İmmünositokimya: İnsan Sinir Kök Hücreler

Merhaba, ben Steve. UC, Irvine'deki Patoloji Bölümü'nde Dr. Flanagan'ın laboratuvarında çalışıyorum. Ve bugün size insan nöral öncü hücrelerinin immünokimyasını nasıl yapacağınızı göstereceğim.

Bu protokol, hücrelerin lain kaplı örtü fişlerine yerleştirilmesini ve hücrelerin gece boyunca birincil antikorda bloke edilmesini ve inkübe edilmesini ve daha sonra birkaç WAS yapılmasını ve ikincil antikorun oda sıcaklığında takılmasını içerir. Ve son olarak, kapak kızaklarının mikroskop uçuşlarına monte edilmesi. Başlayalım.

Bu yüzden ilk olarak, laminatla kaplamak için 24 oyuklu bir plakaya 12 milimetre genişliğinde üç steril Alman cam kapak fişi yerleştireceğim. Şimdi kapak fişlerim plakada ve önce bir PDL poli lizin çözeltisi ekleyeceğim ve kapak altlarını oda sıcaklığında beş dakika PDL'de inkübe edeceğim. Şimdi beş dakikanın sonunda, PDL'yi çıkaracağım ve laminin takacağım ve kapak fişlerini gece boyunca en az dört saat veya daha iyi bir süre laminatta inkübe edeceğim.

Bu yüzden plakayı gece boyunca laminatta inkübe ettim ve şimdi kapak fişlerini PBS ve daha önce saydığım plaka insan nöral öncü hücreleri ile durulayacağım. Bu yüzden laminat solüsyonlarını yeni çıkardım ve şimdi kapak fişlerini PBS ile dizginleyeceğim. Şimdi PBS'yi kaldıracağım ve medya çözümünü koyacağım.

Ve sonunda, hücreleri görmeye hazırım. Hücreleri değirmen başına yüz bin hücre olarak göreceğim, bu da 24 kuyulu bir plaka için kuyu başına 50.000 hücre ekleyeceğim anlamına geliyor, çünkü, çünkü her kuyucuk yarım mililitre içerir. Bu yüzden, hücrelerin kapak kaymasının yüzeyine eşit şekilde yayıldığından emin olmak için plakayı bir yandan diğer yana eğeceğim.

Ve şimdi onları en az 24 saat boyunca kuvöze yatıracağım ki yerleşsinler ve immünokimya için yayılsınlar. Hücreler 24 saattir büyüyor ve onlara baktım ve yapışık ve güzelce dağılmışlar. Bu yüzden şimdi onları beş dakika boyunca %4 yükseklikle düzelteceğim.

Ama önce medyayı çıkaracağım ve hücrelerin kurumasına izin vermek istemiyorum. Bu yüzden medyayı kaldıracağım ve aynı anda sabitleyici ekleyeceğim. Bu yüzden buna iki el tekniği deniyor.

Şimdi hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca fiksatif olarak inkübe edeceğim. Yani beş dakika oldu. PFA'yı çıkarıp PFA atık kabına koyacağım ve aynı zamanda hücrelerin kurumaması için PFA'yı çıkarırken aynı zamanda PBS ekleyeceğim.

Bu yüzden PFA'yı çekmek için bu plastik emme pipetlerinden birini kullanacağım ve zamanlayıcıyı beş dakikaya ayarlayacağım. Bu yüzden hücrelerim PBS yıkamasındayken, Triton X 100 kullanarak bir perme görselleştirme solüsyonu hazırlayacağım. İyonik olmayan bir deterjandır ve çok, çok viskozdur.

Bu nedenle, tüm çözelti pipete girene ve pipete girene kadar beklemek önemlidir. Bu yüzden PBS'de %0.3'lük bir çözelti hazırlayacağım, 10 milyon PBS ekleyeceğim. Ve bu 10 milyon PBS'ye, önümüzdeki 100 yılda 30 mikrolitre tri ekleyeceğim.

Bu yüzden 30 mikrolitre tri ekleyeceğim, sonraki 100 ila 10 mil PBS. Bu yüzden, tüm çözümün ipucuna girmesine izin vermek için yaklaşık 10 saniye ekleyeceğim. Yani ben, burada perme kullanım çözümüm var.

10 dakika döndürücüye koydum ve ardından viskoz tritton'un tamamen çözüldüğünden emin olmak için girdap yapıyorum. Artık perme görselleştirme adımını yapmaya hazırım. Ve bu yüzden, oda sıcaklığında beş dakika boyunca akıllıca gideceğim.

Yani beş dakika oldu. Şimdi tüm tritonu yıkadığımdan emin olmak için beş dakikalık üç PBS yıkaması yapacağım. Bu yüzden bir kez daha, saati beş dakikaya ayarlayacağım.

Bu yüzden ben, tüm yıkama adımlarımı yeni bitirdim, bu yüzden engelleme adımını yapmaya hazırım. Bu yüzden engelleme adımı için PBS'de %5'lik bir BSA çözümü hazırladım. Ve tüm yıkamalarda olduğu gibi, PBS'yi çıkaracağım ve aynı anda engelleme solüsyonunu ekleyeceğim.

Ve engelleme adımı oda sıcaklığında bir saat sürecek. Hücrelerim bloke olurken, plakayı primer antikor inkübasyonu için hazırlayacağım. Bu yüzden bu cam plaka ile başlayacağım ve bu boyutta bir para filmi parçası keseceğim.

Ve yapacağım şey onu sarmak ve biraz kasete ihtiyacım var, yani dört parça banda ihtiyacım olacak. Bu yüzden hepsini hazırlayacağım. Bu yüzden bu para film parçasını alacağım ve yüzeyin güzel ve pürüzsüz olması için düzleştireceğim.

Ve sonra her iki ucunu da alacağım ve cam plakanın arkasına bantlayacağım. Şimdi yüzeylerin düz olduğundan emin olmak için bunun diğer ucunu çekeceğim ve diğer ucunu arkaya bantlayacağım. Bu yüzden şimdi ilkiyle aynı boyutta başka bir çift filme ihtiyacım var.

Ve temelde ben de aynı şeyi yapacağım. Bu yüzden birincinin üzerine ikinci bir para film parçası bantladım, tıpkı ilki gibi, ancak ikinci perfil parçasının bir ucunu gevşek bıraktım çünkü antikor solüsyonunu yerleştireceğim ve sonra ilk parçanın üzerine güç kayıyor. Ve sonra üzerine sandviç yapan ikinci parçayı yerleştireceğim.

Ama şu anda, antikor solüsyonunu koyacağım yeri etiketleyeceğim ve kapatacağım. Yani, hücreler bir saattir bloke edici solüsyondalar, ve şimdi gece boyunca inkübasyon için primer antikor damlacıklarının üzerine örtü fişlerini koyacağım. Bu yüzden 35 mikrolitrelik bir damla primer antikor koyacağım ve tüm sıvıyı dışarı atmamak için çok dikkatli olacağım çünkü bu kabarcıklar oluşturabilir ve kabarcıklar antikorun antijene bağlanmasını engelleyebilir.

Bu yüzden damlada kabarcıklar olmasını önlemek istiyorum, üç birincil antikor damlasının hepsi, ve bu damlaların üzerine hücrelerle birlikte kapakları yerleştirmeye hazırım. Şimdi yapacağım şey, bir kapak fişi alacağım. Bu yüzden önce kapak fişini yana doğru hareket ettireceğim ve cımbız açıkken nazikçe kaldırmaya çalışacağım.

Kapak fişinin tutuşunu aldığımı hissettiğim anda, cımbızı yavaşça kapatmak için yaklaşacağım ve kapak fişini kuyudan nazikçe kaldıracağım. Yani şu anda hücreler kapak fişinin üstünde. Bu yüzden yapacağım şey, damlayı ters çevireceğim, ters çevireceğim ve nazikçe dokunacağım ve herhangi bir baloncuk oluşturmadan yavaşça damlanın üzerine koyacağım.

Ve böylece aynı prosedürü ikinci ve üçüncü kapak fişleri için de tekrarlayacağım. Ve son adım, ikinci para film parçasını üstüne yerleştirmektir. Ve bunu nasıl yapacağım, bunu böyle tek bir hareketle ortaya koyacağım.

Hareket etmekten kaçınmaya çalışmak, onu bir yandan diğer yana hareket ettirmek istiyorum. Ve son olarak, başka bir bant parçasıyla plakanın dibine sabitleyeceğim. Ve nihayet, hücreler gece boyunca dört derecede inkübe edilmeye hazır, ve bu immünokimyanın birinci gününün sonu.

Bu, immünokimyanın ikinci günü ve kapak fişlerini PB S3'te beş dakika boyunca yıkayacağım. Ve sonra ikincil antikor içinde oda sıcaklığında iki saat inkübe edeceğim. İlk olarak, para filmi bu şekilde keseceğim ki kapak fişlerini çıkarabileyim.

Ve para filmin üst kısmını yavaşça kaldıracağım, böylece kapak fişleri bakım filminin alt parçasında kalsın. Bu yüzden ilk parçayı çıkardım ve PBS yıkama solüsyonu olan tabağım hazır. Bu yüzden her bir örtü çorbasını kaldıracağım ve epitopa bağlanmayan kalan herhangi bir primer antikoru yıkamak için kuyuya koyacağım.

Bu yüzden kapak fişini kaldırmak için, önce bir jiletle bu şekilde tutacağım ve nazikçe kaldırmaya çalışacağım. Ve hücreler olduğu için, antikor çözeltisiyle karşı karşıyayız, onları şimdi üstte olacak şekilde çevireceğim ve onu kuyuya kaydıracağım, böylece hala üstte kalacaklar. Ve kalan güç fişleri için prosedürü tekrarlayacağım.

Ve böylece beş dakika boyunca yıkanacaklar. Yani beş dakika oldu. PBS çözümünü değiştireceğim.

Kanca kalıbını ekleyeceğim. Şimdi onu beş dakika kuluçkaya yatıracağım. Böylece kanca kuluçka işlemi bitti ve şimdi kapak sos monte etmeye hazırım ve onlara bakmaya hazırım.

Bu yüzden önce floresan kuruşları ağartma için uzak tutmaya yardımcı olan dörtlü vektör kalkanını alk edeceğim. Önce slaytı kapak fişlerinin sayısıyla etiketleyeceğim ve sonra 10 mikrolitre vektör kalkanı yerleştireceğim. Vektör kalkanı bir yağdır ve gerçekten viskozdur, bu nedenle, hepsi uca girene kadar biraz beklemek de önemlidir.

Bu yüzden mikroskop lamının üzerine vektör kalkanı yerleştirdim, ve şimdi kapak fişlerini mikroskop lamının üzerine yerleştirmeye hazırım. İlk yapacağım şey bir kapak fişi alacağım ve kapak fişinin arkasını deiyonize su ile durulayacağım, çünkü eğer yapmazsam, kuruduğunda, PBS'deki tuz kristalleşecek ve floresan kalıpların optik özelliklerine müdahale edecek. Ben de gidiyorum, deiyonize suyumu hazırladım.

Ve böylece kapak fişini alacağım ve arkasını deiyonize su ile durulayacağım. Ve sonra kurutmak için teneke mendile dokunacağım. Ve sonra onu tekrar ters çevireceğim, böylece hücre tarafı ters çevrilecek ve mikroskop lamının üzerine inecek.

Ve tıpkı daha önce olduğu gibi, vektör kalkanının damlasına dokunacağım ve herhangi bir baloncuk yakalamadan yavaşça indireceğim. Ve aynı işlemi, tüm kargo çevirmeleri için de aynı prosedürü tekrarlayacağım. Ve şimdi bir göz atalım.

Bu, immünokimya yaptıktan ve resimlerinizi elde ettikten ve kaplamalar ve benzeri şeyler yaptıktan sonra neler elde edebileceğinize bir örnektir. Bu görüntüde, bu, bu doğum sonrası farelerde diş çürüklerinden izole edilen hipokampal nöro kök hücrelerin bir görüntüsü. Bugün size insan nöral öncü hücrelerinin immünokimyasının nasıl yapıldığını gösterdim.

Ve eğer fark ederseniz, bu teknik geniş antikor reaktifini kurtarmanıza izin verir. Çok küçük bir hacimde primer ve sekonder antikor kullandık, bir perfil üzerine küçük bir damla yerleştirdik ve üzerindeki hücrelerle birlikte kapak kızağını ters çevirdik. Öyleyse devam edin, immünoterapi kimyası yapın ve beni izlediğiniz için teşekkür ederim.