Balb / C Beyin Dokusu Yüksek Hassasiyet 5-hydroxymethylcytosine Algılama

Aşağıdaki deneyin genel amacı, genomik DNA'nın belirli bir lokusu içindeki beş metil sitozin ve beş hidroksietil sitozini analiz etmek ve miktarını belirlemektir. Bu işlem, bir MSP one bölgesini kesilemez bir bölgeye dönüştüren beş Hidroksietil Aine'nin hidroksil grubunun kaplanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, genomik DNA, glikozla ilişkili beş hidroksietil sitozin bölgelerini tanımlamak için farklı metilasyon hassasiyetlerini kullanan MSP one ve HPA two restriksiyon enzimleri ile sindirilir.

Lokusun sorgulanması için bir sonraki PCR işlemi uygulanır. Belirli bir lokusta beş hidroksietil sitozin bulunduğunu gösteren sonuçlar elde edilir. Beş metil sitozin ve beş hidroksietil sitozin miktarını belirlemek için QPCR kullanılabilir.

Bu tekniğin bisülfit sekanslama gibi diğer yöntemlere göre temel avantajı, 5-metilsitozin ile 5-hidroksietilsitozin arasında ayrım yapabilmenizdir. Bugün gerçekleştirilecek deneyler, New England Biolabs'ta bu kitin ana geliştiricilerinden biri olan Romas Vice Villa tarafından yürütülecektir. Bu protokole başlamadan önce, yazılı prosedürde açıklandığı şekilde B Sea beyin dokusundan genomik DNA saflaştırılmıştır. 1,5 mL'lik bir reaksiyon tüpünde; genomik DNA, UDP-glikoz, NEB tamponu 4 ve toplam hacmi 310 µL'ye tamamlayacak kadar nükleaz içermeyen suyu karıştırın.

Bu reaksiyon karışımını, her biri 155 µL olacak şekilde iki tüpe bölün. Ardından, tüplerden birine 30 ünite veya üç µL T dört beta glukoziltransferaz ekleyin. Pipetle nazikçe yukarı aşağı çekerek iyice karıştırın.

Kontrol reaksiyonu olduğu için ikinci tüpe T four BGT eklemeyin, ancak üç microliters su eklediğinizden emin olun. Her iki tüpü 37 degrees Celsius'ta 12 ila 18 saat boyunca inkübe edin; bu süre zarfında BGT, örnekteki beş hydroxyethyl cytosine gruplarının hidroksil grubuna glikoz ekleyecektir. Restriksiyon enzimi sindirimine başlamak için, reaksiyon karışımından 50 microliters'ı birden üçe kadar etiketlenmiş üç adet 0.2 milliliter PCR şerit tüpünün her birine paylaştırın.

Ardından, kontrol karışımından 50 µL'lik porsiyonları dörtten altıya kadar etiketlenmiş üç PCR şerit tüpünün her birine paylaştırın. Birinci ve dördüncü tüplere 100 unit msp ekleyin. Sonra, ikinci ve beşinci tüplere 50 unit HPA iki ekleyin ve hafifçe pipetleyerek iyice karıştırın.

Üç ve altı numaralı tüpler kontrol olduğu için bunlara hiçbir şey eklemeyin. Altı tüpün tamamını 37 °C'de en az dört saat inkübe edin. Ardından, her tüpe 1 µL proteinaz K ekleyin ve 40 °C'de 30 dakika inkübe edin.

Son olarak, 95 °C'de 10 dakika inkübe ederek proteinaz K'yı inaktive edin. Bu prosedür, endpoint PCR için NE B'S long amp TAC kullanılarak gösterilmiştir. Bununla birlikte, buz üzerinde 0,2 mL'lik bir PCR reaksiyon tüpünde diğer PCR reaktifleri ve prosedürleri de kullanılabilir.

Beş x long amp TAC reaksiyon tamponu, dNTP'ler, ileri ve geri primerler, önceden elde edilen kalıp DNA, long AMP TDNA polimeraz ve final hacmi 50 µL olacak şekilde yeterli nükleazdan arındırılmış su ekleyin. Reaksiyonu nazikçe karıştırın ve gerekirse kısa bir santrifüj ile tüm sıvıyı tüpün dibine toplayın. PCR tüplerini buzdan, bloğu 94 °C'ye önceden ısıtılmış bir termosikletöre aktarın ve rutin üç aşamalı PCR için döngü programını başlatın.

94 °C'de 30 saniye süren bir başlangıç denatürasyon adımının ardından; 94 °C'de 15 saniye denatürasyon, 55 ila 65 °C'de 30 saniye bağlanma (annealing) ve 65 °C'de 20 saniye veya kb başına 50 saniye uzama şeklinde 30 döngü uygulanmalıdır. Bunu, 65 °C'de beş dakika süren bir final uzama adımı takip etmelidir. 5-metilsitozin ve 5-hidroksimetilürasin miktarlarını nicelleştirmek için gerçek zamanlı PCR da gerçekleştirilebilir.

Belirli bilgiler için lütfen nb. com adresinde bulunan ürün kılavuzuna bakın. Locus 12'deki beş hidroksietil ain miktarı, son nokta PCR ve gerçek zamanlı PCR kullanılarak karşılaştırılmıştır; beyin, karaciğer, kalp ve dalak dahil olmak üzere dört farklı fare BSY doku örneği analiz edilmiştir.

Beş hidroksietil sitozindeki varyasyon, karşılaştırma amacıyla uç nokta PCR örneklerinin kutulu jel şeridinde açıkça görülmektedir. Gerçek zamanlı PCR verileri kesilmemiş DNA'ya göre normalize edilmiş ve kopya sayısını belirlemek için standart bir eğri kullanılmıştır. Örnekler, örneklerin kopya sayısının sindirilmemiş kontrolün kopya sayısına bölünmesiyle normalize edilmiştir.

Burada, beş hidroksietil sitozindeki varyasyon sarı çubuklar karşılaştırılarak görülebilir. Tekniğin uygulanmasına dair birkaç not: Tüm enzimatik reaksiyonların tamamlanması kritik öneme sahiptir. BGT için, MspI ve HpaII için tüm DNA bölgelerini izole edebilmek adına işlemin gece boyunca sürdürülmesi önemlidir; bu reaksiyonların tamamlandığından emin olmak için en az dört saat boyunca devam ettirilmesi gerekir.

Son olarak, kontrol reaksiyonlarını yan yana gerçekleştirebilmeniz için DNA kontrolleri ve primer kontrolleri sağlıyoruz.