Membran Protein katlanması, Termodinamik Floresans Spektroskopisi ile ölçülür.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, membran protein katlanmasıyla ilişkili termodinamiği ölçmektir. Bu, öncelikle membran protein için bir katlanma ortamı sağlamak amacıyla küçük LAR vezikülleri bir araya getirilerek gerçekleştirilir. Veziküller oluşturulduktan sonra, protein ve sistematik olarak değiştirilen üre konsantrasyonlarını içeren örnekler hazırlamak için kullanılırlar.

Ardından, her örneğin triptofan floresan spektrumu ölçülür. Bir membran protein açılım eğrisi oluşturmak için gereken verileri toplamak amacıyla, triptofan floresan spektrumlarından elde edilen açılım eğrilerine dayanarak membran protein açılımının Gibbs serbest enerjisinin nasıl elde edilebileceğini gösteren sonuçlar alınır. Merhaba, ismim Judy Kim. University of California at San Diego'da yardımcı profesörüm.

İzlemek üzere olduğunuz yöntem, membran proteinlerinin önemli bir özelliğini ortaya çıkarmaktadır. Spesifik olarak, lipid çift katmanına katlanmış ve yerleştirilmiş bir proteinin stabilitesinin nasıl ölçüleceğini göstereceğiz. Benim adım Diana Ottinger, UC San Diego Kimya Bölümü'nde lisansüstü öğrencisiyim.

Bugün, bu yöntemi temsilci bir membran proteini üzerinde göstereceğiz. Ancak, bu teknik geneldir ve membran ilişkili peptitler ve çözünür proteinler gibi diğer biyolojik sistemlere de uygulanabilir. Öyleyse başlayalım.

Bu protokole başlamadan önce; kloroform içinde bir iki DME yağı, SN gliserol, üç fosfokolin veya DMPC lipid çözeltisi satın alın ve bunları temiz cam şişelere aktarın. Şişe başına 20 mg miktarlarda, lipid oksidasyonunu önlemek için her şişeye bir azot gazı tabakası ekleyin ve şişeleri mühürleyin. Her bir deney için kloroform içinde 20 mg lipid içeren tek bir şişe kullanılır.

Stok vezikül çözeltisini hazırlamak için, Teflon septum ve iğne kullanarak, çözücü kalmayana kadar flakon içeriğini bir saat boyunca nitrojen gazı akımı altında kurutun. Kurutulmuş lipidlere 1 mL 20 mM potasyum fosfat tamponu (pH 7.3) ekleyin ve yaklaşık 30 saniye boyunca bir su banyosunda yeniden süspande edin. Elde edilen bulanık süspansiyonu, konik tabanlı bir pipet yardımıyla 15 mL'lik plastik bir tüpe aktarın.

Lipidi başlangıçta içeren boş cam şişeye bir mililitre daha fosfat tamponu ekleyin ve sonikasyon işlemini tekrarlayın. Elde edilen süspansiyonu aynı 15 mililitrelik tüpe ekleyin. Toplamda dört mililitrelik bir nihai hacim ve mililitrede beş miligramlık bir lipid konsantrasyonu elde etmek için bu işlemi toplam dört kez tekrarlayın.

Lipid vezikül süspansiyonunu sıcak bir su banyosuna yerleştirin ve bir ultrasonikator mikro uç kullanarak %50 görev döngüsünde bir saat boyunca sonikasyona tabi tutun. Su banyosu, lipid çözeltisinin aşırı ısınmasını önlemeye yarar ve sulu lipid çözeltisinin sıcaklığını sonikasyon sırasındaki çift katman faz geçiş sıcaklığının üzerinde tutar.

Ator ucundan gelen kalıntıları temizlemek için SONİKE EDİLMİŞ çözeltiyi 0.22 mikronluk bir şırınga filtresinden süzün ve filtrelenmiş çözeltinin 37 santigrat derecede gece boyunca dengelenmesini sağlayın. İlk floresan açılım örneğini hazırlamak için, 20 milimolar fosfat tamponu içerisinde 10 molar üre stok çözeltisi ve 20 milimolar fosfat stok tampon çözeltisi hazırlayın. Yazılı protokole göre, üre konsantrasyonu bir refraktometre ile kırılma indisi ölçülüp bilinen değerlerle karşılaştırılarak deneysel olarak belirlenmelidir.

Ardından, sekiz molar üre ve 20 milimolar fosfat tamponunda, yaklaşık 200 mikromolar protein konsantrasyonuna sahip bir açılmış protein stok çözeltisi hazırlayın. Bu videoda, protokolü göstermek için membran proteini OPA A kullanılmıştır; floresan çalışmaları için numuneler, yaklaşık dört mikromolar protein, mililitre başına bir miligram lipid ve sıfırdan sekiz molar üreye kadar birer molar artışlarla toplam hacmi 200 mikrolitre olacak şekilde uygun hacimlerde stok protein, stok lipid çözeltisi, stok 10 molar üre çözeltisi ve stok fosfat tamponu birleştirilerek hazırlanır. Kör numuneler de aynı şekilde hazırlanır.

Bunun yerine, protein yerine sekiz molar üre çözeltisinin dört mikrolitresi kullanılır. Bu kör örnekler, proteinlerin floresan spektrumlarında görülen saçılma ve arka plan sinyallerini çıkarmak amacıyla hazırlanır. Floresan spektrumlarının ölçümünden önce, protein örneklerini ve körleri 37 °C'de en az iki saat inkübe edin.

Tam katlanmayı sağlamak için florimetreyi ölçümlerden bir saat önce açın. Membran proteinleri genellikle yalnızca sıcaklık, çift katman faz geçiş sıcaklığının üzerindeyken sentetik lipidler içinde katlanır. Bu nedenle, DMPC durumunda, florimetredeki numune tutucunun sıcaklığı 30 degrees Celsius olarak ayarlanır.

Floresans deneyini kararlı durum florimetresinde kurun ve her bir örneğin triptofan floresansını kör örneğe göre ölçün. Tirozin kalıntılarının uyarılmasını önlemek için uyarım dalga boyu 290 nanometreye ayarlanmalı ve emisyon 305 ile 500 nanometre arasından toplanmalıdır. Üç nanometrelik bir giriş ve çıkış bant geçişi kullanın.

Sinyal-gürültü oranı için dalga boyu artışı ve entegrasyon süresi optimize edilebilir. Dalga boyu artışı ve entegrasyon süresi için tipik değerler sırasıyla adım başına bir nanometre ve adım başına 0.5 saniyedir. Örnekten 200 µL miktarında, 160 µL kapasiteli mikro hacimli kuvars camı bir Q Vet içerisine pipetleyin ve Q Vet'i cihazın Q Vet tutucusuna yerleştirin.

Son olarak, floresans ölçümleri başlatılabilir; floresans spektrumlarının XY veri sayfası Igor Pro, MATLAB origin veya Excel gibi bir yazılıma yüklün. Bu gösterimde, üre ve lipid vezikül arka planını temizlemek, boş örneğin floresans spektrumunu S ölçekleyicisiyle çarpmak ve bunu protein lipid çözeltisinin ham floresans spektrumundan çıkarmak için Igor Pro kullanılacaktır. İlgili üre konsantrasyonunda, düzeltilmiş spektrumdan maksimum floresans dalga boyunu veya lambda max değerini tablo haline getirin.

Her bir üre konsantrasyonu için. Tamamen açılmış bir membran proteini için tipik değer 350 nanometredir. Katlanmış bir proteinin değeri ise yaklaşık 330 nanometre iken, lambda max değerleri aralığını sıfır ile bir arasındaki bir aralığa dönüştürerek lambda max değerini açılmış popülasyon oranıyla ilişkilendirip, tablodaki dalga boylarını açılma oranına tercüme edin.

Ardından, açılmış protein oranını üre konsantrasyonuna karşı grafikleyin. Açılmış oran F'nin üre konsantrasyonu C'ye karşı çizilen grafiği, proteinin katlanmış veya açılmış durumda olabileceğini varsayan bir denklemle uydurulabilir. M katsayısı, serbest enerjinin denatüre edici konsantrasyona göre değişim hızına karşılık gelir ve CM, katlanmış popülasyonun açılmış popülasyona eşit olduğu orta nokta üre konsantrasyonuna karşılık gelir.

R gaz sabiti, T ise sıcaklıktır (Kelvin cinsinden). Uydurma işlemi, m ve cm katsayıları için değerler sağlar.

Üre yokluğunda açılmanın Gibbs serbest enerjisi olan delta G'yi belirlemek için bu katsayılar çarpılır. Açıklanan açılma eğrisi, lambda max'ta en büyük değişime neden olan üre konsantrasyonları aralığını ortaya koyar. Açılma serbest enerjisini kesin olarak belirleyebilmek için bu aralık genellikle küçüktür ve açılmanın büyük bir kısmı bu dar aralıkta gerçekleşir.

Optimize edilmiş en küçük kareler uydurması için gerekli olan çok sayıda veri noktasını içeren bir grafik elde etmek amacıyla, bu bölgede ek örnekler analiz edilmelidir. Örneğin, protein iki ve dört molar arasında açılıyorsa, açılma eğrisindeki bu önemli bölgenin şeklini daha kesin bir şekilde ortaya çıkarmak için bu üre konsantrasyonları arasında 0,2 molar artışlarla örnekler hazırlanabilir. En iyi sonuçlar için en az her 0,5 molar adımda ve her 0,2 molar adımda bir kör örnek dahil edilmelidir.

Bu grafikten elde edilen açılma serbest enerjisi, orijinal açılma eğrisinden elde edilenden biraz farklı olabilir, ancak gösterilen daha kesin bir değeri yansıtır. Burada, tek bir triptofan kalıntısı içeren temsili membran proteini om a'nın triptofan floresan spektrumları yer almaktadır. Protokolde açıklandığı gibi, boş örneğin ham floresan spektrumu, proteinin ham floresan spektrumlarından çıkarılarak düzeltilmiş spektrum elde edilmiştir.

Tanımlanan yöntemlerden elde edilen, çeşitli üre konsantrasyonlarındaki membran proteininin düzeltilmiş triptofan floresans spektrumları burada gösterilmektedir. Bu gösterimde, proteinin ya katlanmış ya da açılmış olduğu ve kararlı bir ara durumun bulunmadığı varsayımıyla bir açılım eğrisi oluşturulmuştur. M parametresi, açılma sırasında çözücüye maruz kalan polipeptit miktarını yansıtırken, CM, katlanmış ve açılmış popülasyonların eşit miktarda olması için gereken denatürasyon ve konsantrasyonu tanımlayan önemli bir değerdir.

Yüksek CM ve M değerleri, kararlı bir proteine işaret eder. Bu prosedür takip edildiğinde, OPA a için açılma Gibbs serbest enerjisi mol başına 6,2 kilo kalori olarak hesaplanmıştır. Protein katlanmasının termodinamiği hakkında benzer bilgiler sağlamak için ısı, pH ve diğer kimyasal denatüranlar gibi diğer açılma yöntemleri de kullanılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, katlanmış ve katlanmamış durumların farklı floresan özelliklerine dayanarak bir proteinin stabilitesinin nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Alternatif olarak, seçtiğiniz analitik araçtan bağımsız olarak, yöntem protein konformasyonu hakkında bilgi verdiği sürece dairesel dikroizm gibi diğer yöntemleri kullanarak da bir açılma eğrisi oluşturabilirsiniz. Açılma eğrileri yöntemi çok yönlüdür ve geniş bir yelpazedeki membran ve çözünür proteinlere uygulanabilir.