Name: 2-foton Mikroskop kullanarak Enfekte Akciğerler Nötrofiller Fagositoz ve NET-oluşumu Doğrudan Gözlem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Öğrenin, enfekte akciğerlerde nötrofillerin fagositoz ve NET oluşumunu 2-foton mikroskopi ile canlı gözlemleme yöntemini. Bu teknik, immün hücre davranışlarını doğal ortamında yüksek çözünürlükle incelemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar intravital film, Dr. Jonathan Lindquist yazının dikkatle okunması için optimize yardım için Dr. Lars Philipsen teşekkür ve Gunzer laboratuvar yönteminin geliştirilmesi sırasında yararlı tartışmalar ve yorumlar için tüm üyeleri. Bu çalışma MG Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SFB 854) bağışları ile finanse edilmiştir

1. Enfeksiyon <ol><li> Şişmiş konidya küf Aspergillus (suşu ATCC 46.645) ile desteklenmiş RPMI 1640 (Biochrom AG, Berlin, Almanya) ön-inkübasyon tarafından üretilen% 5 FCS (v / v). 2x10 7 dinlenme konidya 5 ml ortamda yeniden süspanse ve 6-iyi doku kültürü plakası (DYP AG; Trasadingen, İsviçre, katalog # 92.006) inkübe 37 ° 7h ° C </li><li> 6-iyi de içeren her Aspergillus; şişme döneminin ardından, sporlar floresan calcofluor beyaz stok solüsyonu (DMSO [25 mg / ml] Sigma Aldrich, Deisenhofen, Almanya, katalog # F3543) 10 ul ekleyerek etiketlenir plaka, son bir calcofluor konsantrasyonu 50 mcg / ml RPMI ulaştı. Nazik karıştırma, sporlar, 37 ° C'de 15 dakika ek bir inkübe </li><li> Bir sonraki adımda, sporlar, 70 mikron hücre süzgeç (BD Biosciences, Heidelberg, Almanya) ile filtrasyon ile hasat edilir. Pelet 2 ml PBS ve şişmiş Konidyumların Neubauer odasına sayma tarafından belirlenen toplam sayısı 10 ml PBS (oda sıcaklığında 5 dakika 900xg santrifüj) ile bir kez yıkadıktan sonra yeniden süspanse. Son olarak, spor süspansiyon, oda sıcaklığında 5 dakika 900xg aşağı bükülmüş, süpernatantı dikkatle kaldırılır ve pelet nihai konsantrasyonu 100 ul PBS başına 1x107 sporları için yeniden süspanse. </li><li> Enfeksiyon, spor çözüm ul dişi farelerde (C57/BL6, eski 8-10 hafta, Harlan, Almanya) 100 intratrakeal uygulanır. Nötrofillerin yanı sıra dikkat edilmesi gereken ise, lizozim Promotor 1 altında EGFP taşıyan Lys-EGFP farelerin kullanımı tavsiye edilir. 150 ul Ketamin / Rompun çözüm (Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Almanya (Ketamin) ve Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Almanya (Rompun), 1 ml Ketamin [50 mg / ml] başlayın hayvan tek bir IP enjeksiyonu ile anestezi + 0.5 ml Rompun% [2] + 3.5 ml steril NaCl [% 0.9]). 5 dakika sonra anestezi fare dişleri entübasyon (ek Şekil 1) kolaylaştırmak için rampa (yani bir eğimli yüzey) elastik bir bant ile sabit olabilir. Forseps kullanarak, dil, tek taraflı ve 22G kalıcı venöz kateter (B. Braun AG, Melsungen, Almanya, Vasofix Braunüle) hafifçe kalıcı bir kaz boyun lamba ile aydınlatma altında trakea içine eklenebilir çekilir. Kateterin başarılı ekleme, mekanik ventilatör frekans hayvanın göğüs kafesi düzenli hareketlerini izleyerek tarafından doğrulanmadı. Başarılı entübasyon onaylandığı zaman, 100 ul spor süspansiyon, 100 ul mikropipet kullanılarak uygulanır. Bu ses 1-2 sn içinde herhangi bir ek yardım almadan hayvan tarafından inhale edilmelidir Mekanik olarak 2 dakika boyunca dakikada 250 nefes oranı ve 300 inhalasyon hacmi küçük bir hayvan respiratör (MiniVent Hugo Sachs, Mart-Hugstetten, Almanya) ile enfekte hayvan havalandırarak mantar parçacıkları, akciğer içinde gelişmiş bir dağıtım elde edilir ul nefes başına (ek Şekil 2). Enfeksiyon hayvanlar kendi kafesine geri döndü ve tekrar ayaktan kadar her 5 dakikada bir gözlenen sonra. Fare aşağıdaki kuluçka dönemi sırasında ağrı veya sıkıntı herhangi bir kanıt yoktur. </li></ol> 2. Akciğer hazırlık <ol><li> Sporlarla birlikte enfeksiyon 7 saat sonra, hayvanın aşırı dozda tarafından ötenazi izofluran (Baxter GmbH, Unterschleiβheim, Almanya) hareketleri ve solunum 30 saniyeden fazla durdurdu kadar. Bu daha sonra, ikincil bir yöntem olarak klinik ölüm sağlamak ve görselleştirme ve trakea ve akciğerler erişim için izin torakotomi takip edilmektedir. Sonra göğüs, akciğer ve üst solunum yolu açığa çıkarmak için dikkatle açıldı. Sonra başka bir 22G kalıcı venöz kateter maruz epiglot başlayarak trakea içine sokulur. Bu borucuk aracılığıyla akciğerlere 1 ml Omnifix şırınga (B. Braun) ile 1 ml önceden ısıtılmış düşük erime agaroz (2% w / v, Promega, Mannheim, Almanya) ile doldurulur. Trakea, akciğerler dolu olarak kısa bir parça dikiş ipliği ile bağlıdır ve tüm hayvan 4 bir buzdolabı koymak ° C. </li><li> 15 dakika sonra, agaroz katılaşmış, tüm akciğer, trakea itibaren eksize edilir. Bir çift sivri makas kullanarak, sağ akciğer lob daha sonra kaldırılır, alt yüzeyi kısa süre içinde bir yaprak kağıt mendil kurutulur ve daha sonra tüm lob vibratome (Chipping Instruments, İngiltere, 752M Vibroslice hazırlanması blok yapıştırılmış ) fiksasyon için doku yapıştırıcısı (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Almanya, Roti-Coll 1) bir damla. 1 dakika sonra blok önceden soğutulmuş (4 ° C) PBS ile doludur vibratome, kesme odasında yüklenir. Vibratome orta sınıf bir titreşim (10 max 5) ve aynı zamanda orta hızı (5, 10 max.) Böyle bir yatay kesitiakciğer üretilmektedir. Organ üst yarısında daha sonra, bir dizi paralel naylon konuları kapsadığı Kendi kendine yapılan bir düz rondela (iç çapı 1 cm) ile ters ve sabit bir küçük plastik Petri kabı (5 cm çapında), aktarılır dışında her 1 mm (tamamlayıcı şekil 3). Son olarak Petri kabı 10 ml PBS ile desteklenmiş 10 ul DNA boya Sytox Turuncu 5 mcM son bir boya konsantrasyonu [5 mM] (Invitrogen, Almanya) ile doludur. </li></ol> 3. 2-foton lazer mikroskopisi <ol><li> Akciğer örnek içeren Petri kabı sonra tampon bir sıcaklık sensörü kontrollü ısıtıcı (ek Şekil 4) ile 37 ° C ısınmış olabilir, böylece mikroskop objektif altında yüklü. 2-foton mikroskopi sonra 20xNA1.0 suya daldırma lens (Zeiss Jena, Almanya) ile donatılmış bir dik Axio Examiner sahnede Zeiss LSM 710 NLO mikroskop kullanarak tüm kesim yüzeyi üzerinde gerçekleştirilir. Görüntüleme için, bölüm boyunca farklı alanlarda tespit yeşil (530 nm) ve kırmızı (580 nm) floresans yanı sıra, ikinci harmonik üretimi (SHG) sinyal ve 800 nm dalga boyunda bir aydınlatma ile 400 mikron derinliğe kadar taranır mavi calcofluor floresan olmayan harici descanned dedektörleri (NDD) (400-470 nm emisyon). 2-D görüntü ve zaman atlamalı filmleri (1 resim her 5-10 saniye) yanı sıra, tek veya tekrarlayan 3-boyutlu resim yığınlarını sonradan voksel kaplamalar kullanarak ya da tek uzun odak görüntü veya 4-D (zamanla 3D) olarak işlenecek farklı yazılım paketleri. Bu mikroskobik kurulum havadaki patojenlerin çeşitli giriş bağlantı noktası oluşturur, muazzam bir immünolojik alaka, neredeyse bozulmamış bir ortamda hücresel davranış gözlem sağlar. Hücre motilite, fagositoz ve küf Aspergillus enfeksiyonu takiben endojen nötrofil NET üretim yerinde koşullarda kolayca bu altında incelenebilir. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Eğer yapılırsa düzgün görüntüleme 2 üretecektir - veya 3-renkli dia veya film. Boyama sonrası bir işleme prosedürü yapılır ve böylece özgürce adapte olmasına rağmen, genelde göreceli kanal tespit boya / sinyal, doğal renk yansıtan bir boyama düzenini seçin. Böylece, Sytox boyalar varsa, EGFP-işaretli hücrelerin yeşil lekeli, kırmızı, mantar gibi SHG sinyal mavi ile gösterilmiştir tasvir ve. İlk örnekte (Şekil 1) mavi SHG sinyali ile enfekte olmayan akciğer dokusu lifleri ve kırmızı Sytox sinyal, akciğer yerleşik hücrelerinin çekirdekleri tarafından üretilen vibratome tarafından kesilerek açılır gösteriyor. Hem de alveoler yapıların yanı sıra mantar kitlelerin, mavi renkte görünmesi, çekirdek ve NET'ler kırmızı lekeli ikinci örnekte (Şekil 2) virüslü bir akciğer, gösterilir. Üçüncü örnek (Şekil 3), yeşil, mavi ve kırmızı yapıların yanı sıra nötrofiller de görülebilir Lys-EGFP transgenik hayvan. Nötrofil ve zaman atlamalı dizileri bireysel mantar elemanlarının fagositoz göç tamamlayıcı film gösterilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Enfekte olmayan akciğer dilim 2-renkli bir görünüm 2-foton mikroskopi. Akciğer dilim olmayan enfekte fare C57/BL6 hazırlanan ve protokol açıklandığı gibi görüntülü. Alveoler doku yapısı (A) SHG sinyal burada Sunan akciğer dilim (B) ve iki kanal (C) bir yerleşim hazırlanması sırasında, hücre çekirdeğinin Sytox sinyal açık kesti. (C) (D) kutulu alanı genişlemiş görülür. Akciğerin alt kısmında fibröz doku olarak yukarıdaki akciğer solunum aktif alanlar içinde açıkça alveoler organizasyona kıyasla dilim dikkat ediniz. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Aspergillus enfekte vahşi tip hayvan akciğer dilim 2-foton mikroskopi 2-renk görünümü. 7 saat enfekte C57/BL6 fare akciğer dilim A. önce fumigatus hazırlanan ve protokol açıklandığı gibi görüntülendi. Gösterilen kombine mantar yapısı ve SHG alveolar doku (A), DNA NET'ler Sytox sinyal yanı sıra hücre çekirdekleri hazırlanması sırasında (B) akciğer dilim kesilerek açılır ve iki kanal kaplama (C) . (C) (D) kutulu alanı genişlemiş görülür. Lütfen dikkat, mantar kitleler, alveoller ve NET-yapıları açıkça farklı alanlarda sırasıyla E, A ve N harfleri ile işaretlenir. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. 3-renk akciğer dilim Aspergillus enfekte Lys-EGFP hayvan bir görünüm 2-foton mikroskopi Lys-EGFP fare akciğer dilim 7 saat önce enfekteA. fumigatus hazırlanan ve protokol açıklandığı gibi görüntülendi. Gösterilen kombine mantar yapısı ve SHG alveoler doku (mavi), hücre çekirdekleri ve NET'ler (kırmızı) Sytox sinyal, yanı sıra yanı sıra çok sayıda nötrofil (yeşil). <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig1.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Tamamlayıcı rakam 1. Entübasyon için Fare fiksasyonu. Ketamin / Rompun anestezi altında hayvan dişlerini 22G kalıcı venöz kateter ile entübasyon kolaylaştırmak amacıyla elastik bir bant ile sabitlenir. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig2.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Tamamlayıcı rakam 2. Mekanik fare ventilasyon entübe fare 100 ul PBS içinde yeniden süspanse 1x10 7 sporların bir uygulama tarafından bulaşır. Mekanik, küçük bir hayvan solunum ile enfekte fare havalandırarak mantar parçacıkları, akciğer içinde gelişmiş bir dağıtım elde edilir. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig3.jpg" alt="Şekil 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 6"> Tamamlayıcı rakam 3. Akciğer lob fiksasyon organ sağ akciğer lob ön hazırlıktan sonra, bir dizi paralel naylon konuları kapsadığı bir laboratuvar yapımı düz rondela kullanmak bir Petri kabındaki sabit . <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig4.jpg" alt="Şekil 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 6"> Tamamlayıcı rakam 4. 2-foton görüntüleme kurulum sağ akciğer lob içeren Petri kabı, boya Sytox Orange DNA eklenmesinden sonra 2-foton mikroskop altında bir ısıtma matı yüklü . Ek film: yaşayan bir mantar enfeksiyonu sonrası akciğer dilim 7 saat 2-foton mikroskopi zaman atlamalı görüldüğü gibi göç ve Aspergillus enfekte akciğerlerde mantar elemanları phagocytosing Nötrofiller Nötrofiller yeşil, mantar elemanları ve SHG mavi ve hücre çekirdekleri gibi NET yapıları kırmızı olarak tasvir edilmektedir. Deney gerçek zamanlı sağ alt köşesinde gösterilir. Ölçek çubuğu 50 mm gösteriyor. <a href="/files/ftp_upload/2659/5_9_1%20-%20supplemental.mpg">videosunu izlemek için tıklayın</a>

<ol><li>Faust, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+green+fluorescent+granulocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96, 719-719 (2000).</li>
<li>Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spectrum+of+biophysical+interaction+modes+between+T+cells+and+different+antigen+presenting+cells+during+priming+in+3-D+collagen+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A spectrum of biophysical interaction modes between T cells and different antigen presenting cells during priming in 3-D collagen and in vivo.</a> Blood. 104, 2801-2801 (2004).</li>
<li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-154 (2004).</li>
<li>Bousso, P., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+CD8%28%2B%29+T+cell+priming+by+dendritic+cells+in+intact+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of CD8(+) T cell priming by dendritic cells in intact lymph nodes.</a> Nat. Immunol. 4, 579-579 (2003).</li>
<li>Beuneu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+functional+diversification+of+CD8%28%2B%29+T+cell+responses+in+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Visualizing the functional diversification of CD8(+) T cell responses in lymph nodes.</a> Immunity. 33, 412-412 (2010).</li>
<li>Aimanianda, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+hydrophobin+prevents+immune+recognition+of+airborne+fungal+spores%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Surface hydrophobin prevents immune recognition of airborne fungal spores.</a> Nature. 460, 1117-1117 (2009).</li>
<li>Snelgrove, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Critical+Role+for+LTA4H+in+Limiting+Chronic+Pulmonary+Neutrophilic+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Critical Role for LTA4H in Limiting Chronic Pulmonary Neutrophilic Inflammation.</a> Science. 330, 90-90 (2010).</li>
<li>Chou, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-Cytokine-Chemokine+Cascade+Drives+Neutrophil+Recruitment+in+a+Murine+Model+of+Inflammatory+Arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Lipid-Cytokine-Chemokine Cascade Drives Neutrophil Recruitment in a Murine Model of Inflammatory Arthritis.</a> Immunity. 33, 266-266 (2010).</li>
<li>Nitschke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+and+4-D+imaging+of+immune+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">3-D and 4-D imaging of immune cells in vitro and in vivo.</a> Histochem. Cell Biol. 130, 1053-1053 (2008).</li>
<li>Niesner, R. A., Andresen, V., Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+2-photon+microscopy+-+focus+on+speed+and+time+resolved+imaging+modalities%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Intravital 2-photon microscopy - focus on speed and time resolved imaging modalities.</a> Immunol Rev. 221, 7-7 (2008).</li>
<li>Bruns, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Extracellular+Traps+against+Aspergillus+fumigatus+in+vitro+and+in+Infected+Lung+Tissue+is+Dependent+on+Invading+Neutrophils+and+Influenced+by+Hydrophobin+RodA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Production of Extracellular Traps against Aspergillus fumigatus in vitro and in Infected Lung Tissue is Dependent on Invading Neutrophils and Influenced by Hydrophobin RodA.</a> PLoS Pathog. 6, 1000873-1000873 (2010).</li>
<li>Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+T+cell+trafficking+examined+in+vivo+with+intravital+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2604-2604 (2003).</li>
<li>Brinkmann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Extracellular+Traps+Kill+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria.</a> Science. 303, 1532-1532 (2004).</li>
<li>Marcos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR2+mediates+NADPH+oxidase-independent+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+cystic+fibrosis+airway+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">CXCR2 mediates NADPH oxidase-independent neutrophil extracellular trap formation in cystic fibrosis airway inflammation.</a> Nat Med. 16, 1018-1018 (2010).</li>
<li>Clark, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+TLR4+activates+neutrophil+extracellular+traps+to+ensnare+bacteria+in+septic+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood.</a> Nat Med. 13, 463-463 (2007).</li>
<li>Bianchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+NET+formation+by+gene+therapy+in+CGD+controls+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis.</a> Blood. 114, 2619-2619 (2009).</li>
</ol>

In vivo ya da sağlam organlarda Gerçek-zamanlı 2-foton mikroskopi, son 10 yılda, bağışıklık hücrelerinin fizyolojisi ile ilgili çalışmalarda derin önem kazanmıştır. T-hücre aktivasyonu, lenf düğümleri içinde dinamikleri gibi önemli olaylar ilk 2-4 görünür hale geldiği, bu tekniği ile oldu . Daha yakın zamanlarda, araştırmacılar da, bu yaklaşımın 5 kullanarak lenfatik dokular efektör hücrelerinin üretimi ilk adımları gibi spesifik hücresel fonksiyonları analiz etmeye başladık . Ancak, bu yöntemi kullanarak bir dizi yeni biyolojik kavramların ortaya olmasına rağmen, hala zorlu ve hiçbir intravital görselleştirme çalışmaları şimdiye kadar yayınlanmış olan hangi önemli sorular vardır. Özellikle bu memeli akciğer için de geçerlidir. Bu organ ilginç yönü, havadaki patojenlerin çeşitli giriş bağlantı noktası olarak, immünolojik süreçleri memeli vücutta yer aldığı en önemli yüzeylerin biri yapar. Bütün ömrü boyunca her nefeste, istenmeyen parçacıklar olan ve hayatı tehdit eden enfeksiyonlara 6 neden potansiyeline sahip bazı solunması. Savunma mekanizmalarının böyle bir hassas ve nesilleri tükenme tehdidi altında olan bir yerinde sıkı bir ağ bağışıklık yanıtlarını tüm repertuar sergileyen bulunması gereken bu kendi kendini açıklayıcı. Öte yandan, böyle bir &quot;kirli&quot; bir yerde potansiyel patojenlere karşı uyarılan immünolojik mücadele sıkı kontrol olması çok önemlidir. Bağışıklık sisteminin abartılı tepkiler, kitlesel belirsiz immün hücre eylemleri 7,8 uyarılması üzerine organ doku yaralanmasına kendi bedeni zarar yüksek bir risk taşımaktadır . Bu düşünceler ışığında, in vivo koşullarda gerçek altında memeli akciğerlerde hücre davranışı araştırmak için son derece ilginç ve yararlı olacaktır. Ancak, böyle bir sistemin şimdiye kadar başarılı bir çalışma protokolü kurma çözülmesi gereken çok büyük zorluklar açıkça noktaları uygulamaya henüz sahip olduğu bir gerçektir. En zorlu meydan muhtemelen odak istikrar. Nefes sorumlu organı olarak akciğer inhalasyon gerçekleştirmek için alan her üç yönde sürekli hareket altındadır. Bu durum tek başına, ciddi görüntüleme sorunlara neden olur ve bir intravital görüntüleyiciler &quot;kabus&quot; olarak kabul edilebilir. Zaten uzayda herhangi bir boyut için hafif bir hareket, mikroskobik görüntüsü, anlamlı görüntüler oluşturmak için 9 mikrometre hassasiyetle kararlı olması gereken büyük bir bozulan bir etkiye sahiptir. Doğal sıkı yerel odak göz önüne alındığında, 10, 2-foton mikroskopi, odak kararsızlıkları bile daha duyarlı Z-yönünde sadece birkaç mikrometre aralığında belirli bir yapının bir çıkığı olarak tam bir odak kaybına eşdeğerdir ve dolayısıyla başarısız bir deneme. Fare akciğer içinde bağışıklık hücreleri, gözlem için bu çalışmada sunulan protokol, işlevsel sağlam akciğer 11 durum in vivo uygulama değil, yakın bir değildir. Eksplante lenf örneğin görüntüleme lenfositler için ex vivo yaklaşımları , düğümleri, in vivo gözlemler 12 gerçek eşdeğer sonuçlar gösterilmiştir ve bu nedenle 5 derece alakalı. Yaklaşımı ile mümkün olan akciğer dilimleri, yerinde gözlemler, virüslü bir akciğer, kısa bir süre eksizyon sonra gerçekleşecek . Kesme işlemi sırasında 3D bütünlüğünü agaroz matris, akciğer tam kontrollü kesme işlemi sağlamak için önemli bir adım tarafından sağlanmaktadır. Agaroz matris bir katılaşma izin vermek için kısa bir süre için eksplante akciğer soğutmak için gerekli olmasına rağmen, kesme ve doku rewarming sonra hücreleri için yakın fizyolojik koşullara dönmek mümkün. Bu açıkça, bu koşullar altında nötrofillerin son derece aktif ve Aspergillus enfeksiyonu etkili bir şekilde temizlenmesi için gerekli olan çevik fagositler, potansiyellerini tam olarak sergilemek olduğunu göstermek bizim veri gösterilir. Bunlar alveoller iç bölgelerine ulaşmak için epitel engelleri geçerek akciğer dokusunda devriye ve bunun da ötesinde, mantar sporlarının aktif 11 kadar sürebilir. Bu çalışmanın bir anahtar bulgu Aspergillus enfekte organ Nötrofil ekstrasellüler tuzakları (NET) benzeyen yapılar görünümünü oldu. NET&#39;ler nötrofil 13 yeni savunma mekanizması çok yakın bir bulgudur . Ancak, 2004 yılında ilk açıklamasını bu yana, hayvan modellerinde ya da bu fenomeni gözlenmiştir veya eksik olan insanlarda fizyolojik veya patolojik koşullar sayısı patlayarak 14-16 artan olmuştur. İlginçtir ki, çok çalışma, bu yapıların çok farklı gruplar tarafından harcanan olmasına rağmen, çoğu raporda hala çok açıklayıcı bir seviyede ve çok değilNET sürümü mekanizması ve düzenlenmesi ile ilgili bilinir. Protokolü ile virüslü bir akciğer NET lifler göstermek için ilk kez başardık. Ayrıca, biz, kendi oluşumu veya inhibisyonu 11 için taze işe nötrofil yanı sıra moleküler mantar yapıların önemini göstermek . Bu yöntemi daha ayrıntılı NET oluşumu tek adımları araştırmak için potansiyeli açık bir şekilde göstermektedir. Bir evlatlık transfer deneylerde NET oluşumu becerilerini gözlemlemek için uygun fareler knock-out nötrofil kullanmak örneğin düşünebiliriz. Böylece periferik kan nötrofil göç doğrudan gözlem Organ eksplantasyonunun sonra kan arz eksikliği nedeniyle bu sistem ile mümkün olmamasına rağmen, biz hala bizim protokol görüntüleme sağlayan bir işlemek için değerli ve nispeten kolay bir yaklaşım olduğuna inanıyorum akciğer enfeksiyonlarına karşı bağışıklık savunma erken veya geç adımlar. Bu nedenle, canlı hayvanların solunum akciğer içinde bu fenomenin incelenmesi yönünde önemli bir adımdır.

2-foton mikroskop kullanarak enfekte akciğerler nötrofiller fagositoz ve net-oluşumu doğrudan gözlem

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

Gastrointestinal sistem, akciğer, omurgalı vücut ve çevre arasındaki etkileşim için en büyük ikinci yüzey. Burada, aynı zamanda, normal solunum sırasında inhale birden fazla patojenlerin enfeksiyon kaçınarak etkili bir gaz alışverişi, bakımlı olmalıdır. Bunu başarmak için, savunma stratejileri, humoral ve hücresel immün mekanizmaları birleştirerek mükemmel bir set var. Akut akciğer savunma için en etkili önlemlerden biri ya da inhale patojenleri fagosite veya sitotoksik kimyasalların serbest bırakarak onları öldürmek nötrofil, işe alım. Nötrofil cephanelik için yeni bir ek bakteri veya mantar yakalanan veya inaktive NET serbest hücreleri öldü sonra bile olabilir ekstrasellüler DNA NET&#39;ler patlayıcı sürümüdür. Biz, burada kısa bir süre önce enfekte akciğer içinde göç yanı sıra enfekte doku boyunca ürettiklerini geniş NET&#39;ler görselleştirmek gibi fungal patojenlerin phagocytosing nötrofil biri doğrudan gözlemlemek için izin veren bir yöntem mevcut. Bu yöntem, çok renkli zaman atlamalı 2-foton mikroskopi kalıp Aspergillus ve sınav konidya ile farelerin intratrakeal enfeksiyon 7 saat sonra, kalın yaşayabilir akciğer dilimler hazırlama açıklamaktadır. Bu yaklaşım, bir doğrudan yerli akciğer dokusunda antifungal savunma araştırmak için izin verir ve böylece pulmoner dokunulmazlık ayrıntılı soruşturma için yeni bir caddeye açılır.

Biz patojenleri fagosite veya nötrofil ekstrasellüler tuzakları (NET) üretirken enfekte akciğerlerde nötrofil granülositler dinamiklerinin gözlem için 2-foton mikroskopi nasıl kullanılacağını göstermektedir.

2-foton Mikroskop kullanarak Enfekte Akciğerler Nötrofiller Fagositoz ve NET-oluşumu Doğrudan Gözlem

Gastrointestinal sistemden sonra akciğer, omurgalı vücudu ile çevre arasındaki etkileşim için ikinci en büyük yüzeydir. Burada, bir ...

Bu prosedürün genel amacı, yakın zamanda fungal bir patojenle enfekte edilmiş bir akciğerde canlı nötrofil granülositleri ve hücre dışı DNA ağlarını görselleştirmektir. İlk olarak, nötrofil popülasyonunda EGFP pozitif olan fareler, aynı zamanda floresanla işaretlenmiş candida ile enfekte edilir. Ardından, enfeksiyonun yedi saat boyunca gelişmesine izin verilir ve bu sürenin sonunda enfekte hayvan sakrifiye edilir.Ardından, beome ile kesme işlemini kolaylaştırmak için enfekte hayvanın akciğerleri düşük erime noktalı agros ile doldurulur. Son olarak, viome ve akciğer nötrofilleri aracılığıyla enfekte akciğer dokusundan kalın bir kesit alınır. DNA ağları ve fungal elementler görüntülenir.Nihayetinde, canlı akciğer dokusundaki granülositlerin yüksek çözünürlüklü durağan görüntüleri veya movie sekansları, çok renkli iki foton mikroskopisi ile elde edilebilir. Bu yöntemin mevcut teknolojilere göre temel avantajı, enfeksiyonu temizlemekten sorumlu olan bağışıklık hücrelerinin doğrudan doğal ortam içerisinde gözlemlenebilmesidir. Bu işlem, net oluşumu ve fungal öldürme süreci sırasında gerçekleştirilebilir ve böylece nötrofil fizyolojisinin çok daha az artefakt içeren bir analizine olanak tanır.Mathias'ın, önceki in vitro bulgularımın in vivo uygunluğuna ilişkin ısrarlı sorularıyla beni bunaltması üzerine bu tekniği geliştirdim ve çevresel küf olan Aspergilus fumigatus'un şişmiş konidiyalarını üretmek için kullanılan bu tekniği önümüzdeki birkaç dakika içinde sunacağım. Altı kuyucuklu bir hücre kültür plağına beş mililitre besiyeri ekleyin, ardından plağa 2 × 10⁷ dinlenmiş konidi transfer edin ve sporları BSL 2 tesisinde, 37 °C'de, %5 karbondioksit altında yedi saat boyunca inkübe edin.Şişme süresinden sonra, nazikçe karıştırmanın ardından her kuyucuğa 10 µL calcior white stalk çözeltisi ekleyerek sporları floresanla işaretleyin. Floresan işaretli sporları toplamak için plakayı aynı koşullar altında 15 dakika daha inkübe edin, ardından 50 mL'lik konik bir tüpün üzerine 70 µm hücre süzgeci yerleştirin. Sporları pipet yardımıyla plaktan toplayın ve ardından medya çözeltisini hücre süzgecinden geçirerek tüpe aktarın.Ardından, hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 900 Gs hızında santrifüjleyerek çöktürün ve medyumu atın. Daha sonra sporları aynı santrifüj koşulları altında 10 mililitre PBS ile yıkayın. Spor peletini iki mililitre PBS içinde yeniden süspande edin ve şişmiş kanadyaların toplam sayısını hücre sayıcı ile belirleyin; spor süspansiyonunu daha önce olduğu gibi aynı santrifüj koşulları altında tekrar döndürün ve ardından süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın.Çökmüş kedia'yı, PBS içerisinde 100 µL başına 1x10⁷ hücrelik bir son konsantrasyonda süspande edin. Fareyi spor çözeltisi ile enfeksiyona hazırlamak için hayvan anestezi altına alınır ve sedasyon, ayak parmağı sıkıştırma testine verilen yanıtın yokluğuyla doğrulanır. Bu videoda, lizozim promotörü altında EGFP taşıyan ve dolayısıyla EGFP pozitif nötrofillere sahip olan lys EGFP fareler kullanılmıştır. Anestezinin uygulanmasından ve sedasyonun doğrulanmasından beş dakika sonra, narkotize edilmiş fare bir kuğu boyun lambasının altında dişlerinden lastik bant kullanılarak askıya alınır. Pens yardımıyla dil bir yana çekilir ve hayvanın trakeasına 22 gauge'lik bir indwelling venöz kateter yerleştirilir.Bu tüpün başarılı bir şekilde yerleştirilmesinin ardından, 100 µL spor süspansiyonu uygulamak için 100 µL'lik bir mikropipet kullanın. Ardından, fungal partiküllerin akciğer genelindeki dağılımını artırmak için, enfekte hayvanı küçük hayvan respiratörü ile dakikada 250 solunum hızında ve solunum başına 300 µL inhalasyon hacmiyle iki dakika boyunca mekanik olarak ventile edin. Son olarak, kateteri çıkarın ve enfeksiyon ilerlerken fareyi yedi saat boyunca kafesine geri yerleştirin.Enfeksiyon süresinin bitiminden hemen önce, hayvan tekrar hareket edebilir hale gelene kadar her beş dakikada bir iyileşme durumunu gözlemleyin. Mikrodalga fırında 20 mililitre düşük erime noktalı agroz eritin ve enjekte edilmeden önce donmaması için sıcak tutun. Bu sırada, buzdolabında bir şişe PBS'yi dört santigrat dereceye kadar soğutun.Enfeksiyon süresinin tam sonunda hayvan ötanize edilir. Fareyi bir silikon hazırlama matına sabitlemek için iğneler kullanın ve akciğerleri ile üst solunum yolunu açığa çıkarmak için bir makas ve pens yardımıyla göğüs kafesini dikkatlice açın. Açığa çıkan epiglottisten başlayarak, trakeaya başka bir 22 gauge indwelling venöz kateter yerleştirin.Bir dikiş iğnesi kullanılarak, akciğerin sonraki agros doldurma adımına hazırlık amacıyla trakeanın etrafına standart bir dikiş ipi sarılır. Ardından, bir mililitrelik bir şırınga önceden ısıtılmış agros ile doldurulur ve akciğerleri doldurmak için kateter aracılığıyla uygulanır. Akciğerler dolar dolmaz, kateter çıkarılırken trakea hazırlanan dikiş ipi ile bağlanarak kapatılır ve hayvanın tamamı 15 dakika boyunca dört santigrat derecelik bir buzdolabına konur.Aros katılaştıktan sonra, trakeadan başlayarak tüm akciğeri açık göğüs kafesinden çıkarın ve sivri uçlu bir makas kullanarak önceden soğutulmuş PBS ile yıkayın. Sağ akciğer lobunu çıkarın. Lobun alt kısmını bir kağıt havlu üzerinde kısa süreliğine kurulayın ve ardından lobu bir damla doku yapıştırıcısı kullanarak bir dakika boyunca vibram preparasyon bloğuna sabitleyin.Ardından, bloğu vibratomun kesme haznesine yerleştirin ve hazneyi önceden soğutulmuş PBS ile doldurun. Jileti orta düzey bir titreşime ve orta sürüş ayarına getirin ve akciğerin yatay bir enine kesitini alın. Daha sonra, dilimlenmiş akciğer dokusunun üst yarısını beş santimetre çapındaki plastik bir Petri kabına ters şekilde yerleştirin.Düz bir pulu üzerine yerleştirerek akciğer dokusunu petri kabına sabitleyin. Kabı 10 milliliters PBS ile doldurun ve 10 microliters sitoksin boyası ekleyin. Son olarak, görüntüleme için tamponun sıcaklık sensörü kontrollü bir ısıtıcı ile 37 degrees Celsius'ye ısıtılabilmesi amacıyla, akciğer dokusunu içeren kabı mikroskop objektifinin altına yerleştirin.Diseksiyon boyunca farklı alanlar, 800 nanometre aydınlatma dalga boyu kullanılarak 400 mikrometre derinliğe kadar taranmış; yeşil 530 nanometre ve kırmızı 580 nanometre floresansın yanı sıra ikinci harmonik üretimi veya SHG sinyali tespit edilmiştir. 400 ile 470 nanometre emisyonundaki mavi renkli floresansta, burada maviyle gösterilen harici non-DS tarama dedektörleri veya NDD ile alınan görüntü, enfekte olmamış bir C 57 black six faresinin akciğer alveolar doku yapısının SHG sinyalidir. Akciğer kesitinin alt kısmındaki fibröz dokuyu, akciğerin üst kısmındaki solunum aktif alanlar içindeki belirgin alveolar organizasyonla karşılaştırınız.Bu şekilde, akciğer kesiti hazırlığı sırasında açılmış olan akciğer hücresi çekirdeklerinin cyt talk sinyali kırmızı renkte görselleştirilmiştir. Bu şekil, burada gösterilen dokunun kutu içine alınmış alanının yakın çekimi ile iki kanalın üst üste bindirilmiş görüntüsünü göstermektedir. Mavi SHG sinyali, yedi saat önce afu tis ile enfekte edilmiş bir C 57 black six faresinin akciğer kesitinde bulunan alveolar ve fungal yapıları göstermektedir.Bu şekilde, kırmızı Cyt talk sinyali, akciğer dilimi hazırlığı sırasında açılan akciğer hücrelerinin çekirdeklerini göstermekle kalmayıp aynı zamanda buradaki DNA ağlarını da göstermektedir. İki kanalın üst üste bindirilmiş hali, önceki şekildeki kutulu alanın bu büyütülmüş grafiğinde görülebilir. Mantar kütlelerinin, alveollerin ve ağ yapılarının belirgin alanları sırasıyla FA ve N harfleriyle; birleşik mantar yapısı ve alveoler dokunun SHG'si ise mavi ile belirtilmiştir.Bir lys EGFP faresinden alınan akciğer dokusu kesitinde, hücre çekirdekleri ve ağlar kırmızı, çok sayıda akciğer infiltrasyonlu nötrofilleri ise yeşil renkte görülebilmektedir. Zaman atlamalı görüntülemede görüldüğü üzere, afu tanrısı ile enfeksiyondan yedi saat sonra, aspers enfeksiyonlu akciğerlerde yeşil renkteki nötrofillerin göç ettiği ve mavi renkteki fungal elementleri fagositozla yok ettiği görülebilir.Canlı bir akciğer kesitinin iki foton mikroskopisi. Enfeksiyondan yedi saat sonra, hücre çekirdekleri ve ağ yapıları kırmızı renkte gösterilmiştir. Deneyin gerçek zamanı sağ alt köşede belirtilmiş olup ölçek çubuğu 50 micrometers değerini ifade etmektedir.Bu yöntem artık fungal enfeksiyonlar hakkında bilgi sağlayabilmektedir. Ayrıca viral veya bakteriyel enfeksiyonlar gibi diğer sistemlere de uygulanabilir ve akciğer içindeki diğer yerleşik immün hücrelerin fonksiyonlarına dair içgörü sunabilir.

direct-observation-phagocytosis-net-formation-neutrophils-infected

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Burada, Candida albicans mantarları ve zimozan ve IgG kaplı boncuklar dahil olmak üzere 0,5 μm'den büyük partiküller gibi patojenlerin fagositozu sırasındaki olayların erken kaskadlarını görselleştirmek ve ölçmek için mikroskop tabanlı bir tekniği açıklıyoruz.

Fagositoz Erken Aşamaları görselleştirme

Bu yazıda phagosomal pH ve alan olarak rasyometrik göstergesi seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, ya da S-1 kullanılarak, insan ve fare nötrofillerin sitoplazmik pH'ını ölçmek için basit bir yöntem tarif etmektedir. Bu canlı hücre konfokal floresan mikroskop ve görüntü analizi kullanılarak elde edilir.

Nötrofil fagozomun Görüntüleme ve Sitoplazma bir oranlı metrik pH Göstergesi kullanma

Burada dönen disk confocal mikroskobu görüntüsü tek fagositik olayları için fare ikamet periton makrofajlar tarafından kullanma yöntemleri açıklanmaktadır. İletişim kuralları diğer fagositik hücreler için genişletilebilir.

Fagositoz fare makrofajlar tarafından hızlandırılmış 3D görüntüleme

Bu çalışmada, biz iki fotonlu intravital görüntüleme ve hücre etkileşim fare trakeal mukoza grip virüsü ile enfeksiyon sonra çözümlemesi için bir protokol mevcut. Bu iletişim kuralı bağışıklık hücre dynamics sırasında solunum yolu enfeksiyonları eğitim araştırmacılar için ilgili olacaktır.

İki fotonlu Intravital mikroskobu kullanılarak grip virüsü enfeksiyonu sırasında trakeal mukozasında görüntüleme hücre etkileşimi

Burada tanıtılan Protokolü içinde vivo inflamatuar koşullar altında birincil insan lenfosit akciğer izleme kapasitesini karakterizasyonu sağlar. Alerjik iltihap bir fare modeli adoptively transfer edilen insan bağışıklık hücrelerinin pulmoner infiltrasyon görüntüsü ve kimyasal olarak temizlenen Akciğer doku ışık sayfalık Floresans mikroskobu tarafından sayılabilir.

Akciğer yolu bulabilen insan lenfosit içinde deneysel bir alerjik iltihap ışık sayfalık mikroskobu üzerinde dayalı, Vivo modeli görüntüleme gelişmiş

Nötrofil ekstrasellüler tuzakları (NETs) uyarılmış nötrofil granülositler tarafından oluşturulan üç boyutlu yapılardır. Son yıllarda NET'lerin çok çeşitli hastalıklara karıştıkları ortaya çıkmıştır. Dokudaki NET'lerin saptanması tanısal bir önemi olabilir, bu nedenle NET bileşenlerinin etiketlenmesi için standart protokoller gereklidir.

Parafin-Gömülü Dokuda İnsan ve Mürin Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklarının İmmünofloresan Etiketlemesi

Burada in vitro nötrofil hücre dışı tuzakların (NET'ler) indüksiyonu ve analizi için bir protokol sunulmaktadır. DNA, katelisidin (LL37) ve enzim aktivitesinin nicelleştirilmesi, benzer kontrollü koşullar altında mikrobiyal ve kimyasal uyaranlar tarafından indüklenen NET'lerin bileşimindeki ve morfolojisindeki değişkenliği gösteren veriler vermiştir.

Mikrobiyal ve Kimyasal Uyaranlar Tarafından İndüklenen Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların Morfolojik ve Bileşimsel Analizi

Nötrofil hücre dışı tuzaklar (NET'ler) çeşitli hastalıklarla ilişkilidir ve immünofloresan genellikle görselleştirmeleri için kullanılır. Bununla birlikte, çeşitli boyama protokolleri vardır ve çoğu durumda sadece bir doku türü incelenir. Burada, fare ve insan dokusunda NET'lerin boyanması için genel olarak uygulanabilir bir protokol oluşturuyoruz.

İnsan ve Fare Dokularında Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların İmmünofloresan Görüntülemesi

Bu protokol, farklı sinyal yollarından gelen fonksiyonları kapsamak için bir tarama yöntemi olarak kullanılacak bir dizi nötrofil fonksiyonel tahlil içerir. Protokol, hücre canlılığının, saflığının, reaktif oksijen türlerinin üretiminin, gerçek zamanlı göçün, fagositozun ve nötrofil hücre dışı tuzakların bir ön önerisinin ilk ve basit bir değerlendirmesini içerir.

Nötrofil fonksiyonuna hızlı bir genel bakış için bir dizi tarama tekniği

Canlı hücre analiz sistemini kullanarak nötrofil hücre dışı tuzaklarını (NET'ler) ölçmek için membran geçirgenliğine bağlı çift boya yaklaşımıyla birleştirilmiş otomatik bir yüksek verimli yöntem sunuyoruz.

İnsan Nötrofillerinde Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların Oluşumunu Ölçmek için Gerçek Zamanlı Yüksek Verim Tekniği

Burada, nakledilen farenin sol akciğerini iki foton mikroskobu kullanarak intravitalal olarak görüntülemek için bir protokol sunuyoruz. Bu, murin akciğer naklini takiben hücresel dinamikleri ve etkileşimleri gerçek zamanlı olarak incelemek için değerli bir araçtır.

Nakledilen Fare Akciğerinin İntravital İki Foton Mikroskobu

Öğrenin, enfekte akciğerlerde nötrofillerin fagositoz ve NET oluşumunu 2-foton mikroskopi ile canlı gözlemleme yöntemini. Bu teknik, immün hücre davranışlarını doğal ortamında yüksek çözünürlükle incelemeyi sağlar.

2-foton Mikroskop kullanarak Enfekte Akciğerler Nötrofiller Fagositoz ve NET-oluşumu Doğrudan Gözlem

Daha fazla video keşfet