Name: Membran Protein katlanması, Termodinamik Floresans Spektroskopisi ile ölçülür. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Öğrenin, membran protein katlanmasının termodinamiğini triptofan floresans spektroskopisi ile ölçme yöntemini. Küçük LAR vezikülleri kullanılarak Gibbs serbest enerjisi hesaplanır ve protein stabilitesi analiz edilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pekin Wu Biz onu veri kullanımı için teşekkür ederim. Bu çalışma, NSF KARİYER Jek için bir ödül tarafından desteklenen

1. Membran Protein katlanması için ~ 50 nm Çapı Küçük Unilamellar veziküller (SUV) hazırlanması <ol><li> 1,2-dimyristoyl-sn-Glycéro-3-Phosphocholin (DMPC) kloroform lipidlerin bir çözüm başına 20 mg flakon miktarlarda depolama için satın alınan ve temiz bir cam şişe içine aliquotted. Azot gazı bir katman yağ oksidasyonunu önlemek için her flakon eklenir ve kapaklar ve parafilm şişeleri ile mühürlenir. Şişeler, kullanılıncaya kadar -20 ° C derin dondurucuda saklanır. </li><li> Kloroform 20 mg lipid bir kısım içeren tek bir flakon, her bir deney için kullanılır. Flakon içeriği, hiçbir solvent kalana kadar 1 saat boyunca azot gazı akışı ile kurutulur. </li><li> Kurutulmuş lipidler, 1 ml 20 mM potasyum fosfat tamponu yeniden süspanse ~ 30 saniye boyunca bir su banyosunda sonikatör kullanarak (pH = 7.3). Bu çözüm, askıya lipid bulanık görünür ve konik bir alt 15-ml plastik bir tüpe aktarılır. Lipid başlangıçta yer alan boş cam şişe 1 ml fosfat tampon diğer kısım eklenir ve sonication tekrarlanır; çözüm daha sonra 15 mL aynı tüpe eklenir. Bu süreç, bir lipid konsantrasyonu 5 mg / ml bu hisse vezikül çözüm ile sonuçlanan tüp nihai hacmi, 4 mL kadar toplam 4 kez tekrarlanır. </li><li> 4 mL hacimdeki lipid vezikül çözüm yerleştirilir sıcak (~ 30 ° C) su banyosu, ve 1 saat süreyle% 50 görev döngüsü ultrasonicator mikrotip kullanarak sonicated. Su banyosunda iki amacı vardır. İlk olarak, sonication süreci nedeniyle çok sıcak hale gelen lipid çözümü engeller. İkincisi, sıcak banyo sulu lipid çözüm sıcaklık sonication sırasında çift katlı faz geçiş sıcaklığı üzerinde kalmasını sağlar; DMPC için, bu geçiş sıcaklığı ~ 23 ° C </li><li> Sonicated çözüm sonikatör ucundan enkaz kaldırmak ve bu filtre edilmiş solüsyon 37 geceleme dengelenmiş filtresi 0.22 mikron şırınga ° C geçirilir </li></ol> 2. İlk Floresan açılması Eğrisi için Numune Hazırlama <ol><li> 20 mM fosfat tamponu (pH 7.3), 10 M üre stok solüsyonu yapılır. Bu büyük miktarda üre çözümünde önemli bir hacim işgal eder, çünkü su katı (ve tersi) eklendi olması esastır. Bu üre çözeltisi temiz, boş şişe çözünenlerin ekleyerek ve amaçlanan nihai hacim su ekleyerek yapılabilir. Bu çözüm, bir su banyosu veya çözünen çözülür karıştırarak sıcak bir plaka üzerinde ısıtılması gerekebilir. Üre higroskopik ve bu nedenle, üre stok solüsyonu gerçek konsantrasyon, kırılma indisi kullanılarak tespit edilmelidir. 1 </li><li> 20 mM fosfat (pH 7.3) stok tampon çözeltisi yapılır. </li><li> Bir stok solüsyonu protein hazırlanan gelişeceğini. Bu stok protein çözümü 8 M üre, 20 mM fosfat tamponu ~ 200 mcM protein konsantrasyonu olmalıdır. </li><li> Floresan çalışmaları için örnekler şu şekilde hazırlanır. Uygun stok protein hacimleri (bölüm 2.3), lipid stok solüsyonu (5 mg / ml yağ, bölüm 1), hisse senedi 10 M üre çözeltisi (bölüm 2.1), ve stok fosfat tamponu (bölüm 2.2) ~ 4 içeren örnekler yapmak için bir araya mcM protein, 1 mg / ml yağ, 1 M artışlarla 0-8 M üre. Her numunenin toplam hacmi 200 mcL. Bir örnek tablo (Tablo 1) listeleri hacimleri 200 mcM stok protein solüsyonu kullanılarak gerekli olduğunu dahildir. </li><li> Boş örnekleri bölüm 2.4 'te açıklandığı gibi yapılır, ancak, protein eklendi değildir. Diğer bileşenlerin konsantrasyonları bölüm 2.4 'te aynı şekilde protein yerine, 8 M üre çözeltisi 4 mcL eklenebilir. Bu boşlukları, saçılma ve protein floresans spektrumları görünen diğer arka plan sinyali çıkarmak için kullanılır. </li><li> 2.4 ve 2.5 bölümleri örnekleri floresans spektrumları ölçümden önce tam katlama ve dengeleme sağlamak için en az 2 saat süreyle 37 ° C'de inkübe izin verilir. </li></ol> 3. Floresan Spectra ölçümü Istikrarlı bir devlet flüorometre kullanılarak her örnek ve boş Triptofan floresan ölçülür. Floresans spektrumları tirozin kalıntılarının uyarma önlemek için 290 nm dalgaboyu ile kaydedilen ve 305 ila 500 nm taranmış olmalıdır. Tipik giriş ve çıkış bant geçiren 3 nm. Dalga boyu arttırma ve entegrasyon süresi, sinyal-gürültü oranı için optimize edilebilir. Dalga boyu arttırma ve entegrasyon zamanı için tipik değerler, 1 nm / adım ve sırasıyla 0.5 sn / adım,. Membran sıcaklığı çift katlı faz geçiş sıcaklığı üzerinde sadece içine genellikle kat sentetik lipidler proteinler. Bu nedenle, DMPC bu durumda, 30 numunenin sıcaklığı sabit tutulur ° C. 160 mcL kapasitesine sahip bir microvolume erimiş silika küvet bu eski kullanılmaktadırperiments. 4. İlk açılım Eğrisi açılması Membran Protein Gibbs Serbest Enerji ve Kestirim Üretimi <ol><li> Xy veri formu Floresans spektrumları Igor Pro, Matlab, Kökeni, veya Excel gibi yazılım yüklenir. </li><li> Sinyal, üre ve lipid vezikül arka plan aşağıdaki yordamı kullanarak çıkarılır olmalıdır: Protein, lipid veziküller ve spesifik konsantrasyon üre varlığını = ham floresans spektrumu Spektrum. Spektrum B lipid veziküller ve aynı üre konsantrasyonu içeren ilgili boş örnek = ham floresans spektrumu bu kadar spektrumda; herhangi bir protein boş örnekleri. Düzeltilmiş Spektrum = Spektrum A - C * spektrum B. C, tipik olarak 1.0 'e eşit bir skaler. Bazı durumlarda, C, çünkü neden saçılma konularda daha az ya da 1.0 'dan büyük veya ~ 305-320 nm bölgeye yakın çıkarma altında. </li><li> Dalga boyu, λ maksimum, maksimum floresans spektrumları her üre konsantrasyonu için düzeltilmiş tablolaştırılmıştır. Tamamen için tipik bir değeri katlanmış proteini ~ 330 nm ise membran protein 350 nm gözler önüne seriliyordu. Tablo dalga boylarında gelişeceğini nüfusu kesir λ max değeri ilişkilendirmek için 1.0 ila 0.0 aralığında λ maksimum değerleri (~ 330 ~ 350 nm) aralığında dönüştürme gelişeceğini fraksiyonu dönüştürülür. Örneğin, 330 nm λ max değeri 0.0 karşılık gelen, 350 nm 1.0 'e karşılık gelir ve 340 nm fraksiyonu açısından 0.5' e karşılık katlanmamış. Bu gelişeceğini protein fraksiyonu sonra üre konsantrasyonu karşı çizilmiştir. Yukarıda belirtildiği gibi, üre konsantrasyonu, refraktif indeks ölçerek deneysel olarak tespit edilmelidir. </li><li> Biz iki devlet bir protein bulunabilir varsayalım: katlanmış veya katlanmamış. Kesir arsa f gelişeceğini, üre konsantrasyonu, C, karşı denkleme uygun olabilir: 2 <img src="/files/ftp_upload/2669/2669eq2.jpg" alt="Denklem 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Denklem 2"> Katsayısı m denaturant konsantrasyon açısından serbest enerji değişim oranına karşılık gelir ve C m katlanmış nüfus gelişeceğini nüfus eşit olduğu orta noktası üre konsantrasyonu karşılık gelir. Bu değerler R (0.001987 kcal / mol • K) gaz yasası sabittir. Oturan en küçük kareler elde edilen veri analiz yazılımı tarafından uydurma değişkenleri, ve T (303 K) sıcaklık. </li><li> Fit elde edilen katsayılar üre yokluğunda ortaya konma Gibbs serbest enerji (kcal / mol) belirlemek için kullanılır: <img src="/files/ftp_upload/2669/2669eq3.jpg" alt="Denklem 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Denklem 3"> . </li></ol> 5. Eğri açılması açılması, Gibbs Serbest Enerji Hassas Ölçüm için optimize edilmiştir. <ol><li> Yukarıda açıklanan açılımı eğrisi λ max en büyük değişiklik neden üre konsantrasyonlarının aralığı ortaya koymaktadır. Bu aralık, genellikle küçük ve unfolding çoğunluğu bu küçük aralık içinde gerçekleşir. Açılmadaki serbest enerji tam olarak belirlemek için, optimize edilmiş en küçük kareler montaj için gerekli birçok veri noktaları içeren bir arsa elde etmek için bu bölgede ek örnekler analiz edilir. Daha doğrusu, gözler önüne serilen eğrisi bu önemli bölgenin şeklini ortaya çıkarmak için 0.2 M artışlarla 4 M üre - Örneğin protein, 2 ve 4 M üre arasında gözler önüne serilir, örnekleri 2 içerdiğini yapılmış olabilir. Bu her üre konsantrasyonu boş spektrumları ölçmek için gerekli değildir; her ~ 0.5 M adım boş bir spektrumu ölçmek için yeterli. </li><li> Orijinal gözler önüne serilen eğrisi elde edilen bu arsa elde açılmadaki serbest enerji biraz farklı, ama daha kesin bir değer yansıtır. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar: <table border="1"><tbody><tr><td> Örnek </td><td> son [Üre], M </td><td> stok protein (mcL) </td><td> stok lipid (mcL) </td><td> stok 10 M üre (mcL) </td><td> stok tampon (mcL) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> ~ 0.16 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 0 </td><td> 156 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 1 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 20 </td><td> 136 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 40 </td><td> 116 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 60 </td><td> 96 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 80 </td><td> 76 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 5 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 100 </td><td> 56 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 6 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 120 </td><td> 36 </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 7 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 140 </td><td> 16 </td></tr></tbody></table> Tablo 1 floresan örnekleri yapmak için gereken stok çözelti hacmi <img src="/files/ftp_upload/2669/2669fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1: tek bir triptofan kalıntı içeren ~ 5 mcM temsilcisi membran proteini Triptofan floresans spektrumları. (A) Ham protein floresans spektrumları (spektrumu 4.2 'den A), (B) boş Ham floresans spektrumları (4.2 spektrum B), (C) 4.2 spektrum düzeltildi. <img src="/files/ftp_upload/2669/2669fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Sayısız üre konsantrasyonları için Şekil 1 Şekil 2 membran protein triptofan floresans spektrumları düzeltildi. <img src="/files/ftp_upload/2669/2669fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 Şekil 2 veri elde 4.4 'denklemine uygun eğri açılması. Gibbs serbest enerjisi, bölüm 4.5 'e göre hesaplanır.

<ol><li>Shirley, B. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShirley%2C+BA+%22Protein+Folding+and+Stability%22">Protein Folding and Stability</a>. Shirley, B. A. , Humana Press. 177-190 (1995).</li>
<li>Pace, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+and+Analysis+of+Urea+and+Guanidine+Hydrochloride+Denaturation+Curves%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Determination and Analysis of Urea and Guanidine Hydrochloride Denaturation Curves.</a> Methods Enzymol. 131, 266-279 (1986).</li>
<li>Lau, F. W., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+Assessing+the+Stability+of+a+Membrane+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A Method for Assessing the Stability of a Membrane Protein.</a> Biochemistry. 36, 5884-5892 (1997).</li>
<li>Burgess, N. K., Dao, T. P., Stanley, A. M., Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-Barrel+Proteins+that+Reside+in+the+Escherichia+coli+Outer+Membrane+in+Vivo+Demonstrate+Varied+Folding+Behavior+in+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">β-Barrel Proteins that Reside in the Escherichia coli Outer Membrane in Vivo Demonstrate Varied Folding Behavior in Vitro.</a> J. Biol. Chem. 283, 26748-26758 (2008).</li>
<li>Booth, P. J., Curnow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+scene+investigation%3A+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Folding scene investigation: membrane proteins.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 19, 8-13 (2009).</li>
<li>Hong, H., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+coupling+of+integral+membrane+protein+stability+to+lipid+bilayer+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Elastic coupling of integral membrane protein stability to lipid bilayer forces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4065-4070 (2004).</li>
<li>Sanchez, K. M., Gable, J. E., Schlamadinger, D. E., Kim, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Tryptophan+Microenvironment%2C+Soluble+Domain%2C+and+Vesicle+Size+on+the+Thermodynamics+of+Membrane+Protein+Folding%3A+Lessons+from+the+Transmembrane+Protein+OmpA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of Tryptophan Microenvironment, Soluble Domain, and Vesicle Size on the Thermodynamics of Membrane Protein Folding: Lessons from the Transmembrane Protein OmpA.</a> Biochemistry. 47, 12844-12852 (2008).</li>
</ol>

Mevcut protokol triptofan artıkları içeren membran ile ilişkili proteinler ve peptitler eğriler açılmadaki nesil açıklamaktadır. Burada, triptofan floresan protein ve sentetik lipid veziküller takılı katlanmış, ya da çözelti içinde gelişeceğini olup olmadığını yansıttığı varsayılır. Gibi iki-devletli katlama ve serbest enerji denaturant konsantrasyonu ile lineer bağımlılığı gibi ek varsayımları, cari rapor yapılır; farklı denklemler bu varsayımların sonucu değiştirilmesi 2 deney protokolünde farklı spektrosko...

<table><tbody><tr><td>DMPC</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>850345C</td><td></td></tr><tr><td>Üre</td><td>MP Biomedicals</td><td>04821527</td><td></td></tr><tr><td>Dibasik Potasyum Fosfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>P288</td><td></td></tr><tr><td>Monobazik Potasyum Fosfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285</td><td></td></tr></tbody></table>

membran protein katlanması, termodinamik floresans spektroskopisi ile ölçülür.

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Membran protein katlanması ve sağlıkla ilgili temel öneme sahip bir konudur. Membran proteinleri hücrelerin temelini bu proteinlerin her yerde aile katlanır kapsamlı bir çalışma için ihtiyaç bolluğu. Ayrıca, misfolded proteinler ile ilişkili hastalıklar karakterize yeteneğimizi gelişmeler, protein katlanması konusunda önemli deneysel ve teorik çabaları motive etmiş. Bu önemli alanda hızlı bir ilerleme maalesef, membran proteinleri ve katlama mekanizması karmaşıklığı ile ilişkili içsel zorluklar tarafından engellenmektedir. Burada, biz, E. bir temsilci integral membran proteini denaturant yokluğunda, Δ G ° H 2 O açılmadaki Gibbs serbest enerji termodinamik özelliği ölçmek için deneysel bir prosedür anahat coli. Bu protokol, denaturant konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak katlanmış ve gelişeceğini devletlerin denge nüfusu belirlemek için floresans spektroskopisi uygulanması üzerinde duruluyor. Sentetik lipid veziküller yanı sıra veri analizi prosedürü önemli adımlar hazırlanması için deneysel düşünceler vurgulanır. Bu teknik, çok yönlüdür ve denaturant sıcaklık ve pH yanı sıra lipidler ve miseller çeşitli katlanır ortamlar da dahil olmak üzere farklı tipleri ile takip edilebilir. Geçerli protokol kriterler aşağıda tartışılmıştır karşılayan herhangi bir membran veya çözünebilir protein jeneralize olabilir.

Bu video makalede, triptofan floresan membran protein katlanması Gibbs serbest enerji elde etmek için deneysel prosedür.

Membran Protein katlanması, Termodinamik Floresans Spektroskopisi ile ölçülür.

Membran protein katlanması, hem temel bilimler hem de sağlıkla ilgili öneme sahip, gelişmekte olan bir konudur. Hücrelerdeki membran protein bolluğu...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, membran protein katlanmasıyla ilişkili termodinamiği ölçmektir. Bu, öncelikle membran protein için bir katlanma ortamı sağlamak amacıyla küçük LAR vezikülleri bir araya getirilerek gerçekleştirilir. Veziküller oluşturulduktan sonra, protein ve sistematik olarak değiştirilen üre konsantrasyonlarını içeren örnekler hazırlamak için kullanılırlar.Ardından, her örneğin triptofan floresan spektrumu ölçülür. Bir membran protein açılım eğrisi oluşturmak için gereken verileri toplamak amacıyla, triptofan floresan spektrumlarından elde edilen açılım eğrilerine dayanarak membran protein açılımının Gibbs serbest enerjisinin nasıl elde edilebileceğini gösteren sonuçlar alınır. Merhaba, ismim Judy Kim. University of California at San Diego'da yardımcı profesörüm.İzlemek üzere olduğunuz yöntem, membran proteinlerinin önemli bir özelliğini ortaya çıkarmaktadır. Spesifik olarak, lipid çift katmanına katlanmış ve yerleştirilmiş bir proteinin stabilitesinin nasıl ölçüleceğini göstereceğiz. Benim adım Diana Ottinger, UC San Diego Kimya Bölümü'nde lisansüstü öğrencisiyim.Bugün, bu yöntemi temsilci bir membran proteini üzerinde göstereceğiz. Ancak, bu teknik geneldir ve membran ilişkili peptitler ve çözünür proteinler gibi diğer biyolojik sistemlere de uygulanabilir. Öyleyse başlayalım.Bu protokole başlamadan önce; kloroform içinde bir iki DME yağı, SN gliserol, üç fosfokolin veya DMPC lipid çözeltisi satın alın ve bunları temiz cam şişelere aktarın. Şişe başına 20 mg miktarlarda, lipid oksidasyonunu önlemek için her şişeye bir azot gazı tabakası ekleyin ve şişeleri mühürleyin. Her bir deney için kloroform içinde 20 mg lipid içeren tek bir şişe kullanılır.Stok vezikül çözeltisini hazırlamak için, Teflon septum ve iğne kullanarak, çözücü kalmayana kadar flakon içeriğini bir saat boyunca nitrojen gazı akımı altında kurutun. Kurutulmuş lipidlere 1 mL 20 mM potasyum fosfat tamponu (pH 7.3) ekleyin ve yaklaşık 30 saniye boyunca bir su banyosunda yeniden süspande edin. Elde edilen bulanık süspansiyonu, konik tabanlı bir pipet yardımıyla 15 mL'lik plastik bir tüpe aktarın.Lipidi başlangıçta içeren boş cam şişeye bir mililitre daha fosfat tamponu ekleyin ve sonikasyon işlemini tekrarlayın. Elde edilen süspansiyonu aynı 15 mililitrelik tüpe ekleyin. Toplamda dört mililitrelik bir nihai hacim ve mililitrede beş miligramlık bir lipid konsantrasyonu elde etmek için bu işlemi toplam dört kez tekrarlayın.Lipid vezikül süspansiyonunu sıcak bir su banyosuna yerleştirin ve bir ultrasonikator mikro uç kullanarak %50 görev döngüsünde bir saat boyunca sonikasyona tabi tutun. Su banyosu, lipid çözeltisinin aşırı ısınmasını önlemeye yarar ve sulu lipid çözeltisinin sıcaklığını sonikasyon sırasındaki çift katman faz geçiş sıcaklığının üzerinde tutar.Ator ucundan gelen kalıntıları temizlemek için SONİKE EDİLMİŞ çözeltiyi 0.22 mikronluk bir şırınga filtresinden süzün ve filtrelenmiş çözeltinin 37 santigrat derecede gece boyunca dengelenmesini sağlayın. İlk floresan açılım örneğini hazırlamak için, 20 milimolar fosfat tamponu içerisinde 10 molar üre stok çözeltisi ve 20 milimolar fosfat stok tampon çözeltisi hazırlayın. Yazılı protokole göre, üre konsantrasyonu bir refraktometre ile kırılma indisi ölçülüp bilinen değerlerle karşılaştırılarak deneysel olarak belirlenmelidir.Ardından, sekiz molar üre ve 20 milimolar fosfat tamponunda, yaklaşık 200 mikromolar protein konsantrasyonuna sahip bir açılmış protein stok çözeltisi hazırlayın. Bu videoda, protokolü göstermek için membran proteini OPA A kullanılmıştır; floresan çalışmaları için numuneler, yaklaşık dört mikromolar protein, mililitre başına bir miligram lipid ve sıfırdan sekiz molar üreye kadar birer molar artışlarla toplam hacmi 200 mikrolitre olacak şekilde uygun hacimlerde stok protein, stok lipid çözeltisi, stok 10 molar üre çözeltisi ve stok fosfat tamponu birleştirilerek hazırlanır. Kör numuneler de aynı şekilde hazırlanır.Bunun yerine, protein yerine sekiz molar üre çözeltisinin dört mikrolitresi kullanılır. Bu kör örnekler, proteinlerin floresan spektrumlarında görülen saçılma ve arka plan sinyallerini çıkarmak amacıyla hazırlanır. Floresan spektrumlarının ölçümünden önce, protein örneklerini ve körleri 37 °C'de en az iki saat inkübe edin.Tam katlanmayı sağlamak için florimetreyi ölçümlerden bir saat önce açın. Membran proteinleri genellikle yalnızca sıcaklık, çift katman faz geçiş sıcaklığının üzerindeyken sentetik lipidler içinde katlanır. Bu nedenle, DMPC durumunda, florimetredeki numune tutucunun sıcaklığı 30 degrees Celsius olarak ayarlanır.Floresans deneyini kararlı durum florimetresinde kurun ve her bir örneğin triptofan floresansını kör örneğe göre ölçün. Tirozin kalıntılarının uyarılmasını önlemek için uyarım dalga boyu 290 nanometreye ayarlanmalı ve emisyon 305 ile 500 nanometre arasından toplanmalıdır. Üç nanometrelik bir giriş ve çıkış bant geçişi kullanın.Sinyal-gürültü oranı için dalga boyu artışı ve entegrasyon süresi optimize edilebilir. Dalga boyu artışı ve entegrasyon süresi için tipik değerler sırasıyla adım başına bir nanometre ve adım başına 0.5 saniyedir. Örnekten 200 µL miktarında, 160 µL kapasiteli mikro hacimli kuvars camı bir Q Vet içerisine pipetleyin ve Q Vet'i cihazın Q Vet tutucusuna yerleştirin.Son olarak, floresans ölçümleri başlatılabilir; floresans spektrumlarının XY veri sayfası Igor Pro, MATLAB origin veya Excel gibi bir yazılıma yüklün. Bu gösterimde, üre ve lipid vezikül arka planını temizlemek, boş örneğin floresans spektrumunu S ölçekleyicisiyle çarpmak ve bunu protein lipid çözeltisinin ham floresans spektrumundan çıkarmak için Igor Pro kullanılacaktır. İlgili üre konsantrasyonunda, düzeltilmiş spektrumdan maksimum floresans dalga boyunu veya lambda max değerini tablo haline getirin.Her bir üre konsantrasyonu için. Tamamen açılmış bir membran proteini için tipik değer 350 nanometredir. Katlanmış bir proteinin değeri ise yaklaşık 330 nanometre iken, lambda max değerleri aralığını sıfır ile bir arasındaki bir aralığa dönüştürerek lambda max değerini açılmış popülasyon oranıyla ilişkilendirip, tablodaki dalga boylarını açılma oranına tercüme edin.Ardından, açılmış protein oranını üre konsantrasyonuna karşı grafikleyin. Açılmış oran F'nin üre konsantrasyonu C'ye karşı çizilen grafiği, proteinin katlanmış veya açılmış durumda olabileceğini varsayan bir denklemle uydurulabilir. M katsayısı, serbest enerjinin denatüre edici konsantrasyona göre değişim hızına karşılık gelir ve CM, katlanmış popülasyonun açılmış popülasyona eşit olduğu orta nokta üre konsantrasyonuna karşılık gelir.R gaz sabiti, T ise sıcaklıktır (Kelvin cinsinden). Uydurma işlemi, m ve cm katsayıları için değerler sağlar.Üre yokluğunda açılmanın Gibbs serbest enerjisi olan delta G'yi belirlemek için bu katsayılar çarpılır. Açıklanan açılma eğrisi, lambda max'ta en büyük değişime neden olan üre konsantrasyonları aralığını ortaya koyar. Açılma serbest enerjisini kesin olarak belirleyebilmek için bu aralık genellikle küçüktür ve açılmanın büyük bir kısmı bu dar aralıkta gerçekleşir.Optimize edilmiş en küçük kareler uydurması için gerekli olan çok sayıda veri noktasını içeren bir grafik elde etmek amacıyla, bu bölgede ek örnekler analiz edilmelidir. Örneğin, protein iki ve dört molar arasında açılıyorsa, açılma eğrisindeki bu önemli bölgenin şeklini daha kesin bir şekilde ortaya çıkarmak için bu üre konsantrasyonları arasında 0,2 molar artışlarla örnekler hazırlanabilir. En iyi sonuçlar için en az her 0,5 molar adımda ve her 0,2 molar adımda bir kör örnek dahil edilmelidir.Bu grafikten elde edilen açılma serbest enerjisi, orijinal açılma eğrisinden elde edilenden biraz farklı olabilir, ancak gösterilen daha kesin bir değeri yansıtır. Burada, tek bir triptofan kalıntısı içeren temsili membran proteini om a'nın triptofan floresan spektrumları yer almaktadır. Protokolde açıklandığı gibi, boş örneğin ham floresan spektrumu, proteinin ham floresan spektrumlarından çıkarılarak düzeltilmiş spektrum elde edilmiştir.Tanımlanan yöntemlerden elde edilen, çeşitli üre konsantrasyonlarındaki membran proteininin düzeltilmiş triptofan floresans spektrumları burada gösterilmektedir. Bu gösterimde, proteinin ya katlanmış ya da açılmış olduğu ve kararlı bir ara durumun bulunmadığı varsayımıyla bir açılım eğrisi oluşturulmuştur. M parametresi, açılma sırasında çözücüye maruz kalan polipeptit miktarını yansıtırken, CM, katlanmış ve açılmış popülasyonların eşit miktarda olması için gereken denatürasyon ve konsantrasyonu tanımlayan önemli bir değerdir.Yüksek CM ve M değerleri, kararlı bir proteine işaret eder. Bu prosedür takip edildiğinde, OPA a için açılma Gibbs serbest enerjisi mol başına 6,2 kilo kalori olarak hesaplanmıştır. Protein katlanmasının termodinamiği hakkında benzer bilgiler sağlamak için ısı, pH ve diğer kimyasal denatüranlar gibi diğer açılma yöntemleri de kullanılabilir.Bu videoyu izledikten sonra, katlanmış ve katlanmamış durumların farklı floresan özelliklerine dayanarak bir proteinin stabilitesinin nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Alternatif olarak, seçtiğiniz analitik araçtan bağımsız olarak, yöntem protein konformasyonu hakkında bilgi verdiği sürece dairesel dikroizm gibi diğer yöntemleri kullanarak da bir açılma eğrisi oluşturabilirsiniz. Açılma eğrileri yöntemi çok yönlüdür ve geniş bir yelpazedeki membran ve çözünür proteinlere uygulanabilir.

thermodynamics-membrane-protein-folding-measured-fluorescence

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biz tek hücreleri üzerinde floresan kullanarak yapı değişiklikleri siteye özgü analizi ile birlikte membran proteinlerinin iyon taşıma kinetiği ölçen bir yöntem anlatacağım. Bu teknik, iyon kanalları ve iyon pompaları uyarlanabilir ve protein altbirimden arasındaki mesafe sınırlamaları belirlemek için kullanılabilir.

Membran Proteinleri Konformasyonel Dynamics incelenmesi In situ Site Floresan Etiketleme

Bu video, protein homo-oligomerizasyonunu incelemek için floresan dalgalanma spektroskopisi (FFS) tekniğini göstermektedir. Bir numunedeki floresan etiketli proteinler, FFS kullanılarak protein oligomerizasyonu incelenirken bir ajan kullanılarak dimerize edilir. Konfokal bir mikroskop kullanılarak, proteinler küçük gözlem hacmine girip çıktıkça, proteinlerin oligomerik durumunu belirlemek için floresan moleküllerinin parlaklığındaki dalgalanmaların analizi yapılır.

Protein Homo-Oligomerizasyonunu İncelemek için Floresan Dalgalanma Spektroskopisi

Protein fonksiyonunun temel adımları, özellikle omurga konformasyonel değişiklikleri ve proton transfer reaksiyonları, genellikle mikrosaniye ila milisaniye zaman ölçeğinde gerçekleşir. Bu dinamik süreçler, özellikle işlevi ışık tarafından tetiklenen proteinler için, zaman çözümlü adım taramalı Fourier dönüşümü kızılötesi spektroskopisi ile incelenebilir.

Tarafından Işığa Proteinler Proton Transferi ve Protein Konformasyon Dynamics Zamanda çözülmüş kızılötesi spektroskopi Fourier-dönüşümü Step-tarama

Diferansiyel taramalı florimetri, proteinlerle etkileşimler için küçük molekül kütüphanelerini taramak için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Burada, küçük bir molekül ile protein ortağı arasındaki ayrışma sabitinin bir tahminini sağlamak için bu analizleri genişletmek için basit bir yöntem sunuyoruz.

Diferansiyel Taramalı florimetri Kullanarak Protein-ligand Etkileşimleri belirlenmesi

Plazma zarı proteinlerinin ve lipitlerinin mekansal dağılımı ve zamansal dinamikleri biyolojide sıcak bir konudur. Burada bu sorun, kavramsal olarak tek parçacık izlemenin aynı fiziksel miktarlarını sağlayan bir uzaysal-zamansal görüntü dalgalanma analizi ile ele alınmaktadır, ancak küçük moleküler etiketler ve standart mikroskopi kurulumları kullanır.

Ticari Mikroskop Canlı Hücre Zarları Moleküler Difüzyon Kanunu Hızlı Floresans Görüntüleme Gönderen

Biz hızlı katlanır ve etkileşimleri ile thermolabile ligandlar diferansiyel tarama Kalorimetre kullanarak bağlama biyomoleküler karakterizasyonu için bir iletişim kuralı mevcut.

Biyomoleküler DSC profilleri ile hızlı bir şekilde katlanır ve etkileşimleri bağlama karakterize etmek için Thermolabile ligandlar ölçme

Çoğu protein hücredeki hissediyorum ve membran eğriliği neden. Membran nanotüpler lipid veziküller eğri membranlar içinde vitroetkileşim proteinler veya herhangi bir eğrilik aktif molekül çalışmaya üzerinden çekmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Membran nanotüpler dev Unilamellar veziküller çekerek

Bu iletişim kuralı hücre-hücre etkileşimleri, yani proteinler hücre kavşaklar, doğrudan canlı hücreler içinde lokalize arabuluculuk proteinler arasındaki etkileşimler araştırmaya floresans dalgalanma spektroskopisi temelli bir yaklaşım açıklar. Biz aleti kalibrasyon, veri toplama ve analizi, olası yapay doku kaynaklarına düzeltmeler dahil olmak üzere ayrıntılı yönergeler sağlar.

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

Zaman çözümlenmiş tek moleküllü protein kaynaklı floresan geliştirme, proteinlerdeki yerel yapısal değişikliklere duyarlı yararlı bir floresan spektroskopik yakınlık sensörüdür. Burada, daha uzun menzilli FRET cetveli kullanılarak ölçüldüğünde küresel olarak yapılandırılmamış ve kararsız olarak bilinen α-Synuclein'deki kararlı yerel konformasyonları ortaya çıkarmak için kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Kararlı Yerel Konformasyonları Belirlemek için Zaman Çözümlenmiş Protein Kaynaklı Floresan Geliştirmeyi Kullanmak Bir Seferde Bir α-Synuclein Monomer

Bu protokol, aşağı akış fonksiyonel ve yapısal analizi için kalitelerini değerlendirmek üzere membran proteinleri üzerinde floresan boyut dışlama kromatografisi (FSEC) gerçekleştirmeye yönelik bir prosedürü açıklamaktadır. Deterjanda çözünür ve deterjansız koşullar altında çeşitli G-protein kuplajlı reseptörler (GPCR'ler) için toplanan temsili FSEC sonuçları sunulmuştur.

Floresan Boyut Dışlama Kromatografisi ile Membran Protein Kalitesinin Hızlı Değerlendirilmesi

Burada, konfokal mikroskopi modunda tek molekül seviyesinde zamanla çözülen floresan anizotropi kullanarak biyomoleküllerin yerel esnekliğini ve dinamiklerini incelemek için protokolü sunuyoruz.

Biyomoleküllerde Yerel Esnekliği Karakterize Etmek için Tek Moleküllerden Zamanla Çözülen Floresan Anizotropisi

Öğrenin, membran protein katlanmasının termodinamiğini triptofan floresans spektroskopisi ile ölçme yöntemini. Küçük LAR vezikülleri kullanılarak Gibbs serbest enerjisi hesaplanır ve protein stabilitesi analiz edilir.

Membran Protein katlanması, Termodinamik Floresans Spektroskopisi ile ölçülür.

Daha fazla video keşfet