Manyetik Aktif Hücre Ayırma (LIMACS) kullanarak Lipid veziküllü aracılı Afinite Kromatografisi: Protein-lipit Etkileşim Analiz Roman Yöntemi

Bu deney, lipid bağlayıcı proteinleri tanımlamak ve lipid sles'in tanımlanmış bir membran ortamında lipid protein etkileşimini analiz etmek için tasarlanmıştır, hücre homojenat proteinleri, fosfat, seine ve seramidden taze hazırlanmış lipid vezikülleri ile inkübe edilir. Reaksiyon karışımı daha sonra, lipid vezikülleri ile ilişkili proteini manyetik boncuklara tutturmak için bir Xin V konjuge manyetik boncuk ile desteklenir. Daha sonra protein lipid vezikülleri, manyetik aktive hücre sıralaması ile saflaştırılır.

Lipid bağlı proteinin gösterdiği sonuçları tanımlamak için, endojen ve rekombinant atipik PKC'nin liks saflaştırmasını ve MDCK hücrelerinde eksprese edilen spesifik bir seramid bağlanma alanını göstermek için SDS sayfası Western blotting'i kullanın. Bu yeni tekniğin Eliza veya plazma rezonans spektroskopisi benzeri yüzey bağlama gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, lipid protein etkileşiminin zar benzeri bir ortamda elde edilmesi ve bağlayıcı proteinlerin saflaştırılabilmesi ve analiz edilebilmesidir. Bu tekniğin sonuçları, lipitleri içeren hastalıkların tedavisine ve teşhisine kadar uzanır, çünkü bu hastalıklarda fizyolojik lipid protein etkileşimi bozulur.

Bu hastalıkların bazıları için, protein hedefleri bile bilinmemektedir ve tanımlanması gerekmektedir Lipid bazlı bir tedavi tasarlamak için, 100 mikrolitre sical tampon içinde kurutulmuş bir equimolar, fosfatidil seine ve C 16 seramid karışımından hazırlanan lipid sles ile başlayın. 0.1 milimolar manganez klorür ile desteklenmiş 300 mikrolitre iCal tamponu ekledikten sonra bir saat boyunca sonikat, numuneleri dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 12.000 G'de santrifüjleyin, daha sonra 100 mikrolitre sical tamponunda büyük lipid veziküllerinin peletini yeniden süspanse edin. Bir nanomolar canlı cm DII floresan boya ekleyin ve maksimum ayırmadan sonra SLE fraksiyonunun görselleştirilmesini kolaylaştırmak için bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin, pembe bir canlı cm dai lekeli fosfat peleti, santrifüjleme yoluyla bir Suriye seramid sles'i geri kazanın ve Resus 100 mikrolitre tris tamponunda harcar.

Daha sonra, 10 milimolar tris'lik 300 mikrolitre hipertonik tampon, proteaz ve fosfataz inhibitörleri ve santrifüj içeren hidrojen klorür içinde deterjan içermeyen bir hücre lizat sonikat hücresi hazırlamak için. Membranöz kalıntıları gidermek için, şimdi berrak hücre lizatını lipid fiziksel süspansiyonuna ekleyin ve karışımı dört santigrat derecede iki saat inkübe edin. Hücre lizatları fosfat aerin içeren endojen zarlar içerebileceğinden, lizatın bu zarlardan ek santrifüjleme adımları ile temizlenmesi önerilir.

Reaksiyon karışımını 20 mikrolitre bir XNV bağlayıcı tampon ve 50 mikrolitre manyetik boncuklar içeren bir çözelti ile dört santigrat derecede bir saat boyunca bir XNV inkübe edilmiş olarak destekleyin, üreticinin protokolü tarafından önerildiği gibi manyetik aktif hücre sıralamasını gerçekleştirin. Daha sonra, bir antikor rekabet testinde lipid lezlerinin varlığını ve miktarını belirlemek için bir mikroplaka floresan okuyucu kullanarak akış ve elüsyon fraksiyonlarındaki canlı CM DII floresansını izleyin. Seramid fosfo Seine vezikülleri için A PKC'nin bağlanma reaksiyonunun özgüllüğünü doğrulamak için, bir mikrogram anti P KC Zeta tavşan poliklonal antikorunu dört santigrat derecede bir saat boyunca bir hücre lizatı ile inkübe eder, ardından lipid vezikülleri ile inkübe eder.

SDS sayfası ve bir lipid protein polarite kompleksinin in vitro sulandırılması için maksimum elüattaki seramid fosfat serin sles'e bağlanan proteinin immüno-blotting analizi ile devam edin, daha önce gösterildiği gibi canlı cm DII lekeli fosfat serian seramid veziküllerinin pembe bir pelet preparatı ile başlayın, reus vezikülleri 100 mikrolitre tri tamponda askıya alır, 100 mikromolar gama S GT P bir milimolar, GDP ve ilgilenilen rekombinant proteinlerin bir kombinasyonu ile desteklenmiştir. Daha sonra reaksiyonu üç saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, 20 x stok çözeltisinden beş mikrolitre X in V tamponu ve 50 mikrolitre X in V konjuge manyetik boncuk ekleyin.

Karışımı, dört santigrat derecede 30 dakika daha hafif çalkalama altında inkübe edin. Çökeltmeyi kolaylaştırmak için üreticinin protokolü tarafından önerildiği şekilde NX NV manyetik aktif hücre sıralamasını gerçekleştirmeye devam edin. Elüsyon fraksiyonunun 10 mikrogram saf e albümin ile takviyesi.

Proteinleri weyl baca çökeltme ile konsantre edin. Alt faz, zenginleştirilmiş canlı cm dii ile kloroform metanolden oluşur. Kahverengimsi interfaz, manyetik boncukları ve çökelmiş proteini içerir.

Weyl gribi reaksiyonunun organik kloroform metanol fazında pembe, canlı cm dii'yi tespit ederek ellu lipid veziküllerini ölçün. Numuneler arasındaki protein miktarlarını normalleştirmek için eşit miktarda lipit vezikül kullanın ve SDS sayfasına göre analiz edin. İmmün lekeleme.

Tam uzunlukta PKC Zetta C'yi eksprese eden, yeşil bir floresan proteinine veya bir seramid bağlama alanına terminal olarak bağlanan, deterjan içermeyen bir MDCK hücrelerinin lizatı. Pkc'nin C terminalinde. Zetta, fosfo seine ile inkübe edildi.

Maksimum kolonun elusiyeninden sonra seramid vezikülleri, proteinler immünoblotlama ile analiz edildi. Seramid bağlayıcı fragman C 20 Zeta, EGFP ve tam uzunlukta P KC Zeta, liks prosedürünün özgüllüğü ve etkinliği ile tutarlı olarak maksimum kolonun EIT'sinden geri kazanıldı. Fosfata bağlanmayan negatif kontrol EGFP, Suriye seramid veziküllerimiz eit'de tespit edilemedi.

Linx, SDS sayfası ve western blotting veya proteomik analiz gibi diğer yöntemlerle iltifat edildiğinde, lipid bağlayıcı protein kompleksinde hangi proteinlerin olduğu gibi ek sorular cevaplanabilir. Geliştirilmesinden sonra LabX, S tek lipid araştırma alanındaki araştırmacıların nöro kök ve epitel hücrelerinde seramid kaynaklı apoptoz ve hücre polaritesini keşfetmelerinin yolunu açtı.