Name: Hazırlanması ve kullanımı, HIV-1 Enfekte İlköğretim CD4 + T-Hücreleri Hedef Hücreler olarak Natural Killer Hücre Sitotoksik Tahliller (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-14T11:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Öğrenin, HIV-1 enfekte CD4+ T hücrelerini hedef olarak kullanarak doğal öldürücü hücre sitotoksisite testlerinin nasıl hazırlanıp uygulanacağını. Bu yöntem, NK hücre yanıtlarını değerlendirmek için yüksek saflıkta hedef hücre izolasyonu sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<ol><li>Ruscetti, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+effector+mechanisms+against+HTLV-I-+and+HTLV-III%2FLAV-infected+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of effector mechanisms against HTLV-I- and HTLV-III/LAV-infected lymphoid cells.</a> J Immunol. 136, 3619-3624 (1986).</li>
<li>Zheng, Z. Y., Zucker-Franklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apparent+ineffectiveness+of+natural+killer+cells+vis-a-vis+retrovirus-infected+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Apparent ineffectiveness of natural killer cells vis-a-vis retrovirus-infected targets.</a> J Immunol. 148, 3679-3685 (1992).</li>
<li>Ferrari, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clade+B-based+HIV-1+vaccines+elicit+cross-clade+cytotoxic+T+lymphocyte+reactivities+in+uninfected+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Clade B-based HIV-1 vaccines elicit cross-clade cytotoxic T lymphocyte reactivities in uninfected volunteers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 1396-1401 (1997).</li>
<li>Shankar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+function+of+circulating+HIV-specific+CD8%28%2B%29+T+cells+in+chronic+human+immunodeficiency+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Impaired function of circulating HIV-specific CD8(+) T cells in chronic human immunodeficiency virus infection.</a> Blood. 96, 3094-3101 (2000).</li>
<li>Ward, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Vpr+triggers+natural+killer+cell-mediated+lysis+of+infected+cells+through+activation+of+the+ATR-mediated+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Vpr triggers natural killer cell-mediated lysis of infected cells through activation of the ATR-mediated DNA damage response.</a> PLoS Pathog. 5, e1000613-e1000613 (2009).</li>
<li>Ward, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+modulates+the+expression+of+ligands+important+in+triggering+natural+killer+cell+cytotoxic+responses+on+infected+primary+T-cell+blasts%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">HIV modulates the expression of ligands important in triggering natural killer cell cytotoxic responses on infected primary T-cell blasts.</a> Blood. 110, 1207-1214 (2007).</li>
<li>Bonaparte, M. I., Barker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killing+of+human+immunodeficiency+virus-infected+primary+T-cell+blasts+by+autologous+natural+killer+cells+is+dependent+on+the+ability+of+the+virus+to+alter+the+expression+of+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Killing of human immunodeficiency virus-infected primary T-cell blasts by autologous natural killer cells is dependent on the ability of the virus to alter the expression of major histocompatibility complex class I molecules.</a> Blood. 104, 2087-2094 (2004).</li>
<li>Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+mechanisms+in+cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Secretory mechanisms in cell-mediated cytotoxicity.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 495-517 (2007).</li>
<li>O'Doherty, U., Swiggard, W. J., Malim, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+spinoculation+enhances+infection+through+virus+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding.</a> J Virol. 74, 10074-10080 (2000).</li>
<li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> J Immunol Methods. 294, 15-22 (2004).</li>
<li>Fogli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysis+of+endogenously+infected+CD4%2B+T+cell+blasts+by+rIL-2+activated+autologous+natural+killer+cells+from+HIV-infected+viremic+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Lysis of endogenously infected CD4+ T cell blasts by rIL-2 activated autologous natural killer cells from HIV-infected viremic individuals.</a> PLoS Pathog. 4, e1000101-e1000101 (2008).</li>
<li>Tomescu, C., Chehimi, J., Maino, V. C., Montaner, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cell+lysis+of+HIV-1-infected+autologous+CD4+primary+T+cells%3A+requirement+for+IFN-mediated+NK+activation+by+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">NK cell lysis of HIV-1-infected autologous CD4 primary T cells: requirement for IFN-mediated NK activation by plasmacytoid dendritic cells.</a> J Immunol. 179, 2097-2104 (2007).</li>
<li>Ward, J. P., Bonaparte, M. I., Barker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA-C+and+HLA-E+reduce+antibody-dependent+natural+killer+cell-mediated+cytotoxicity+of+HIV-infected+primary+T+cell+blasts%5BTitle%5D)+AND+%22Aids%22%5BJournal%5D)">HLA-C and HLA-E reduce antibody-dependent natural killer cell-mediated cytotoxicity of HIV-infected primary T cell blasts.</a> Aids. 18, 1769-1779 (2004).</li>
</ol>

Doğru yapıldığı zaman bu protokolü açıklanan Testler karşı degranüle ve HIV-1 enfekte olmuş hücreleri (bkz. Şekil 5) lyse NK hücreleri yeteneğini temsil eden bir resim sağlamalıdır. HIV ile enfekte olan hücreleri ve NK hücreleri lizis HIV ile enfekte olan hücreleri yanıt NK hücre degranülasyonu 10 doğru orantılı olmalıdır. HIV ile enfekte hücreleri sitotoksik tepkilerini ölçmek için iki NK hücre fonksiyonel testleri için güvenilir sonuçlar son derece NK hücrelerinin yanı sıra, son derece saf bir nüfusun enfekte hücreleri saflaştırılmış izolasyonu bağlıdır. Saflaştırılmış sahip NK hücreleri ve HIV-1 ile enfekte hücreler oldukça doğru efektör hücre oranı hedefi, başarı için kritik öneme sahiptir. Benzer şekilde, ölü ve apoptotik hücreleri hedef hücre popülasyonlarının kaldırılması efektör hücreleri ile 51 Cr etiketleme veya inkübasyon öncesinde önemli 51 Cr izotop etiketleme adım sırasında ölü ya da apoptotik hücrelerin varlığı olarak apoptoz gören hücreler tarafından içselleştirilmiş olabilir yüksek spontan sürümde neden olacak ve hesaplanan% özel lizis bozar. Ayrıca, ölü ya da apoptotik hücrelerin varlığı, CD107a ifade anormal derecede yüksek düzeyleri NK hücre degranülasyonu tetikleyebilir. Hassas pipetleme 51 Cr serbest tayinlerde, NK hücreleri ve hedef hücrelerin kuluçka aşağıdaki hücre süpernatantlar çıkarırken, gerekli her çoğaltmak kaldırıldı süpernatant hacmi farklılıkları gibi yüksek standart sapma neden olacaktır . Değişiklikler önce belirli reseptörleri veya ligandlar 6,11 antagonist antikorlar ile ko-kültür effektör veya hedefleri kuluçka NK hücreleri, HIV ile enfekte olan hücreleri lizis tetiklenmesi belirli NK reseptörleri rolünü değerlendirmek için bu protokoller yapılabilir . Sitokin tedavi edilen NK hücreleri (örneğin, IL-2, IL-15), NK hücreleri uyarılır 12 işlevselliğini değerlendirmek için kullanılabilir. Benzer şekilde, bu protokolleri kullanarak antikor bağımlı hücre sitotoksisite testleri yapılabilir. Anti-HIV antikorların (örneğin, anti-gp120), NK hücre düşük afinite Fc reseptörü CD16 13 tarafından tanınması için hedef hücrelere eklenebilir . Bu deneyleri, HIV ile enfekte olan hücreleri NK hücre sitotoksik tepkileri ölçmek için kurulmuş olmasına rağmen aynı zamanda NK hücreleri, HIV ile enfekte hücre tanıma aşağıdaki sitokin üretme yeteneğini ölçmek için modifiye edilebilir. Biz bu protokolü in vitro enfekte olan hücreleri hedef hücreler olarak kullanımı tanımlanmış olsa da biz son nesil açıklanan hedef hücrelerin HIV ile enfekte olan hastaların var . Bu izolasyon CD4 + T-hücrelerinin hücrelerin genişlemesi, interlökin-2 (11) varlığında mitojenler ile uyarılmasını takiben bir iki hafta boyunca takip gerektirir. Genişleme iki haftalık bir süre sonra, bu makalede anlatılan protokoller hedef hücreleri izole etmek için kullanılır.

<table><tbody><tr><td>Vaccutainer Tüpleri (Sodyum Heparin)</td><td>BD Biosciences</td><td>367874</td><td></td></tr><tr><td>RosetteSep CD4+ T-hücre İzolasyon Kiti</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15062</td><td></td></tr><tr><td>CMF PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Lenfosit Ayırma Medyumu</td><td>Cellgro</td><td>25-072-CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Hyclone</td><td>SH30096.01</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Cellgro</td><td>25-005-Cl</td><td></td></tr><tr><td>T-hücre Ekspansiyon Kiti</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-441</td><td></td></tr><tr><td>CMF HBSS (1x)</td><td>Hyclone</td><td>SH30588.01</td><td></td></tr><tr><td>0.5M EDTA</td><td></td><td>46-034-Cl</td><td></td></tr><tr><td>NK Hücre Negatif İzolasyon Kiti</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-657</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12440-046</td><td></td></tr><tr><td>CD4+ Pozitif İzolasyon Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>113.31D</td><td></td></tr><tr><td>Ölü Hücre Uzaklaştırma Kiti</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-134220</td><td></td></tr><tr><td>CD3 PacificBlue</td><td>BD Biosciences</td><td>558117</td><td></td></tr><tr><td>CD14 PacificBlue</td><td>Biolegend</td><td>325616</td><td></td></tr><tr><td>CD20 PacificBlue</td><td>Biolegend</td><td>302328</td><td></td></tr><tr><td>CD56 APC</td><td>Biolegend</td><td>318310</td><td></td></tr><tr><td>CD69 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>555531</td><td></td></tr><tr><td>CD107a FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555800</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;51&lt;/sup&gt;Kromiyum</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NEZ030002MC</td><td></td></tr><tr><td>Gama Sayıcı Tüpleri</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>1270-401</td><td></td></tr><tr><td>2470 Otomatik Gama Sayıcı</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>2470-0050</td><td></td></tr><tr><td>FACS Diva</td><td>BD Biosciences</td><td>643629</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>Tree Star, Inc.</td><td>FJ-9-1YR</td><td></td></tr></tbody></table>

hazırlanması ve kullanımı, hiv-1 enfekte İlköğretim cd4 + t-hücreleri hedef hücreler olarak natural killer hücre sitotoksik tahliller

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Doğal öldürücü (NK) hücreleri, virüsle enfekte olan hücreleri doğuştan gelen bağışıklık yanıtının hayati bir bileşendir. NK hücreleri, HIV ile infekte hücrelere karşı NK hücre fonksiyonu herhangi bir anormallik tespit, çünkü potansiyel olarak kendi sitolitik aktivitesini artıracak tedavilere yol açabilir HIV-1 enfekte hücreleri tanıma ve lyse yeteneğini anlamak için önemlidir. HIV ile enfekte olan birincil T-hücre patlamalar ziyade hedef hücreleri sitotoksisite deneyleri enfekte T-hücre hatları kullanmak için bir ihtiyaç vardır. T-hücre, hatta enfeksiyon olmadan, NK hücre lizis oldukça duyarlıdırlar. Ayrıca, hedef ve effektör hücre lizis neden olacaktır arasında uyumsuzlukları büyük doku uygunluk kompleksi sınıf önlemek için otolog birincil hücreler kullanmak için gerekli. Primer HIV ile enfekte olan hücreleri NK hücre sitolitik yanıtları değerlendiren ilk çalışmalar, enfekte olmuş hücreleri 1,2 önemli öldürme göstermek için başarısız oldu . Ancak, kullanarak, HIV-1 enfekte birincil NK hücre fonksiyonel analizde hedef hücreler olarak T hücreleri enfekte olmamış hücrelerdeki 3 kontamine varlığı nedeniyle zor olmuştur. Bu tutarsız enfekte hücrenin bulaşmamış hücre oranı donör NK hücre fonksiyonunu değişkenliği nedeniyle olmayabilir örnekleri arasında NK hücre öldürme varyasyon neden olacaktır. Bu nedenle, deneyler arasındaki hücre oranları 3,4 hedef efektör standardize etmek amacıyla bir saflaştırılmış enfekte hücrenin nüfusu ile çalışmak faydalı olacaktır. İşte biz, ölü ya da ölmekte olan hücrelerin 3-6 kaldırmak için, HIV-1 yeteneğini enfekte olmuş hücreleri ve ticari kitleri durumu aşağı modüle CD4 yararlanarak HIV-1 enfekte olmuş hücreleri, son derece saf bir nüfusun izolasyon göstermektedir. Saflaştırılmış enfekte birincil T-hücre patlamalar sonra nüfus olarak 5-7 efektör NK hücreleri saflaştırılmış bir degranülasyonu veya sitotoksik tahlil ya da hedef olarak kullanılabilir. NK hücreleri degranülasyonu tayininde effektör olarak kullanın 8 &quot;sitolitik granül&quot; olarak adlandırılan uzman lizozomlar litik içeriğini serbest bırakmak için bir NK hücre yeteneğini değerlendirir. Florokrom CD107a sitolitik granül plazma membranına sigorta NK hücre yüzeyinde eksprese olan bir lizozomal membran proteini karşı konjuge antikor ile boyanarak hücre tanıma hedef yanıt degranüle NK hücrelerinin yüzde belirleyebilirsiniz. Alternatif olarak, NK hücre litik aktivite, hedef hücreleri, NK hücreleri varlığı hedef hücre içinde 51 Cr salınımı ile parçalanmış yüzdesi tayini için izin veren bir sitotoksik tayininde değerlendirilebilir.

Sitotoksisite deneyleri, HIV bulaşmış hücrelerin doğal öldürücü hücre litik tepkileri ölçmek için hedef hücreler saflığı ile sınırlıdır. Biz burada, HIV-1 yeteneğini CD4 aşağı modüle yararlanarak HIV-1 ile enfekte birincil T-hücre patlamaların son derece saf bir nüfusun izolasyon göstermektedir.

Hazırlanması ve kullanımı, HIV-1 Enfekte İlköğretim CD4 + T-Hücreleri Hedef Hücreler olarak Natural Killer Hücre Sitotoksik Tahliller

Doğal öldürücü (NK) hücreler, virüsle enfekte olmuş hücrelere karşı gelişen doğal bağışıklık yanıtının hayati bir bileşenidir. NK hücrelerinin ... yeteneğini anlamak önemlidir.

Bu prosedürün genel amacı, NK hücrelerinin HIV-1 enfekte hücrelere karşı sitotoksik yanıtını değerlendirmektir. Bu işlem, öncelikle venöz kandan CD4 pozitif T hücrelerinin izole edilmesi ve enfekte edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, aynı donörden doğal katil hücreler izole edilir.Ardından, enfekte olmamış CD4 pozitif T hücreleri, enfekte hücrelerden ayrıştırılarak izole edilir. Son olarak, NK hücrelerinin sitotoksisitesini değerlendirmek için iki deneyden birinde enfekte hücreler hedef, NK hücreleri ise efektör olarak kullanılır. Nihayetinde, akış sitometrik analizle belirlenen CD107a ekspresyonunun artışı veya gama sayıcı ile tespit edilen kromyum 51 salınımı yoluyla, NK hücrelerinin HIV-1 enfekte hücrelere yanıt verebildiğini gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bu yöntem, NK hücrelerinin HIV-1 enfekte hücrelerine yanıt verip vermediği ve NK T-hücresi etkileşimlerinde hangi reseptör ligand etkileşimlerinin önemli olduğu ile HIV-1 viral proteinlerinin NK hücrelerinin HIV-1 enfekte hücrelere verdiği yanıtı modüle edip etmediği gibi HIV-1 alanındaki temel sorulara yanıt verebilir. İnsan periferik kanından izole edilen ve anti-CD3, anti-CD28 kuplu boncuklarla 72 saat boyunca stimüle edilen CD4 pozitif T hücrelerini stimüle ettikten sonra, ortaya çıkan T hücresi popülasyonunu hemositometre ile sayın ve ardından kültürü iki gruba ayırın; enfekte edilmemiş kontrol grubu olarak kullanmak üzere yaklaşık 2 × 10⁶ T hücresini 15 ml'lik konik tüpe aktarın ve CD4 pozitif T-hücresi süspansiyonunun geri kalanını enfeksiyon grubu için 50 ml'lik konik tüpe yerleştirin.Her iki grubu 22 °C'de 300 G'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin ve ardından süpernatantı aspire edin. 50 mL'lik tüpteki CD4 pozitif T hücrelerini, virüsler içeren kültür sıvılarına doğrudan süspande edin ve final konsantrasyonu 10 mg/mL olacak şekilde polybrene ekleyin. Ardından hücreleri 20 ila 25 °C'de iki saat boyunca 1200 × G'de spin enfeksiyona tabi tutun.Burada hücreler, beş katlı bir enfeksiyon oranıyla (multiplicity of infection) DHIV three ile enfekte edilmektedir. Spin enfeksiyonu tamamlandığında, süpernatantı uzaklaştırın ve enfekte hücreleri, mililitre başına 3 × 10⁶ yoğunlukta, 100 unit/mL IL two ile desteklenmiş tamamlayıcı RPMI içinde yeniden süspanse edin.Ardından, enfekte edilmemiş hücreleri ve yeni enfekte edilmiş hücreleri altı kuyucuklu bir plakada 72 saat boyunca kültüre edin. Eğer hücreleri enfekte etmek için replikasyon yeteneği olmayan bir virüs kullanılmışsa 72 saat, replikasyon yeteneği olan bir virüs kullanılmışsa beş ila yedi gün bekleyin; enfekte CD4 pozitif T-hücre kültürlerini içeren süpernatantı toplayın ve hücreleri 22 °C'de, fren açık şekilde, 10 dakika boyunca 300 G'de santrifüjleyin. Süpernatantı aspire edin ve pelletleri %2 FBS ve 2 mM EDTA içeren 2 mL PBS içinde yeniden süspanse edin; hücreleri, bir CD4 pozitif izolasyon kiti kullanarak hemositometre ile sayın.CD4 pozitif enfekte olmamış T hücrelerini ayırın. CD4 pozitif T hücrelerinin izolasyonu için, 1 anti-CD4 bep/hücre oranının kullanılması istisnası dışında, üreticinin talimatlarını izleyin. Ardından, bir ölü hücre giderme kiti kullanarak saflaştırılmış virüs taşıyan hücre popülasyonundan ölü hücreleri uzaklaştırın.Üretici talimatlarına uygun olarak, canlı T-hücresi popülasyonunu toplayın ve saflaştırılmış hücreleri 300 G'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Frenleme sırasında supernatantı uzaklaştırın, peleti 1 mL RPMI complete içerisinde süspanse edin ve hücreleri sayın. Periferik kan NK hücreleri, CD4 pozitif T hücreleri ile aynı donörden izole edilir.Gece boyu süren kültürlemeden sonra, NK hücrelerini bir hemositometre ile sayın; fren açık konumdayken 300 G'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin ve ardından hücreleri, final konsantrasyonu 10⁶ hücre/mL olacak şekilde ayarlayarak tamamlanmış RPMI içinde yeniden süspande edin. Daha sonra, saflaştırılmış, enfekte edilmiş ve kontrol amaçlı enfekte edilmemiş T-hücresi süspansiyonlarını toplayıp 300 G'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Fren açıkken süpernatantı uzaklaştırın ve peletleri yeniden süspande edin.Pozitif kontrol için mL başına 2 × 10⁶ hücre konsantrasyonundaki tamamlayıcı RPMI içerisinde, NK lizine duyarlı yaklaşık 2 × 10⁶ K 5 62 hücresi bu videoda kullanılmıştır. K 5 62 hücrelerini, fren kapalıyken 300 G'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin, ardından supernatantı uzaklaştırın ve peleti mL başına 2 × 10⁶ hücre konsantrasyonundaki tamamlayıcı RPMI içerisinde yeniden süspanse edin.Tüm hücre popülasyonları yıkandıktan ve deneysel konsantrasyonlarında yeniden süspanse edildikten sonra, NK hücrelerini K 5 62 hücreleri, enfekte olmamış T hücreleri veya HIV enfekte T hücreleri ile birlikte yerleştirin. Spesifik olmayan NK hücresi degranülasyonunu ölçmek için, 96 kuyucuklu V tabanlı bir plakanın münferit kuyucuklarında, hedef hücre tipi başına yalnızca bir replika kullanılacaktır. Bir tanesine 100 µL NK efektör hücresi ve 100 µL sadece besiyeri ekleyin.Her bir kuyuya 10 µL hacminde florokrom konjuge anti CD 107 A antikoru ekleyin ve plakayı 22 °C'de, fren açık şekilde 20 G'de iki dakika santrifüjleyin. Ardından plakayı 37 °C'de ve %5 CO2 ortamında dört saat inkübe edin; inkübasyon sonrası plakayı 22 °C'de, fren açık şekilde 400 G'de beş dakika santrifüjleyin ve ardından P 200 uç takılmış 2 mL'lik bir aspirasyon pipeti kullanarak süpernatantı uzaklaştırın.Ardından, her bir kuyucuğa 100 µL akış tamponu ekleyin ve ardından hücreleri buz üzerinde 20 dakika boyunca anti CD 3 14 20 Pacific blue antikorları ve anti CD 56 A PC antikoru ile boyayın. Hücreler boyandıktan sonra, her kuyucuğa 200 µL akış tamponu ekleyin ve plakayı 400 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Fren açıkken 22 °C'de, akış tamponunu her bir kuyucuktan dikkatlice aspire edin.200 µL'lik bir mikropipet ucu takılmış iki mL'lik bir aspirasyon pipeti kullanarak, pelete zarar vermediğinizden emin olarak hücreleri tekrar yıkayın ve ardından peletleri 200 µL kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS içindeki %1 paraformaldehit ile resüspande edin. Son olarak, hücre süspansiyonlarını akış tüplerine aktarın ve her birine yaklaşık 100 µL kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS içindeki %1 paraformaldehit ekleyerek tüplerdeki toplam hacmi 300 µL'ye tamamlayın. Ardından, FACS Diva yazılımını kullanarak akış sitometrisi ile 2 × 10⁴ NK hücresi olayını okuyun ve verileri FlowJo yazılımı ile analiz edin; pozitif kontrol olarak, saflaştırılmış HIV V1 enfekte ve enfekte olmamış T hücresi hedeflerini 15 mL'lik konik bir tüp içerisinde 37 °C'de ve %5 CO2 ortamında iki saat boyunca 10⁶ hücre başına salinde 125 µCi krom 51 ile işaretleyin, ayrıca 10⁶ K 562 hücresini iki saat boyunca 100 µCi krom 51 ile işaretleyin.Aynı kültür koşulları altında. Her hücre popülasyonu için boyama solüsyonunun nihai hacmini 500 µL'ye tamamlamak için RPMI complete kullanın. Hedef hücrelere eklenen kromyum 51 hacmi, hedef hücreler etiketlenirken PerkinElmer web sitesinde bulunan evrensel radyoaktif bozunma hesaplayıcısı kullanılarak hesaplanır.Daha önce izole edilmiş NK hücrelerini kültürden çıkarın ve sayılarını belirleyin; NK hücrelerini, fren açık konumdayken 10 dakika boyunca 300 G'de santrifüjleyin ve peletleri tamamlayıcı RPMI içinde yeniden süspande edin. Elde edilen hücre süspansiyonlarını üç adet 15 mL'lik konik tüpe bölün. Hücre yoğunluğunu birinci tüpte 10⁵/mL, ikinci tüpte 2,5 × 10⁵/mL ve üçüncü tüpte 5 × 10⁵/mL olacak şekilde ayarlayın. NK hücreleri, kromyum 51 salınım testi sırasında sırasıyla 1:1, 2,5:1 ve 5:1 oranlarında efektör hücreler olarak kullanılacaktır.Etiketlenmiş hedef hücreleri inkübatörden çıkarın ve her tüpe 4,5 mililitre tamamlanmış RPMI ekleyin. Tüpleri 300 G'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, peleti bozmadan süpernatantı dikkatlice radyoaktif sıvı atık konteynerine dökün.Absorbe edilmemiş tüm krom 51'i uzaklaştırmak için hedef hücreleri iki kez daha yıkayın. Üçüncü yıkamadan elde edilen süpernatan, radyoaktif olmayan sıvı atık konteynerine dökülebilir. Şimdi, krom 51 salım testi için tipik bir düzenek örneği olarak gösterilen, mililitre başına 10⁵ olan nihai hücre yoğunluğuna ulaşacak şekilde hedefleri RPMI complete içerisinde yeniden süspande edin.Her bir grubun üç tekrarlı olarak yapıldığını unutmayın; her bir kuyucukta toplam 10⁴ hedef hücre olacak şekilde, etiketlenmiş hedef hücrelerden 100 µL'lik alikotları 96 kuyucuklu V tabanlı bir plakadaki belirtilen kuyucuklara ekleyin. Ardından, NK süspansiyonlarından 100 µL'yi, uygun şekilde belirtilen efektör-hedef hücre oranlarında hedef hücrelerin üzerine ekleyin. Daha sonra, maksimum ve spontan salınım grupları için, efektör hücrelerin bulunmadığı ilgili kuyucuklara 100 µL hedef hücre ekleyin.Spontan salınım grubuna ek olarak 100 µL RPMI complete ekleyin, plakayı fren açık şekilde 20 G'de iki dakika boyunca santrifüj edin ve ardından plakayı 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında dört saat boyunca inkübe edin. Dört saatlik inkübasyonun ardından, maksimum salınım kuyucukları hariç her bir kuyucuğa, insan eritrositlerinin RPMI complete içindeki 1/10 dilüsyonundan 5 µL ekleyin; ardından maksimum salınım kuyucuklarına 100 µL %10 sodyum dodekil sülfat ekleyin ve plakayı 400 G'de beş dakika boyunca santrifüj edin. Hücreleri pelletlemek için, deneysel ve kontrol kuyucuklarının her biri için bir gama sayacı tüpünü etiketleyin.96 kuyucuklu plaka üzerindeki her bir kuyucuktan 100 µL hücre içermeyen süpernatant hasat edin ve her kuyucuktaki süpernatantı önceden etiketlenmiş tüplere yerleştirin. Her tüpteki chromium 51 miktarını bir PerkinElmer 24 70 otomatik gama sayıcısında ölçün. Aşağıdaki dağılım grafikleri, bir CD 1 0 7 sonuçlarını analiz etmek için tipik bir akış sitometrik kapılama stratejisini göstermektedir.Bir degranülasyon analizi. İlk olarak, FSCA'ya karşı FSCH grafiği üzerinde kümelenmeler veya dubletler hariç tutularak tek hücreler kapısı belirlenir. Ardından, FSCA'ya karşı SSC olarak çizilen tek hücre kapısı, yine pembe oval ile belirtilen lenfosit popülasyonu üzerinde kapılanır.Ardından lenfosit kapısı, dikey pembe oval ile belirtilen CD 56 pozitif ve CD 3 14 20 negatif popülasyonu üzerine kapama yapılarak CD 3 14 20'ye karşı CD 56 olarak çizilir. Burada NK GA, sonraki iki şekilde degranüle olmuş NK hücrelerini görselleştirmek için CD 1 0 7 A'ya karşı CD 56 olarak çizilmiştir; burada doğal öldürücü hücrelerin HIV 1 enfekte hücrelere karşı sitotoksik yanıtının değerlendirilmesinden elde edilen temsili sonuçlar gösterilmektedir. NK hücreleri, yüzey CD 1 0 7 A eksprese eden NK hücrelerinin yüzdesi ile değerlendirilerek, hedef hücreler olmadan ve K 5 62 hücrelerine, primer CD 4 pozitif T hücrelerine ve HIV enfekte primer T hücrelerine yanıtlardaki degranülasyon yetenekleri açısından değerlendirilmiştir. Her bir kadrandaki sayılar, bu şekildeki toplam NK hücrelerinin yüzdesini temsil etmektedir.NK hücrelerinin K 5 62 hücrelerini, enfekte olmamış CD four pozitif T hücrelerini ve HIV one enfekte T hücrelerini lizleme yetenekleri, efektör hücre hedef hücre oranlarının 2.5'e 1, 5'e 1 ve 7.5'e 1 olduğu acromium 51 salınım testi ile geliştirme aşamasından sonra değerlendirilmiştir. Bu teknik, HIV V one biyolojisi alanındaki araştırmacıların, HIV enfekte hastalarda doğal öldürücü hücrelerin HIV one enfekte hücrelere nasıl yanıt verdiğini keşfetmelerine ön ayak olmuştur.

preparation-use-hiv-1-infected-primary-cd4-t-cells-as-target-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu görüntülenmiştir deney canlı konfokal görüntüleme deneyleri için HIV floresan moleküler klon kullanan için bir rehber.

HIV ve Live Konfokal Mikroskop Floresan Klonlar kullanılarak HIV görselleştirme Hücre-hücre Transferi

Nanomole afinite ile HIV 1BA-L gp120 karşı çeşitli 2'-Fluoro RNA aptamers bir RNA kütüphanesi ile izole edilmiştir.

Hücre tipi siRNA teslimat için özel anti-HIV gp120 aptamers Geliştirme

Bu video, hedef kanser hücrelerine karşı doğal öldürücü (NK) hücrelerin sitotoksisitesini belirlemek için bir laktat dehidrojenaz salım testinin gerçekleştirilmesini göstermektedir. Test, oluşan kırmızı renkli ürünün absorbansını ölçerek sitoplazmik laktat dehidrojenaz enziminin kanser hücrelerinden salınmasını ölçer.

Kanser Hücrelerine Karşı Doğal Öldürücü Hücre Sitotoksisitesini Değerlendirmek için İn Vitro Test

CD4+ Regülatör T hücreleri güçlü immün modülatörlerdir ve immün homeostazda önemli işlevlere hizmet ederler. Bu hücrelerin periferik kandaki azlığı, özellikle HIV-1 enfeksiyonu bağlamında fonksiyonel çalışmaları zorlaştırır. Burada, HIV-1 ile enfekte bireylerden alınan periferik kandan fonksiyonel CD4 + Treg'leri izole etmek ve genişletmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Yeni Araçlar HIV-1 ile enfekte bireyler gelen Düzenleyici T hücreleri büyütmek için

Biz HIV-spesifik CD4 T hücreleri tarafından sitokin salgılanmasının düzenlenmesinde immünregulatuar yolların rolünü araştırmak için bir in vitro testi geliştirdi.

Vitro Testi HIV-spesifik CD4 T hücre efektör işlevi üzerinde immünoregülatör yolları etkisini değerlendirmek için

Hücre içermeyen HİV-1 parçacıklarına farklı olarak, enfekte olmuş CD4 + T hücrelerinin etkili bir plazmasitoid dendritik hücreler (PDC) ile algılanır. Bu yazıda tip I IFN serbest bırakılması ile değerlendirilen periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) ya da izole edilmiş bir PDC pDC'lerde ile doğuştan gelen algılamayı değerlendirmek için, HIV-1 ile enfekte edilmiş T hücreleri ile birlikte-kültür, bir yöntem tarif eder.

HIV-1 Enfekte CD4 Doğuştan Algılama Değerlendirilmesi<sup&gt; +</sup&gt; Bir kullanılması plazmositoid dendritik hücreler tarafından T Hücreleri<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-kültür sistemi.

Bu çalışmanın amacı hücrelerdeki birincil doğal öldürücü (NK) başarılı gen iletim için izin teknolojileri formüle etmek oldu. İnsan lentiviral iletim dextran aracılı veya fare birincil NK hücreleri sonuçlarında yüksek gen ifade verimliliği. Bu yöntemi, gen iletim NK hücre genetik manipülasyon büyük ölçüde artıracaktır.

Dextran fare ve insan birincil NK hücreleri Lentiviral iletim verimliliğini artırır

Kantitatif insan doğal katil hücrelerin sitotoksik etkinliğini belirlemek için Akış Sitometresi tabanlı yöntemi burada gösterilir.

Akış Sitometresi tabanlı sitotoksisite tahlil insan NK hücre etkinliği değerlendirilmesi için

NK ve T Hücre klonlar CAEBV hastalardan elde etmek için basit bir yöntem yüksek verimlilik, periferik kan küçük bir miktar ve düşük doz IL-2 ile geliştirilmiştir.

NK ve kronik aktif Epstein - Barr virüsü enfeksiyonu olan hastalarda T hücre satırlarından kurmak için etkili ve basit bir yöntem

Burada, sitotoksisik T lenfosit (CTL) yanıt olarak bir model tümör antijeni için immundominance muayene sağlayan bir akış sitometri tabanlı in vivo öldürme tahlil tarif. Biz bu zarif tahlil mekanik çalışmalar için ve ilaç etkinliği test için istihdam olabilir nasıl örnekler sunuyoruz.

Tümör-spesifik CD8+ T hücre tepkiler Immunodominance çalışması Için In vivo sitotoksisite assays terzilik

Burada, özellikle HIV-1 enfeksiyonuna vurgu yaparak, endoplazmik retikulum (ER) stresini ve katlanmamış protein yanıtı (UPR) aktivasyonunu belirlemek için bazı yerleşik yöntemleri açıklıyoruz. Bu makalede ayrıca ER stresi/UPR'nin HIV-1 replikasyonu ve virion enfektivitesi üzerindeki etkisini araştırmak için bir dizi protokol açıklanmaktadır.

HIV-1 ile Enfekte T Hücrelerinde Endoplazmik Retikulum Stresi ve Katlanmamış Protein Yanıtının Ölçülmesi ve HIV-1 Replikasyonundaki Rolünün İncelenmesi

Öğrenin, HIV-1 enfekte CD4+ T hücrelerini hedef olarak kullanarak doğal öldürücü hücre sitotoksisite testlerinin nasıl hazırlanıp uygulanacağını. Bu yöntem, NK hücre yanıtlarını değerlendirmek için yüksek saflıkta hedef hücre izolasyonu sağlar.

Hazırlanması ve kullanımı, HIV-1 Enfekte İlköğretim CD4 + T-Hücreleri Hedef Hücreler olarak Natural Killer Hücre Sitotoksik Tahliller (Video) | JoVE Journal

Hazırlanması ve kullanımı, HIV-1 Enfekte İlköğretim CD4 + T-Hücreleri Hedef Hücreler olarak Natural Killer Hücre Sitotoksik Tahliller

Daha fazla video keşfet