifik olmayan etkileşimleri engellemek için yüzeyleri 1 mg/mL BSA ile bir saat boyunca geri doldurun.
Hücre yuvarlanma deneyini gerçekleştirmeden önce yüzeyi DPBS tamponu ile durulayın. Akış odasını kurun ve ardından mL başına 10⁵ HL 60 hücresinden oluşan bir süspansiyonu, reseptör desen eğim açısı 10 derece olan dikdörtgen bir akış odasındaki desenli yüzeyler üzerinden akıtın.
24.5 °C oda sıcaklığında. Şırınga pompasını, 0.5 dyne/cm²'lik karşılık gelen laminar kayma gerilmesi ile dakikada 75 µL akış hızı oluşturacak şekilde ayarlayın. Şimdi evirtilmiş bir mikroskop ve monte edilmiş bir kamera ile HL 60 yuvarlanmasını kaydedin.
Adhezif p-selektin ve substratlar ile etkileşimler. Saniyede bir kare hızında, 4x objektif kullanarak 300 saniye boyunca kayıt yapın. Üç bağımsız deney gerçekleştirin.
Verileri, her deneyden elde edilen ortalama değerlerin ortalaması ve standart sapması olarak sunun. Mikroskop görüntüleri HL 60.Rolling videosundan dönüştürülmüştür. Adezif p-selektin ve substratlar ile olan etkileşimler, sırasıyla p-selektin reseptör ve PEG bölgelerine karşılık gelen parlak ve karanlık bölgeler göstermektedir.
İzler, burada özelleştirilmiş bir MATLAB programı kullanılarak belirlenmiştir. Kenar eğim açısı 10 derece ve kayma gerilmesi santimetrekare başına 0,5 dyne olarak belirlenmiştir. Kenar izleme uzunluğu dağılımı, ortalama kenar izleme uzunluğu değerinin yanı sıra bantların kenarındaki ve içindeki yuvarlanma hızları olan VE ve VP üzerine daha ileri analizler yapılmıştır.
Bu videoyu izledikten sonra, asimetrik reseptör paternlerindeki hücre yörüngelerinin nasıl inceleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, etiketsiz hücre ayırma ve analizi için reseptör desenli altlıkların mühendisliğini kolaylaştırmak amacıyla, asimetrik reseptör desenleri üzerindeki hücre yuvarlanma yörüngelerini gözlemler ve analiz eder.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre biyolojisi
- Biyomalzemeler
- Mikroakışkanlar
Arka Plan
- Hücre yuvarlanması, çeşitli biyolojik etkileşimlerde kritik bir süreçtir.
- Asimetrik reseptör paternleri hücre davranışını etkileyebilir.
- İşaretsiz teknikler, hücre ayrıştırma ve analizi için gereklidir.
- Mikro temas baskılama, paternlenmiş alt tabakalar oluşturmak için yararlı bir yöntemdir.
Çalışmanın Amacı
- Reseptör desenli alt katmanlar üzerinde hücre yuvarlanmasını gözlemlemek için bir protokol geliştirmek.
- Daha iyi alt katman mühendisliği için yuvarlanan hücrelerin yörüngelerini analiz etmek.
- Akış koşulları altında hücre hareket dinamikleri hakkında bilgi sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Altın bir substrat üzerine PEG moleküllerinin mikro temas baskılama yöntemiyle aktarılması.
- Ardışık öz-düzenleyici tek tabakalı örüntülerin oluşturulması.
- Substratın P-selectin ve reseptörler ile doldurulması.
- Akış odasına yerleştirme ve örüntüler üzerinde yuvarlanan HL-60 hücrelerinin görüntülenmesi.
Temel Sonuçlar
- HL-60 hücre etkileşimlerinin görüntü dizileri kaydedildi.
- Yuvarlanan hücrelerin yörüngeleri MATLAB kullanılarak analiz edildi.
- Kenar takip uzunluğu ve yuvarlanma hızlarına ilişkin veriler elde edildi.
- Asimetrik reseptör desenleri üzerindeki hücre hareketine dair bilgiler sağlandı.
Sonuçlar
- Protokol, hücre yuvarlanma dinamiklerinin ayrıntılı analizini sağlar.
- Etkili hücre ayırımı için asimetrik reseptör desenleri tasarlanabilir.
- Bu yöntem, hücrelerin kayma akışındaki davranışlarının anlaşılmasına katkıda bulunur.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Asimetrik reseptör desenleri üzerindeki hücre yuvarlanma yörüngelerinin anlaşılması, etiketsiz mikroakışkan ayırma cihazlarının rasyonel tasarımına olanak tanır. Bu protokol, belirlenmiş kayma gerilimi altında kenar takip uzunluğu ve yuvarlanma hızı hakkında nicel veriler sağlayarak, hücrelerin akış içindeki davranışlarının öngörülü modellenmesini destekler. Bu tür içgörüler, hücre saflaştırma ve fenotipik analiz iş akışları için cihaz mühendisliğindeki ampirik tekrarları azaltır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Fizyolojik kayma altında ligand-reseptör bağlanma kinetiğinin incelenmesine olanak tanıyarak, adezyon aracılı yollar için hedef doğrulama sürecine bilgi sağlar.
- Operasyonel Değer: Floresan etiketler veya genetik raporlayıcılar olmadan, fonksiyonel reseptör aktivitesini değerlendirmek için etiketsiz bir yöntem sunar.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Reseptör yoğunlukları veya desen geometrileri genelinde karşılaştırmalı analizler için hücre yuvarlanma hızı ve kenar takip uzunluğuna dair nicel veriler üretir.
- Operasyonel Değer: Tekrarlanabilir adezyon deneyleri için mikrotemas baskılama ve akış odası entegrasyonu aracılığıyla substrat hazırlığını standartlaştırır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Reseptör desen tasarımını gözlemlenebilir hücre yörüngesi sonuçlarıyla ilişkilendirerek, adezyon tabanlı ayırma stratejilerinin mekanistik risklerinin azaltılmasını destekler.
- Operasyonel Değer: Yuvarlanma davranışına dayalı hücre fenotiplerinin taranmasına olanak tanır; bu özellik, preklinik modellerdeki alt popülasyonların zenginleştirilmesi için faydalıdır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, özellikle akış altında adhezyonun fonksiyonel bir okuma olduğu hedefler için, assay geliştirme ve preklinik araç oluşturmaya bilgi sağlamak amacıyla erken keşif aşamasına uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Kayma akışındaki reseptör-ligand etkileşimlerinin hipotez testlerini kolaylaştırarak hücre yuvarlanmasına yönelik mekanistik katkıları netleştirir.
- Tarama: Hücre hatlarının veya reseptör modülatörlerinin karşılaştırılmasına olanak tanıyan standartlaştırılmış, kantitatif adezyon metrikleri sunar.
- Analitikler: Kenar izleme uzunluğu ve yuvarlanma hızı dağılımlarını çıktı olarak vererek koşul karşılaştırmaları için istatistiksel temel sağlar.
- Translasyonel Araştırma: In vitro yuvarlanma dinamiklerini, preklinik örnek işleme için etiketsiz hücre ayırma cihazlarındaki potansiyel fayda ile ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla hedef ve hücre tipi genelinde adezyon aracılı hücre davranışını değerlendirmek için yeniden kullanılabilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Kontrollü kayma altında yörünge parametrelerini nicelleştirerek, adezyon tabanlı ayırma mekanizmalarındaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Standardize edilmiş mikrotemas basımı, reseptör geri doldurma ve akış odası kurulumu aracılığıyla tekrarlanabilirliği sağlar.
- Stratejik Değer: Reseptör desenlerinin erken aşama fonksiyonel doğrulamasını sağlayarak, cihaz geliştirmedeki geç aşama biyolojik risklerini azaltır.
- Portföy Etkisi: Desen performansı hakkında ampirik veriler sağlayarak, mikroakışkan ayırma teknolojileri için git/gitme (go/no-go) kararlarını destekler.
Uygulama Hususları
- Mikrotemas baskılama, yüzey kimyası ve mikroakışkan akış kontrolü konularında uzmanlık gerektirir.
- Ters aydınlık alan mikroskobuna, yüksek hızlı kameraya ve MATLAB tabanlı partikül takip araçlarına erişime bağımlıdır.
- Çok merkezli tekrarlanabilirlik için alt tabaka üretimi ve akış koşulları raporlamasının ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Alternatif hücre tiplerine adaptasyon, ligand-reseptör çiftlerinin doğrulanmasını ve kayma gerilmesi parametrelerinin optimizasyonunu gerektirir.
- Hücre-kenar etkileşimlerinin geçici doğasıyla sınırlıdır; bu durum tam yörünge rekonstrüksiyonunu kısıtlar ve segmentli analiz yapılmasını zorunlu kılar.
