Manyetik Aktif Hücre Ayırma (LIMACS) kullanarak Lipid veziküllü aracılı Afinite Kromatografisi: Protein-lipit Etkileşim Analiz Roman Yöntemi

Bu deney, lipid bağlayan proteinleri tanımlamak ve tanımlanmış bir membran ortamındaki lipid-protein etkileşimini analiz etmek için tasarlanmıştır. Hücre homojenatındaki lipid sles proteinleri, fosfat serin ve seramidden yeni hazırlanmış lipid vezikülleri ile inkübe edilir. Ardından, lipid veziküllerine ilişkili proteinleri manyetik boncuklara sabitlemek için reaksiyon karışımına Xin V konjuge manyetik boncuklar eklenir. Son olarak, protein-lipid vezikülleri manyetik aktive edilmiş hücre ayırma yöntemiyle saflaştırılır.

Lipidle bağlanan protein sonuçlarını belirlemek için, MDCK hücrelerinde eksprese edilen endojen ve rekombinant atipik PKC ve spesifik bir seramid bağlama domaininin lyx saflaştırmasını göstermek amacıyla SDS-PAGE Western blotting kullanın. Bu yeni tekniğin ELISA veya yüzey plazmon rezonans spektroskopisi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, lipid-protein etkileşiminin membran benzeri bir ortamda gerçekleştirilmesi ve bağlanan proteinlerin saflaştırılıp analiz edilebilmesidir. Bu tekniğin doğurguları, fizyolojik lipid-protein etkileşiminin bozulduğu lipidlerle ilişkili hastalıkların tedavisi ve teşhisine kadar uzanmaktadır.

Bu hastalıkların bazılarında protein hedefleri henüz bilinmemekte olup belirlenmeleri gerekmektedir. Lipid tabanlı bir tedavi tasarlamak için, 100 µL sical tamponu içerisinde ekimolar miktarlarda fosfatidilserin ve C 16 seramidden oluşan kurutulmuş bir karışımdan hazırlanan lipid SLE'ler ile başlayın. 0,1 mM manganez klorür ile takviye edilmiş 300 µL sical tamponu ekledikten sonra bir saat boyunca sonikasyon uygulayın; örnekleri 4 °C'de 20 dakika boyunca 12.000 ×g'de santrifüjleyin ve ardından büyük lipid vezikül pelletini 100 µL sical tamponu içerisinde yeniden süspande edin. Manyetik ayırma sonrası SLE fraksiyonunun görüntülenmesini kolaylaştırmak için 1 nM vibrant cm DII floresan boya ekleyin ve 37 °C'de bir saat inkübe edin; santrifüjleme yoluyla vibrant cm dai ile boyanmış fosfatidilserin seramid SLE'lerden oluşan pembe bir pellet elde edin ve bunu 100 µL tris tamponu içerisinde yeniden süspande edin.

Ardından, deterjan içermeyen bir hücre lizatı hazırlamak için, proteaz ve fosfataz inhibitörleri içeren 10 millimolar tris, hidroklorür hipertonik tamponunun 300 microliters hacmindeki hücreleri sonikasyona tabi tutun ve santrifüjleyin. Membranöz kalıntıları uzaklaştırmak için, berrak hücre lizatını lipid fiziksel süspansiyonuna ekleyin ve karışımı dört derece Celsius sıcaklıkta iki saat boyunca inkübe edin. Hücre lizatları fosfataerini içeren endojen membranlar barındırabileceğinden, lizatın ek santrifüj adımlarıyla bu membranlardan arındırılması önerilir.

Reaksiyon karışımına 20 µL XNV bağlama tamponu ve XNV ile konjuge edilmiş manyetik boncuklar içeren 50 µL çözelti ekleyin; 4 °C'de bir saat boyunca inkübe edin ve üretici protokolünde önerilen şekilde manyetik aktive hücre seçimi işlemini gerçekleştirin. Ardından, bir antikor yarışma deneyinde lipidlerin varlığını ve miktarını belirlemek için, mikroplaka floresans okuyucu kullanarak akış yolu ve elüsyon fraksiyonlarındaki canlı CM DII floresansını izleyin. A PKC'nin seramid fosfo serin veziküllerine bağlanma reaksiyonunun özgüllüğünü doğrulamak için, 1 µg anti P KC Zeta tavşan poliklonal antikoru bir hücre lizatı ile 4 °C'de bir saat boyunca inkübe edin ve ardından lipid vezikülleri ile inkübasyona bırakın.

İn vitro bir lipid protein polarite kompleksinin yeniden oluşturulması için maksimum elüat içindeki seramid fosfat serin sles'e bağlanan proteinin SDS page ve immünoblot analizine devam edin; daha önce gösterildiği gibi canlı CM DII ile boyanmış fosfat serin seramid veziküllerinin pembe pelet hazırlığı ile başlayın, vezikülleri 100 µL tri tamponunda, 100 µM gamma S GTP, 1 mM GDP ve ilgili rekombinant proteinlerin bir kombinasyonu ile destekleyerek yeniden süspanse edin. Ardından reaksiyonu 4 °C'de üç saat boyunca inkübe edin. Sonrasında, 20 x stok çözeltideki X in V tamponundan 5 µL ve X in V konjuge manyetik boncuklardan 50 µL ekleyin.

Karışımı, 4 °C'de 30 dakika boyunca hafifçe çalkalayarak inkübe edin. Çöktürmeyi kolaylaştırmak için üretici protokolünde önerilen NX NV manyetik aktifleşmiş hücre ayırımına devam edin. Elüsyon fraksiyonunu 10 µg saf e albumin ile takviye edin.

Proteinleri weyl flue çöktürme yöntemiyle konsantre edin. Alt faz, zenginleştirilmiş vibrant cm dii içeren kloroform metanolden oluşur. Kahverengimsi ara faz ise manyetik boncukları ve çöktürülmüş proteini içerir.

Weyl flu reaksiyonunun organik kloroform metanol fazındaki canlı, pembe cm dii tespiti ile ellu lipid veziküllerini nicelleştirin. Örnekler arasındaki protein miktarlarını normalize etmek için eşit miktarlarda lipid vezikülü kullanın ve SDS page ile analiz edin. İmmunoblotlama.

Tam uzunluktaki PKC Zetta'nın C-terminal ucunun yeşil floresan proteine veya bir seramid bağlama alanına bağlı olduğu MDCK hücrelerinin deterjan içermeyen lizatı. PKC Zetta'nın C-terminal ucu fosfo-serin ile inkübe edilmiştir.

Seramid vezikülleri max kolonundan elüe edildikten sonra, proteinler immünoblot ile analiz edildi. Seramid bağlayan fragman C 20 Zeta, EGFP ve tam uzunluktaki P KC Zeta, lyx prosedürünün özgüllüğü ve etkinliğiyle uyumlu olarak max kolonunun elüsyonuyla geri kazanıldı. Fosfata ve Suriye seramid veziküllerine bağlanmayan negatif kontrol EGFP, elüsyonda saptanamadı.

Linx; SDS page, western blotting veya proteomik analiz gibi diğer yöntemlerle tamamlandığında, lipid bağlayan protein kompleksinde hangi proteinlerin bulunduğu gibi ek sorular yanıtlanabilir. LabX, geliştirilmesinin ardından, S tekil lipid araştırma alanındaki araştırmacıların nöral kök ve epitelyal hücrelerde seramidle indüklenen apoptozu ve hücre polaritesini incelemelerinin yolunu açmıştır.