Larvaların ve Yetişkin Enhancer-trap Flippase İfade Haritalama ve Uygulama Drosophila MSS

Aşağıdaki deneyin genel amacı, GAL 80 dönüştürme araçları ile dokuya özgü lipaz kullanımı yoluyla GAL dört ekspresyonunu rafine etmektir. Bu, bir arttırıcı tuzak Philippe transgenik sinek hatları koleksiyonu oluşturularak ve her satırda lipazın CNS ekspresyon paterni belirlenerek elde edilir. Bir GFP muhabiri kullanarak, İMMÜNOKİMYA ve GFP raporları, GL'yi nöronal ekspresyondan ayırt edebilir, ilgi alanlarındaki GAL dört ekspresyonu, dölde bir GAL 80 dönüştürme aracı içeren sinekler boyunca ET çevirme çizgileri.

Klonal analiz, gözde olduğu gibi GAL dört ekspresyonunun rafine edilmesini analiz etmek için kullanılabilir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, GAL 80 dönüştürme araçlarıyla birlikte geliştirici parça oynatma tabanlı çizgilerin, sinek topluluğunda halihazırda mevcut olan hızlı bir GAL dört ittifak koleksiyonuyla kullanılabilmesidir. Ek olarak, bu kavram zebra balığı gibi diğer GALI dört UAS gelişmekte olan model organizmalara genişletilebilir.

Bu yöntem, davranışın altında yatan nöral devrelerin haritalanmasında temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu protokol, fotoreseptör hücrelerinin bir alt kümesinde flip bazın kullanımını gösterse de, kesişimsel yöntem, nöronal olmayan dokular da dahil olmak üzere diğer dokuların analizine uygulanabilir. Daha fazla arttırıcı tuzak olarak lipaz hatları karakterize edilir.

Gut dört US, sinek biyologları tarafından yaygın olarak kullanılan önemli bir tekniktir. Çoğu GAL dört satırının bir uyarısı, parmak yöntemlerini kullanarak beyin davranışı haritalaması için kullanılamayacak kadar geniş bir şekilde ifade edilmesidir. İlgilenilen tişörtlerde GAL dört ifadesine ince ayar yapmak mümkün değildir: GAL dört ifade çizgisinin ifadesini kısmen kısıtlamak için bir ET flip transgeni kullanmadan önce.

İlk olarak, geç aşamada gelişmekte olan lavda ET flip x iki transgenin ekspresyon modelini bilmek ve yetişkinlerde flip a'nın ifadesini görselleştirmek yararlıdır: CNS'de, ET t flip X ile ilgilenen iki transgen ile erkekler arasında bir çaprazlama oluşturun ve bakire dişiler, dölden et flip ifadesi için bir GFP muhabiri barındırır. Diseksiyon için dolaşan üçüncü instar F1 larvalarını toplayın. Bunları temiz bir S koruyucu kabına yerleştirin ve kalıntıları bir boya fırçasıyla temizleyin ve kabı bir kez PBS ile bir kez durulayın.

Şimdi çanağı bir kez buz gibi soğuk ile doldurun, bir lavın CNS'sine erişmek için larvaları uyuşturun, ağız kancasını bir çift forseps ile tutun. Kütikülü uzayan ön kürenin yanından tutun ve geri soyun. CNS, diğer bazı yapılarla birlikte ağız kancasına bağlı kalır.

Şimdi forseps ile, CNS'yi incelerken CNS'yi çevreleyen tüm fazla yapıları çıkarın. Bunları ayrı ayrı PBS ile doldurulmuş üç dünyalı bir Pyrex kabına aktarın. Tüm CNS'ler parçalara ayrıldıktan sonra, buz üzerinde 200 mikrolitre% 4 PFA'ya tamamen batırarak sabitleyin.

Bir CNS yüzerse, çevresindeki tüm dokudan tamamen temizlenmemiştir. Bu meydana gelirse, 15 dakika boyunca sabitledikten sonra CNS'yi fiksatife batırmak için bir çift forseps kullanın, dokuyu buz gibi soğuk PB S3 ile yıkayın ve ardından dokuyu buz gibi soğuk PBT'de üç kez daha yıkayın. Doku artık antikorlar tarafından görüntülenmeye veya etiketlenmeye veya daha sonra kullanılmak üzere dört santigrat derecede PBT'de saklanmaya hazırdır.

Diseksiyondan önce larvaların F1 yetişkinlerini toplamasını sağlamak için kullanılan aynı çaprazlamadan boyama. Kütikül yüzeyindeki balmumu çıkarmak için beş ila 10 sinek batırılır ve 30 saniye boyunca% 95 etanol soğutulur. Etanolü çıkarmak için, yetişkinleri üç kez buz gibi soğuk ile bir kez PBS yıkayın ve üçüncü yıkamadan sonra, bir yetişkini diseksiyona hazırlamak için bunlardan birini bir kez PBS ile doldurulmuş 35 milimetrelik bir sil koruyucu kabına aktarın.

Ventral tarafı yukarı gelecek şekilde yerleştirin ve karnın ortasına bir minyon pimi yerleştirin. Bacakları çıkarmak için forseps kullanarak diseksiyona başlayın. Ardından, başı diklere sabitleyerek ve aynı anda kütikülü gözün altından başın tepesine doğru soyarak baş kütikülünü çıkarın.

Keskinleştirilmiş forsepsleri dikkatlice kullanarak, beyni çevreleyen dokularınızı çıkarın, takip edin çünkü dokularınızı takip etmek güçlü otofloresansa sahiptir ve sabitleme sırasında beynin yüzmesini sağlar. Beyin, yetişkin CNS'nin sadece bir parçasıdır. Diğer kısım torakstaki ventral sinir kordonu veya VNC'dir ve ayrıca diseke edilmesi gerekir.

İlk olarak, sineği arka bacağın tabanına sabitleyerek ve torasik kütikülü boynun tabanına kadar nazikçe çekerek torasik kütikülü çıkarın. İkincisi, VNC'yi açığa çıkarmak için torasik kütikülün iki yarısını nazikçe yayın. Üçüncüsü, ikinci bacağın tabanını sabitleyerek ve karnı ilk karın karıştırma gecesinin yakınından çekerek karnı torakstan çıkarın.

Dördüncüsü, humerus bölgesini sabitleyerek ve VNC'yi çevreleyen dokuyu nazikçe yırtarak VNC'yi temizleyin. Servikal bağı çevreleyen bağ dokusu halkasını yırtın ve beyni toplarken fazla dokuyu çıkarmaya devam edin. Ve VNC onları armut olarak, buz üzerinde tutulan bir kez soğutulmuş PBS ile doldurulmuş dokuz dünya Pyrex tabağına aktarın.

Yetişkin dokuları sabitlemek için, 15 dakika boyunca buzda% 4 PFA'ya batırın. Banyoyu üç buz gibi PBS yıkama ve üç PBT yıkayıcı ile takip edin. Doku artık transgen ekspresyonunu doğru bir şekilde analiz etmek için antikorlar tarafından görüntülenmeye veya etiketlenmeye hazırdır.

Bir referans çerçevesi sağlamak için CNS'yi nöronal veya glial belirteçlerle etiketlemek yararlıdır, dokuyu ertesi gün nöronlara veya gliaya karşı antikorlarla gece boyunca dört santigrat derecede inkübe ederek başlayın. Preparasyonu PBT ile beş kez yıkayın ve floresan ikincil antikor ile oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. İnkübasyon bittiğinde antikorun foto-ağartılmasını önlemek için plakayı ve folyoyu sarın.

Preparasyonu PBS ile yıkayın ve preparatı bir slayta monte edin. Dokunun kapak kayması tarafından ezilmesini önlemek için bir OSHA plastik halka kullanın. Sinir sistemi artık bir floresan mikroskobu altında GFP ve LL ekspresyon paternleri için incelenmeye hazırdır.

Tipik olarak, çevirme ifadesi modelinin tekrarlanabilirliğini belirlemek için üç ila beş kopya incelenir. Çevirmedeki ifade modeli, çevirmedeki bir çizgi, GAL dört baskılayıcı GAL 80'in nasıl ifade edildiğini değiştirmek için diğer transgenlerle birlikte kullanılabilir. GAL 80 baskılayıcı ifadesini değiştirmek, değişiklik yapmak için etkili bir yöntemdir.

GAL dört ekspresyonunda, bir yöntem, GAL 80 ekspresyonunu transgen GAL 80 ekspresyonu ile dışarı çıkarmaktır, aksi takdirde göz boyunca göz dejenerasyonuna neden olan GAL dördünü inaktive eder. ET çevirme çizgisi hash 6 88 A, burada F1 soyundaki fotoreseptörlerin bir alt kümesinde GAL 80 dönüştürme aracının etkinliğini değerlendirmek, göz fenotipini ebeveyn suşlarının göz fenotipiyle karşılaştırmak için kullanılır. Herhangi bir göz deformitesi veya depigmentasyon görünümü, fotoreseptörlerde çevirme ifade paterninin mevcut olduğunu ve GAL 80 flipout'un başarılı olduğunu doğrular.

Yedekli olmayan ücretsiz bir strateji, aynı çevirme ilgi çizgisini kullanarak GAL 80 ifadesini çevirmektir. Bu strateji diğerine çok benzer, ancak şimdi F1 döllerindeki ID pigmentasyonu ve dejenerasyonu bastırılmıştır. X ikinci kapakta.

Fotoreseptörlerin eksprese edilmesi: Bir kez ustalaştıktan sonra, CNS'nin diseksiyonu, uygun şekilde yapılırsa yetişkinler için yaklaşık beş dakika ve larvalar için bir dakika içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, hem yetişkin hem de Libre C'yi çevreleyen trakea ve dokuyu çıkarmak için keskin forseps kullanmak önemlidir ve diseksiyon için sabitleyici serbest bir tabak kullanmak Ss.It önemlidir. Isı şoku çevirme şu anda rastgele klonlar oluşturmak için kullanılmaktadır.

Buna karşılık, geliştirici tuzak çevirme, kişinin tekrarlanabilir klonlar oluşturmasına izin vererek morfolojik ve davranışsal analizi kolaylaştırır. Parmak yönteminin bir başka gücü de, ek anan tuzağı, çevirme tabanlı çizgiler ve diğer gal çizgileri kullanılarak GAL dört ifade modelini daha da kısıtlayabilmesidir. Tübülin durdurma GAL 80 konfigürasyonunun bir zayıflığı, LAG four ve U-A-S-K-I-R gibi GA dört ve UAS efektörlerinin belirli kombinasyonlarının sinekleri öldürecekleri için uyumlu olmamasıdır.

Bu sorun, bir davranışın beklendiği gibi kısıtlayıcı sıcaklıklarda incelenmesine izin veren UAS Shiri Ts gibi koşullu bir UAS efektörü kullanılarak kolayca aşılabilir. Tüm arttırıcı tuzak lipaz çizgileri, yararlı olacak kadar yüksek lipaz seviyelerini ifade etmeyecektir. Bununla birlikte, burada açıklanan parmak tekniği, drosophila araştırmacılarının mozaik analizini geliştirme devreleri veya davranış için rafine etmeleri için yeni bir yaklaşım sağlar.