Name: Bağışıklık Eksik Fare Kuruluş ve İnsan Retinoblastom Tümörler yayılımı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Öğrenin, bağışıklık eksik farelerde insan retinoblastom tümörlerini yaymak için göz içi enjeksiyon tekniğini. Bu yöntem, tümör biyolojisi ve tedavi yanıtlarını incelemek için değerli bir ortotopik model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Araştırma ve Retina Araştırma Vakfı Clayton Vakfı tarafından bu proje için finansman sağlanmıştır.

1. Retinoblastom tumorspheres hazırlanması <ol><li> TC Sağlık Bakanlığı onaylı protokol kapsamında retinoblastom tümör örnek alın. </li><li> Taze tanımlanmış kök hücre ortamı hazırlayın (Neurobasal-medya, 1X B-27 takviyesi eksi A vitamini, 1X elzem olmayan bir amino asit çözeltisi, 1X L-glutamin, 20 ng / ml EGF, 10 ng / ml bFGF). </li><li> Steril bir, dokuda bir çapraz kesim tekniği kullanarak bir neşter kültür-tedavi 6-plaka ile tümör dokusu mekanik parçalara ayırma. Hemen doku tanımlanmış kök hücre medya 100 mcL ekleyin ve hafifçe neşter kullanılarak kıyılmış doku yayıldı. Iyi tanımlanmış kök hücre medya 5 ml ekleyin. </li><li> 37 ° ° C'de,% 5 ile nemlendirilmiş bir inkübatör CO 2 ve günlük olarak kontrol edin . Bazı tumorspheres 2-4 gün içerisinde giderek artan sayıda, hemen bozulur tümör dokusu ortaya çıkmalıdır. </li><li> Haftalık 300xg az 5 dakika santrifüj tumorspheres, taze hazırlanmış tanımlanmış kök hücre medyada tekrar süspansiyon ve pipetlemeyin yukarı ve aşağı 10 kat daha büyük, merkezi nekrotik küreler bozabilir ve yeni, sağlıklı bir küre oluşturacak şekilde izin vermek. </li></ol> 2. Tümör hücrelerinin enjeksiyon için hazırlanması <ol><li> Eğer 15-ml konik bir tüp içine yavaşça kültürlü tumorspheres, pipetlemeyin küreler enjekte. Serolojik pipetlemeyin küreler bozmaya 10-15 kez yavaşça pipetlemeyin yukarı ve aşağı. </li><li> Hücreleri saymak bir hemasitometre ve kısım enjeksiyon başına en az 50.000 hücreleri kullanarak yeni bir tüp içine enjekte edilir. Kullanılabilir hücre sayısı mümkün olduğunca çok sayıda enjeksiyonlar için hazırlayın. </li><li> 5 dakika 300xg santrifüjleyin. 5 ml PBS dikkatlice supernatant ve tekrar süspansiyon aspirat. Santrifüj ve aspirasyon tekrarlayın ve enjeksiyon başına 10 mcL PBS içinde tekrar süspansiyon haline getirin. </li></ol> 3. Hayvanların hazırlanması <ol><li> Bir insülin enjektörü kullanarak, kemirgen anestezi kokteyl intraperitoneal (ketamin 37.6 mg / ml, ksilizin 1.92 mg / ml, acepromazine 0.38 mg / ml) gram vücut ağırlığı başına 1 mcL (GBW). Yönetmek Sedasyon olmak için hayvan için 5 dakika bekleyin. Kalp atışı olup olmadığını kontrol edin ve hayvan ısıtılmış bir yastık yerleştirin. Kurtarma kadar her zaman ısıtılmış bir pad üzerinde hayvanları koruyun. </li><li> Sedasyon sonra, sağ göz proparacaine HCl 1 damla yönetmek. Isıtmalı pad üzerinde hayvan değiştirin ve 1 dakika bekleyin. </li><li> Sağ göz HCl fenilefrin 1 damla yönetin. Isıtılmış pad üzerinde hayvan değiştirin ve 5 dakika bekleyin. Pupilla dilatasyonu oluştu varsa, 1 damla yeniden yönetmek ve başka bir 5 dakika bekleyin. </li><li> &gt; 30 dakika sonrası sedasyon oluşabilir, hareket ya da seğirmesi işaretleri, hayvan izleyin. Hareketin ilk işaretleri, 1 mcL / GBW ketamin HCl (10 mg / ml PBS içinde seyreltilmiş) yönetmek ve 5 dakika bekleyin. </li></ol> 4. Tümör hücrelerinin enjeksiyonu <ol><li> Yukarı bakacak şekilde sağ göz ve baş gazlı bez üzerine oturtulmuş ve mikroskop ile gözlenen sağ göz fundus (öğrenci şu anda dilate edilmelidir) kırmızı bir refleks elde etmek için merkezli, kendi tarafında mikroskop altında anestezi hayvan koyun . </li><li> Hafifçe göz kapaklarınızın üzerinde iki parmak ile aynı anda aşağı iterek ve prosedürün geri kalanı için sürekli bu konumda tutun, sağ kürenin Prop. </li><li> Delmek pars plana alan kornea limbus bitişik konjonktiva ve sklera (Şekil 1) ve vitreus boşluğuna koroid yanal, Luer-lock şırınga bağlı steril bir dünya kullanarak 30-gauge iğne. Açılış iğne çıkarın. </li><li> Hamilton iğnesi bir alkollü bez ile sterilize edin. Hamilton enjektöre hücre süspansiyonu çizin ve iğne iğne merceğin arkasında retinanın yakınındaki vitreus mikroskop aracılığıyla görülünceye kadar ağzına takın. Bu pozisyonda sürekli iğne tutarken ikinci bir kişinin yardımı ile, piston yavaşça bastırın. İğneyi çıkarın. Gerekirse, açılışından itibaren herhangi bir sıvı absorbe etmek için bir pamuklu bir bez kullanın. </li><li> Fare göz kapaklarını kapatmak için göz kapaklarının basıncı yavaşça bırakın. </li><li> Her bir göze 1 damla Hipromellöz Yönetici ve kurtarma için ısıtmalı yastık hayvan dönmek. </li></ol> 5. Enjekte edilen farelerin tümörler hasadı ve İzlenmesi <ol><li> Günlük, genellikle 2-4 hafta enjeksiyon sonrası belirgin hale gelir enjekte leukocoria için göz (beyaz papiller refleks) ve / veya perioküler distansiyon inceleyin. </li><li> Tümör büyümesi hayvan kurumsal kurallarına göre, euthanize algılanır. </li><li> Göz ve tümör göz kapaklarının kaplı ise, palpebral fissür dik iki kesiler yapmak ve cilt flep kaldırma neşter kullanabilirsiniz. </li><li> Stereoskopik mikroskop kullanarak görüntüleme altında, kornea ve lens çıkarmadan, limbus dairesel kesi yapmak ve dikkatle twee kullanarak diğer dokularda tümör kitlesi toplu teşrihzers. Steril RPMI-1640 medya tümör yerleştirin. </li><li> Açık küre, yavaş yavaş prizden çekmek için cımbız kullanın. Ekli bir optik sinir tümör invazyonu görüntülenmiştir böylece sağlamak için, sinir maruz kadar dünyanın çekin ve mümkün olduğunca uzun süre sinir kesmek için makas kullanın. Histolojik muayene için düzenli olarak işlenmesi için% 10 formalin yerleştirin. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar: Retinoblastom tumorspheres hemen tümör kitlesi kurtuldu olarak ayrıştırılmış doku görünmeye başlayacaktır. 2-4 gün içinde, daha tumorspheres formu ve boyutu artacak başlayacak. Küreler, düzenli ve agrega (Şekil 2) çevreleyen iyi tanımlanmış, ikincil membran sergilemek eğilimindedir. Hayvan genellikle dünya ve tümör büyüdükçe enjeksiyonu 5-8 hafta sonra çevre dokulara distansiyon genişleme, enjeksiyon sonrası (Şekil 3b) 4 hafta içinde leukocoria ile sunar (Şekil 3c). <img src="/files/ftp_upload/2644/2644fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 protokol başvurulan özellikleri vurgulayarak fare göz kesit diyagramı. <img src="/files/ftp_upload/2644/2644fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 a) 4x in vitro insan retinoblastom hücrelerinin Kültür görüntülü ve b) objektif 10x büyütme. Retinoblastom primer tümör hücrelerinin düzenli bir sfero şekil ve net bir dış zar ile tumorspheres üretir. Ölçek bar a) 500 mikron temsil eder, b) 200 mikron . <img src="/files/ftp_upload/2644/2644fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Göz Rag2 - / -, b) normal özellikleri gösteren fare) vitreusa bir tümör kitlesi göstergesidir leukocoria, ve c) büyük bir tümör kitlesi dünya ilişkili perioküler distansiyon, göz içi kanama ile doldurma.

<ol><li>Chèvez-Barrios, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+and+Nonmetastatic+Models+of+Retinoblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Metastatic and Nonmetastatic Models of Retinoblastoma.</a> Am. J. Pathol. 157, 1405-1412 (2000).</li>
<li>Suber, M. L., Hurwitz, M. Y., Chèvez-Barrios, P., Hurwitz, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+consequences+of+intraocular+administration+of+modified+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Immune consequences of intraocular administration of modified adenoviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 12, 833-838 (2001).</li>
<li>Mallam, J. N., Hurwitz, M. Y., Mahoney, T., Chèvez-Barrios, P., Hurwitz, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Gene+Transfer+into+Retinal+Cells+Using+Adenoviral+Vectors%3A+Dependence+on+Receptor+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Efficient Gene Transfer into Retinal Cells Using Adenoviral Vectors: Dependence on Receptor Expression.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45, 1680-1687 (2004).</li>
</ol>

Baylor Tıp IACUC Komitesi tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.

Burada açıklanan teknik yayılımı retinoblastom tümörleri, göz içi, intravitreal ortamda kolaylaştırır. Göziçi enjeksiyon tekniği retinoblastom kaynaklı hücre hatları 1 yanı sıra göz içi gen tedavisi 2,3 için viral vektörler sunmak için tümörler oluşturmak için geçmişte kullanılan olmuştur. Bu teknik, birincil tümör ve enjeksiyon tumorspheres xenograft tümörlerinin yanı sıra seri yayılma hücrelerinin doğrudan enjeksiyon yoluyla insan retinoblastom tümör başarıyla üretmek için kullanılmıştır. Tümör oluşumu (genellikle leukocoria) Görünür bir kanıt genellikle ilk yörünge çevreleyen dünya ve / veya dokuların göz içi kanama, şişme sonra 5-8 hafta içinde gelişir, 4 hafta içinde olduğunu kaydetti. Enjekte edilen farelerin bir azınlık, göz kapaklarının sürekli kapatılması önde gelen enjekte göz yaralayabilir. Bu durumlarda, distansiyon tümör oluşumu tek bir işaretidir. Kurulan xenograft tümörlerin yayılması son derece başarılı olmasına rağmen fare xenograft tümörlerin kurulması, tüm insan retinoblastom tümörlerinin başarılı olmamıştır. Bu gözlem, invazivlik düzeyi ve farklılaşma ya da başka bir bilinmeyen faktör olarak primer tümörün bazı özellikleri, bu tümörlerin fare oküler ortamda devam yeteneğini etkileyen olabileceğini düşündürmektedir. Bir insan retinoblastom tümör elde edilebilir doku miktarı oldukça küçük ve sınırlı bir yaşam süresi, solid tümör histolojisi kaybı ve hücresel fenotip değişiklikler gibi in vitro kültür insan retinoblastom hücrelerinin yeteneği üzerinde önemli sınırlamalar vardır. Bu protokol, insan tümör yaymak ve insan hastalığının bir fare modeli kurmak için nispeten basit bir yol sağlar. Bu in vitro ve in vivo deneyler retinoblastom ve hastanın tümör dışında uzun bakım biyoloji daha da sağlar .

<table border="1"><tbody><tr><th> Isim </th><th> Şirket </th><th> Katalog # </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> HCl 2.5% Fenilefrin </td><td> Bausch &amp; Lomb </td><td> 053-11 </td><td> Oftalmik solüsyon </td></tr><tr><td> 30-ga İğne </td><td> BD </td><td> 305128 </td><td> Düzenli konik </td></tr><tr><td> 10-ml Luer-Lock Şırınga </td><td> BD </td><td> 309604 </td><td></td></tr><tr><td> 3/10-cc İnsülin Şırınga </td><td> BD </td><td> 328431 </td><td></td></tr><tr><td> Alkol bezlerden </td><td> BD </td><td> 326895 </td><td></td></tr><tr><td> 6-Peki Tabak, Doku Kültürü Boyalı </td><td> BD </td><td> 353046 </td><td></td></tr><tr><td> Proparacaine HCl% 0.5 </td><td> Butler AHS </td><td> 017239 </td><td> Oftalmik solüsyon </td></tr><tr><td> Ketamin HCl 100mg/mL </td><td> Fort Dodge </td><td> 4402A </td><td></td></tr><tr><td> 10-mcL Hamilton Şırınga </td><td> Hamilton Şirket </td><td> 7648-01 </td><td></td></tr><tr><td> 32-ga Hamilton İğne </td><td> Hamilton Şirket </td><td> 7803-04 </td><td> Özel uzunluğu - 0.5 &quot; </td></tr><tr><td> Neurobasal-Ortam </td><td> Invitrogen </td><td> 10888-022 </td><td></td></tr><tr><td> B-27 Ek Eksi A vitamini, 50X </td><td> Invitrogen </td><td> 12587-010 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI-1640 Medya </td><td> Mediatech </td><td> 10-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Sigara esansiyel amino asit Çözüm, 100X </td><td> Mediatech </td><td> 25-025-CI </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamine, 100X </td><td> Mediatech </td><td> 25-005-CI </td><td></td></tr><tr><td> Tek kullanımlık # 11 bistüri </td><td> Miltex </td><td> 4-411 </td><td></td></tr><tr><td> Kemirgen Anestezi Combo </td><td> n / a </td><td> n / a </td><td> In-house eczane formülasyonu (ketamin 37.6 mg / ml, ksilizin 1.92 mg / ml, acepromazine 0.38 mg / ml) </td></tr><tr><td> Rekombinant İnsan Epidermal Büyüme Faktörü (EGF) </td><td> STEMCELL Teknolojileri </td><td> 02633 </td><td> 10 mcg / mL stok çözelti az sulandırın </td></tr><tr><td> Rekombinant İnsan Basic Fibroblast Büyüme Faktörü (bFGF) </td><td> STEMCELL Teknolojileri </td><td> 02634 </td><td> 10 mcg / mL stok çözelti az sulandırın </td></tr><tr><td> OMS-75 Operasyonu Mikroskop </td><td> Topcon Medikal Sistemleri </td><td> OMS-75 </td><td> Bu model kesildikten </td></tr><tr><td> % 10 formalin </td><td> VWR </td><td> 95042-908 </td><td></td></tr></tbody></table>

bağışıklık eksik fare kuruluş ve İnsan retinoblastom tümörler yayılımı

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Tanımlanmış kök hücre medya kültür retinoblastom tümör hücreleri yalnızca sınırlı bir süre için yetiştirilen ve korunabilir birincil tumorspheres yol açmaktadır. Bu kültür tumorspheres, orijinal tümörlere kıyasla, belirgin bir şekilde farklı hücre fenotipleri gösterebilir. Kültür hücreleri yeni tümörler oluşturma yeteneğine sahip olduğunu gösteri bu kültür hücreleri modeli orijinal tümör biyolojisi sağlamak için önemlidir. / - Bağışıklık eksikliği olan farelere Burada Rag2 kullanarak in vivo insan retinoblastom tümör propaganda için bir protokol mevcut. Kültüre insan retinoblastom tumorspheres düşük geçit veya fare gözlerde vitreus boşluğuna doğrudan enjekte taze hasat insan retinoblastom tümörler elde edilen hücreler, 2-4 hafta içinde tümörleri oluşturur. Bu tümörler hasat ve ya daha ileri in vivo fare gözlerinin içine geçişli ya da in vitro tumorspheres olarak yetiştirilen olabilir . Yayılma, böylece daha fazla deneyler için insan retinoblastom dokusu sürekli bir kaynak oluşturulması en az üç geçişleri başarıyla yapılmıştır. Wesley S. Bond ve Lalita Wadhwa co-ilk yazarın.

Insan retinoblastom farelerde tümörlerin yaymak için bir yöntem açıklanmıştır. Tümör hücreleri bağışıklık eksikliği olan farelerde gözlerinin içine doğrudan enjekte edilir. İkincil tümörlerin başarıyla doğrudan insan tümörleri ve kültürlü tumorspheres hasat hücreler kullanılarak kurulmuştur.

Bağışıklık Eksik Fare Kuruluş ve İnsan Retinoblastom Tümörler yayılımı

Retinoblastoma tümör hücrelerinin tanımlı kök hücre ortamlarında kültüre edilmesi, yalnızca sınırlı bir süre boyunca büyütülebilen ve sürdürülebilen primer tümörsferlerin oluşmasını sağlar...

Bu prosedürün genel amacı, immunodefisyent bir farede ortotopik bir retinoblastom tümörü oluşturarak, sonraki deneyler için uygun bir model sağlamak ve tümörün yayılmasına olanak tanımaktır. Bu işlem, öncelikle primer veya ksenogreft bir tümörden hücrelerin toplanması ve tümör sferlerinin in vitro kültürlenmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, kültüre edilmiş tümör hücrelerinin rag two null immunodefisyent bir farenin gözündeki vitreus boşluğuna veya subretinal alana enjekte edilmesidir.Prosedürün üçüncü adımı, enjekte edilen farelerin Leukokoria GLO büyümesi ve perioküler distansiyon dahil olmak üzere tümör oluşumu belirtileri açısından izlenmesidir. Prosedürün son adımı ise ksenogreft tümörün hasat edilmesidir. Nihayetinde, histopatolojik inceleme yoluyla fare gözünde ortotopik tümör oluşumunu gösteren sonuçlar elde edilebilir.İntraoküler enjeksiyonun hassas doğası nedeniyle, bu tekniğin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir. Çevre yapılar, uygun şekilde tanımlanmadığı takdirde kolayca zarar görebilir. Genellikle bu yönteme yeni başlayan kişiler, tümör hücrelerini doğru konuma ulaştırmak için vitreus boşluğuna yapılan enjeksiyonun yüksek hassasiyet gerektirmesi nedeniyle zorluk yaşarlar.Bu yöntem, retinoblastom tümörlerinin biyolojisine dair içgörü sağlayabilir. Ayrıca, gen aktarımı için vektörlerin göz içi uygulaması gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Öncelikle, steril, doku kültürü işleminden geçmiş 10 santimetrelik bir kapta taze tanımlanmış kök hücre besiyeri hazırlayın.Retinoblastoma tümör dokusunu yerleştirin ve kurumayı önleyecek kadar sıvı bırakarak fazla taşıma medyumunu aspire edin; dokuyu bir bistüri ile çapraz kesim tekniği kullanarak mekanik olarak ayrıştırın, ardından dokuya hemen 100 µL tanımlanmış kök hücre medyumu ekleyin ve bistüri yardımıyla parçalanmış dokuyu nazikçe yayın. Sonrasında, kaba 10 mL tanımlanmış kök hücre medyumu ekleyin. Plakayı nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C sıcaklıkta ve %5 CO2 ortamında inkübe edin; bulanıklık ve pH değişiklikleri açısından günlük olarak kontrol edin.Yeterli yeni büyüme gözlemlendiğinde, parçalanmış tümör dokusundan neredeyse anında bazı tümör küreleri oluşmalı ve bunların sayısı yedi ila 10 gün boyunca artmalıdır. Bundan sonra haftalık olarak, tümör kürelerini 300 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Küreleri taze hazırlanmış tanımlı kök hücre besiyerinde yeniden süspande edin ve merkezî nekrotik yapıya sahip daha büyük küreleri parçalamak ve yeni, sağlıklı kürelerin oluşumuna izin vermek için pipetle 10 kez yukarı-aşağı çekerek karıştırın.Kültürlenmiş tümör kürelerini enjeksiyona hazırlamak için küreleri nazikçe 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Küreleri dağıtmak için pipetle 10 ila 15 kez nazikçe yukarı ve aşağı çekme işlemi uygulayın. Canlı olmayan hücreleri ayırt etmek için tripan mavisi kullanarak, enjekte edilecek hücreleri bir hemositometre ile sayın.Mevcut hücre sayısına ve deneysel gereksinimlere bağlı olarak ihtiyaç duyulan sayıda enjeksiyon hazırlayın. Ardından, tüpleri 300 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice aspire edin ve hücreleri beş mililitre içerisinde yeniden süspande edin.PBS ile santrifüj ve aspirasyon adımlarını bir kez daha tekrarlayın. Son olarak, hücreleri enjeksiyon başına 10 µL steril PBS içinde süspande edin. Hayvanları işlem için hazırlamak adına, anestezi uygulanmış bir fareyi ısıtıcı pedin üzerine yerleştirerek başlayın.Vücut sıcaklığını korumak için, sağ göze bir damla propano HCL damlatın ve bir dakika bekleyin. Ardından, sağ göze bir damla fenilefrin HCL damlatın ve beş dakika bekleyin. Pupil dilatasyonu gerçekleşmediyse, bir damla daha damlatın ve beş dakika daha bekleyin.Anestezi altındaki hayvanı mikroskobun altında yan yatırın ve başını gazlı bez üzerine yerleştirin. Sağ taraf yukarı bakacak şekilde konumlandırın ve sağ gözden kırmızı refleks elde etmek için gözü ortalayın. Fundus mikroskopla gözlemlenirken, göz kapaklarına aynı anda iki parmakla nazikçe aşağı doğru bastırarak sağ göz küresini destekleyin.Prosedürün geri kalanı boyunca bu pozisyonu sabit tutun. Lure-lock şırıngaya takılı steril 30 gauge iğne kullanarak; kornea limbüsüne komşu pars plana bölgesinden konjunktiva ve sklera üzerinden lateral olarak küreye girin ve koroidi geçerek vitreus boşluğuna ulaşın.İğneyi açıklıktan çıkarın. Bir Hamilton iğnesini alkollü swap ile sterilize edin. Hücre süspansiyonunu Hamilton şırıngasına çekin ve iğne, mikroskop aracılığıyla lensin arkasındaki vitreus içinde, retinanın yakınında görülene kadar iğneyi açıklıktan içeri yerleştirin.İkinci bir kişinin yardımıyla, pistonu bastırırken iğneyi bu konumda sabit tutun ve iğneyi yavaşça çıkarın. Gerekiyorsa, açıklıktaki kanı veya sıvıyı emmek için bir pamuklu çubuk kullanın. Fare göz kapaklarını kapatmak için basıncı nazikçe serbest bırakın.Hayvanı iyileşmesi için ısıtıcı bir pedin üzerine geri koyun. Enjeksiyondan sonraki her gün, gözü lökokori açısından inceleyin. Bu durum genellikle enjeksiyondan iki ila dört hafta sonra belirginleşir.Tümör büyümesi tespit edildiğinde, hayvanı kurumsal kılavuzlara uygun olarak ötenazi edin. Stereoskopik mikroskop altında, limbus bölgesinde çevresel bir insizyon yaparak korneayı ve lensi çıkarın ve tümör kitlesinin ana gövdesini cımbız kullanarak diğer dokulardan dikkatlice ayırın. Tümörü steril RPMI 1640 içerisine yerleştirin.Medya, optik sinir açığa çıkana kadar açık göz küresini soketten yavaşça çekmek için cımbız kullanır. Göz küresi soketten nazikçe kaldırılırken, tümörün optik sinir invazyonunu değerlendirmek amacıyla, sinirin mümkün olduğunca büyük bir kısmı göz küresine bağlı kalacak şekilde optik siniri kesmek için makas kullanılır; ardından histolojik inceleme için %10 nötral tamponlu formalin içine yerleştirilir.İşte kültüre edilmiş tümör sferlerine bir örnek. Üç gün sonra, dağılmış tümör dokusu arasında sadece birkaç tümör sferi belirgindir. Ancak, 10. günde tümör sferlerinin sayısı artmıştır.Enjeksiyondan birkaç hafta sonra, sağ üstteki ekte gösterildiği gibi küreler belirgin bir dış membrana sahiptir. Enjekte edilen farede leukokori görülmektedir; beyaz pupilla refleksi, gözün arka kısmında yer alan tümörden kaynaklanmaktadır. h ve d ile boyanmış göz kesitlerinin bu örneklerinde, solda vitreus boşluğunu dolduran ksenogreft retinoblastom tümörüne ve sağdaki mock enjekte edilen gözde böyle bir büyümenin yokluğuna dikkat edin.Bu videoyu izledikten sonra, kültürlenmiş tümör hücrelerinin nasıl hazırlanacağı, bir fare gözüne intraoküler enjeksiyonun nasıl doğru şekilde uygulanacağı ve tümör progresyonunun nasıl takip edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Uzmanlaşıldığında, enjeksiyon tekniği hayvan başına yaklaşık 30 dakikada tamamlanabilir. Doğru şekilde yapıldığında, tümör hücrelerinin tehlikeli olabileceğini unutmayın ve bu prosedürü gerçekleştirirken laboratuvar önlüğü ve maske dahil olmak üzere uygun KKD kullanımı gibi önlemler her zaman alınmalıdır. İnsan kanser hücreleri her zaman BSL-2 koşulları altında manipüle edilmelidir.

establishment-propagation-human-retinoblastoma-tumors-immune

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu protokol, fare medulloblastom doku izolasyon ve ayrılma açıklar ve ikincil medulloblastom başlatmak için immün sistemi baskılanmış alıcı farelere tümör hücrelerinin sonraki allografting.

Medulloblastom Hücre bağışıklık Fare İntrakranial Ortotopik Allografting

Bir fare göz diseksiyon resmi bir gösteri, retinal pigment epitel bir bütün montaj.

Retina pigment epiteli Tüm Mount Fare Göz Diseksiyon

Hümanize fareler kullanılarak tümör spesifik T hücrelerin oluşturulması ve karakterizasyonu burada tanımlanmıştır. İnsan timik doku ve genetiği değiştirilmiş insan hematopoietik kök hücrelerin bağışıklığı baskılanmış farelere nakledilmektedir. Anti-tümör bağışıklık yanıtı in vivo incelenmesi için izin veren bir mühendislik insan bağışıklık sisteminin sulandırma ile sonuçlanır.

Bir Kök Hücre tabanlı Gen Terapisi Tümör Modeli olarak BLT Insanlaşmış Fare Kullanma

Burada, orthotopic insan birincil beyin tümörü taşıyan immünyetmezligi farelerde hazırlık ve allojenik insan lenfosit stereotaksik yönetim için bir iletişim kuralı mevcut. Bu çalışmada bir kanıtı-of-concept fizibilite ve hücresel immunotherapies intrabrain teslim antitümör etkinliği için sağlar.

Orthotopic insan Glioblastoma Multiforme Xenografts fare modelleri sitotoksik bağışıklık hücrelerinin stereotaksik evlat edinen Transfer

Ortotopik insan karaciğeri metastatik uveal melanom ksenogreft fare modelleri, hasta kaynaklı tümör öbek ve kültürlü insan uveal melanom hücre hatları ile iğne enjeksiyon teknikleri ile cerrahi ortotopik implantasyon teknikleri kullanılarak oluşturulmuştur.

İmmünficient Farelerde Karaciğer Ortotopik İnsan Uveal Melanom Xenograft Platformu Üretimi

Burada insanlaşmış farelerde HIV enfeksiyonu dinamikleri incelenmesi için üç deneysel yaklaşımlar açıklanmıştır. İlk ivedi kronik enfeksiyon olaylarının incelenmesine izin vererken, ikincisi primer enfeksiyon veya viral reaktivasyon sonrası akut olayların incelenmesine izin verir.

Humanized Immunoficient Mouse Modellerinde Kronik, Akut ve Yeniden Aktive HIV Enfeksiyonu

İnsan embriyonik kök hücrelerinde (hESC) bialelik RB1 mutasyonlarını tanıtarak insan retinoblastomu (RB) üretmek için bir yöntem tanımladık. RB hücre hatları, bir tabakta izole RB kullanılarak başarılı bir şekilde kültürlenebilir.

İnsan Retinoblastomunu In Vitro Yeniden İnşa Etmek

Bu protokol, immüno-onkoloji çalışmaları için insan bağışıklık sistemi (HIS) farelerinin neslini özetlemektedir. Bu modelde implante edilen insan tümörleri üzerinde insan immünoterapötiklerini test etmek için bu modelin kullanımındaki talimatlar ve hususlar, insan bağışıklık sisteminin tümöre tepkisini karakterize etmeye vurgu yapılarak sunulmuştur.

İnsan Tümörleri Taşıyan İnsanlaştırılmış Bir Fare Modelinde Kanser İmmünoterapötiklerinin Test Edilmesi

Mevcut protokol, insan osteosarkom dokusu kullanılarak hasta kaynaklı bir ksenogreft (PDX) fare modeli oluşturma yöntemini açıklamaktadır.

İnsan Osteosarkom Dokuları ile Hasta Kaynaklı Ksenogreft Fare Modelinin Kurulması

Son birkaç yılda, yeni nesil endoskoplar kemirgen kolit ve kolorektal tümörlerin değerlendirilmesinde önemli bir tanı araştırma yardımcıları olarak ortaya çıkmıştır. Bu farelerde enflamasyonun ve kolorektal tümörleri endoskopik değerlendirme, hem de kolit ve kolorektal tümörleri endoskopik şiddetini belge ondalık tanımlayıcıları kullanan yeni bir skorlama sistemi için bu tarifnamede detaylı bir protokol mevcut.

Bir Geçerliliği Endoskopik Puanlama Sisteminin Kullanılması Kolit ve Kolorektal Tümörlerin Şiddetini Değerlendirmek için Farelerde esnek Kolonoskopi

Öğrenin, bağışıklık eksik farelerde insan retinoblastom tümörlerini yaymak için göz içi enjeksiyon tekniğini. Bu yöntem, tümör biyolojisi ve tedavi yanıtlarını incelemek için değerli bir ortotopik model sunar.

Bağışıklık Eksik Fare Kuruluş ve İnsan Retinoblastom Tümörler yayılımı

Daha fazla video keşfet