Tam Kan Stimülasyon Testi kullanarak Pro-inflamatuar sitokin IL-1β Doğru ve Basit Ölçme

Bu prosedürün genel amacı, bir tam kan stimülasyon testiyle üretilen pro-inflamatuar sitokinleri ölçmektir. İlk olarak, tam kanın hücresel bileşenleri santrifüjleme yoluyla plazmadan izole edilir ve aine orange boyaması kullanılarak beyaz kan hücreleri sayılır. Ardından, hücreler plaklara ekilir ve mikrobiyal patern tanıma reseptörleri taşıyan hücrelerde sitokin üretimini tetiklemek için LPS ve ardından TP ile stimüle edilir; stimülasyon başlangıcını takiben belirli zaman noktalarında kültür süpernatantları toplanır.

Son olarak, süpernatantlardaki sitokin konsantrasyonları 96 kuyucuklu plaka üzerinden bir multipleks analizle ölçülür. Bu basit yöntem kullanılarak, farklı donörlerden alınan stimüle edilmiş hücreler tarafından üretilen proinflamatuar sitokin konsantrasyonlarındaki varyasyonlar hızla değerlendirilebilir. Bu yöntem, özellikle elde edilebilen kan hacminin sınırlı olduğu durumlarda, patolojik antiinflamatuar belirtiler gösteren hastalarda I one aracılı inflamatuar hastalıkların tanımlanması için oldukça yararlıdır.

Sitokin konsantrasyonlarının ölçümünde bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, luminex tabanlı teknolojinin küçük bir örnek hacmi kullanarak aynı anda birkaç sitokinin ölçülmesine olanak tanımasıdır. Etkilenen bireylerin yanı sıra yaş ve cinsiyet açısından eşleştirilmiş sağlıklı kontrollerden 10 mililitre veya daha fazla venöz kan içeren örnekler alın; örneklerin sodyum heparinli vacutainer kan toplama tüplerine toplandığından emin olun ve assay ile etkileşime gireceği için EDTA veya diğer antikoagülanlar eklemeyin; örnekleri topladıktan sonra mümkün olan en kısa sürede işleyin. Gerekirse örnekler, loş ışık koşulları altında oda sıcaklığında 24 saate kadar saklanabilir.

Kan örneklerini oda sıcaklığında, frenleme kapatılmış halde 3000 RPM'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Örnekler santrifüj edildikten sonra, mononükleer hücreleri içeren buffy coat tabakasını rahatsız etmemeye dikkat ederek plazmayı tüplerin üst kısmından alın. Hücreleri yıkamak için, buffy coat'u ve altındaki eritrosit peletini oda sıcaklığındaki serumsuz RPMI medium içerisinde resüspande edin ve karışımı nazikçe pipetleyerek askıya alın.

Ardından hücreleri toplama tüpünden 50 mililitrelik konik tüpe aktarın. Hacmi RPMI ile 50 mililitreye tamamlayın ve karıştırmak için her tüpü nazikçe tersyüz edin. Hücreleri bir kez daha 3000 RPM'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.

Ardından, hücre peletinile bozmamaya dikkat ederek süpernatanı aspire edin. Kontaminantları uzaklaştırmak ve hücreye bağlı sitokinleri elimine etmek için bu yıkama adımını iki ila dört kez tekrarlayın; hücreler yıkandıktan sonra, toplam hacim 20 mililitre olacak şekilde serumsuz RPMI ile yeniden süspande edin. Hücreleri saymak için, numune ve akridin oranjın bir-bir oranındaki karışımından 20 mikrolitreyi tek kullanımlık bir soter görüş odasına yükleyin. Final konsantrasyonu 1 mikrogram/mililitre olarak kullanılan akridin oranj, yalnızca çekirdekli beyaz kan hücrelerini boyayarak onların kırmızı kan hücrelerinden ayırt edilmesini sağlar.

Hücre sayımı yapıldıktan sonra sadece D pozitif hücreleri sayın. Mililitre başına 2 milyon hücre nihai konsantrasyonuna ulaşmak için örnekleri serumsuz RPMI içinde yeniden süspande edin. Test edilecek deneysel koşullara göre, her örnek için 24 kuyucuklu bir plaka üzerinde çift kuyucukları etiketleyin.

Bu durumda koşullar; uyarılmamış, yalnızca LPS, yalnızca a TP ve LPS artı a TP şeklindedir. Her kuyucuğa bir mililitre seyreltilmiş hücre ekleyin ve uygun kuyucuklara son konsantrasyonu bir mikrogram/mL olacak şekilde LPS ekleyin. Numuneleri 37 °C'de, %5 karbondioksit inkübatöründe iki saat 40 dakika boyunca inkübe edin. Bu ilk inkübasyon süresinden sonra, yalnızca a TP ve LPS artı a TP içeren kuyucuklara son konsantrasyonu iki milimolar olacak şekilde a TP ekleyin. Ardından plakaları 37 °C'de 20 dakika daha inkübe edin.

İkinci inkübasyon tamamlandığında, her kuyuktaki hücreleri önceden etiketlenmiş ayrı 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine aktarın, numuneleri oda sıcaklığında iki dakika boyunca 10.000 RRP M hızında santrifüjleyin ve ardından her tüpteki süpernatantı yeni, önceden etiketlenmiş bir EOR tüpüne aktarın. Süpernatant anında sitokinler için analiz edilebilir veya IL 1β veya diğer sitokinlerin konsantrasyonlarını değerlendirmek için dondurulmuş olarak saklanabilir. Numunelerde, Bio Plex 200 sistemi ile Bio Plex Pro, human cytokine X plex kullanıyoruz.

Üretici talimatlarına göre. Bu şekilde, normal tam kan hücrelerinin LPS, ATP veya her iki stimülasyonla birlikte uyarılması üzerine IL-1β üretiminin analizi, miktarı uyarılan hücre sayısına bağlı olan bir LPS artı ATP yanıtı göstermektedir. Sağlıklı kontrollerin aksine, otoenflamatuar patolojiler sergileyen hastalardan alınan tam kan analizleri, eksojen olarak eklenmiş ATP yokluğunda, LPS stimülasyonu sonrası artmış IL-1β üretimi ortaya koymaktadır. Kan gibi insan vücut sıvılarıyla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman evrensel önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.