A β-glucuronidase (GUS) Tabanlı Hücre Ölümü Testi

Bu prosedürün genel amacı, belirli genlerin potansiyel ölüm özelliklerini analiz etmek için bir Gus raportör sistemi kullanmaktır. İlgilenilen genler bir Gus kasetine klonlanır ve 35 s'lik bir promotör altında uygun agrobacterium vektörlerinde büyütülür. Bu vektörler daha sonra Agrobacterium suşu, LBA 44 0 4'e dönüştürülür ve Nick Oceana Hamana yapraklarına sızmak için bir Gus ekspresyon kaseti içeren bir kültürle karıştırılır.

Gus aktivitesi, histokimyasal boyama ile görsel olarak veya kantitatif olarak Fluor metrik kupa testi ile değerlendirilebilir. Bu tekniğin, DNA merdivenleme veya tünel tahlili gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, memeli sistemlerinde yaygın olarak kullanılır, ancak bitkilerde çoğaltılması zordur, bunun, gaz ekspresyonunun gerçekleşmesi için canlı hücrelerin gerekli olduğu basit gerçeğinden yararlanan hassas, hızlı bitki bazlı geçici test olmasıdır. Bugün prosedürü gösteren Hua RAO'lar olacak.

Laboratuvarımız Infiltrat'ta doktora sonrası bir araştırma görevlisi, 25 santigrat derecede yetiştirilen üç ila altı haftalık nicotiana hamana bitkilerinin tamamen genişletilmiş sağlıklı yapraklarını gerektirir. Bu protokolü sekiz gün boyunca gerçekleştirmeyi planlayın. Birinci gün, hücre ölümü tahlili için vektörleri içeren agrobacterium tumor fassan gliserol stoklu çizgi ızgaraları ve Gus ekspresyon kasetli vektör de çoklu kültür kombinasyonları test edilirken negatif kontrol veya doldurucu olarak her zaman boş bir vektör içerir.

Plakaları iki gün boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin. Üçüncü gün, her plakadan tek bir koloni ile iki mililitre seçici LB aşılayın. Her kültürü, maksimum büyüme yoğunluğuna ulaşılana kadar 200 RPM'de 24 saat boyunca 28 santigrat derecede çalkalayarak inkübe edin.

24 saatlik inkübasyondan sonra, topaklanma varsa pipetleme yaparak kültürü tamamen yeniden süspanse edin ve agrobacterium virülans genlerini indüklemek için her kültür için toplam hacmi taze seçici LB ile 10 mililitreye çıkarın. 25 mikromolara aseton ekleyin ve her kültürü 28 santigrat derecede 16 saat daha çalkalayarak inkübe edin. Bir sonraki adım, her bir kültürü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 4.000 G'de santrifüjlemek ve Resus, peleti 10 mililitre infiltrasyon ortamında askıya almaktır.

Aseton eklemeyin, kültürleri tekrar santrifüjleyin, ama şimdi Resus. Her peleti 100 mikromolar aseton içeren beş mililitre infiltrasyon ortamında askıya alın. Şimdi OD'yi 600 nanometrede ölçün.

0.1 kadar düşük konsantrasyonlar kabul edilebilir, ancak 0.9'dan büyükse, infiltrasyondan önce infiltrasyon, orta ve aseton ile 0.9'a seyreltin. Kültürleri inkübasyondan sonra üç saat çalkalayarak 28 santigrat derecede bir kez daha inkübe edin. Deney kültürlerini ve kontrol kültürlerini Gus kasetini içeren kültürle bire bir oranında karıştırın.

Her kültür için, ABA mührüne veya yeni çıkan yaprakların alt tarafına sızmak için bir mililitre iğnesiz şırınga kullanın. Sızma hacmi önemli değildir. Yeterince suya batırma alanı oluştuğunda, aynı bitkide hem negatif kontrolü hem de zıt yapraklarda tahlil edilecek geni infiltre edin, ardından aynı şekilde iki bitkiye daha sızın.

Yani her kültür için üçlü bitkiler vardır. Sızmadan üç gün sonra, yaprakları toplama ve gust protein ekspresyonu için tahlil zamanı gelmiştir. Histokimyasal analize, tamamen ıslanana kadar tüm yaprağı xlu substrat ile vakumla sızarak başlayın.

Şimdi, yaprakları gece boyunca oda sıcaklığında karanlıkta veya mavi lekelenme belirgin olduğunda belirgin mavi lekelenme görünene kadar kuluçkaya yatırın. Yaprakları damıtılmış suda durulayın ve klorofilleri çıkana kadar gece boyunca %70 etanol içinde inkübe edin. Ertesi gün, yaprakları ve damıtılmış suyu durulayın ve GUS ekspresyon seviyelerini değerlendirin.

Gus ekspresyonunu ölçmek için, bir substrat kupası, sıvı nitrojen kullanılarak bir havanda sızmış yaprak disklerinin öğütülmesiyle başlayabilen bir floresan ürün mu'ya dönüştürülür. Ardından, numuneyi buz üzerinde tutarken 100 mikrolitre GUS ekstraksiyon tamponu ekleyin. Şimdi süspansiyonu dört santigrat derecede beş dakikada 14.000 GS'de santrifüjleyin ve Gus dahil olmak üzere toplam çözünür proteinleri içeren süpernatanı toplayın.

Bir NanoDrop kullanarak toplam çözünür protein konsantrasyonunu ölçün ve Gus ekstraksiyon tamponundaki her numune için konsantrasyonu 100 mikrogram toplam protein olarak ayarlayın. Şimdi, her numuneye Gus ekstraksiyon tamponunda kupa substratını iki milimolar kupa nihai konsantrasyonuna ekleyin. Numune başına toplam 100 mikrolitrelik bir hacim, pipetleme ile karıştırılmalı ve reaksiyonu 37 santigrat derecede bir saat inkübe etmelidir.

Bir saat sonra, 800 mikrolitre rüzgar durdurma tamponu ekleyerek reaksiyonu durdurun. Her bir numunenin mu 100 mikrolitresini ölçmek için, 365 nanometre uyarmada bir plaka okuyucu floresansında analiz edilen bir mikrotitre plakasına yüklenir, 455 nanometre emisyon dalga boyları ölçülür ve standart bir eğri ile karşılaştırıldığında, Guss aktivitesi daha sonra dakika reaksiyonu başına toplam çözünür proteinin mikrogramı başına mu M olarak rapor edilebilir. GUS ekspresyon kaseti, hücre ölümünün negatif bir düzenleyicisi veya bir anti-ölüm geni ile birlikte sızdığında kullanılan yapıya bağlı olarak çeşitli rüzgar seviyeleri tespit edilir.

Karşılaştırma yoluyla yüksek rüzgar seviyeleri gözlenir. Boş vektör kontrolündeki Gus seviyeleri çok daha düşüktür. Tersine, hücre ölümünün pozitif bir düzenleyicisi veya bir ölüm yanlısı gen kullanıldığında, boş vektör kontrolüne kıyasla Gus ekspresyonunda bir pazar azalması gözlenir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik yaklaşık bir hafta içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, bu tekniğin belirli genlerin potansiyelini belirlemek için bir başlangıç adımı olarak kullanıldığını hatırlamak önemlidir. Bu ilk sonuçları doğrulamak ve ilgili hücre tipini belirlemek için ek çalışma yapılması gerekir.