Name: Metabolik Etiketleme ve Bioorthogonal tıklayın Kimya Zebra balığı Embriyolar Görüntüleme glukanlardır (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Öğrenin, bioorthogonal tıklama kimyası kullanarak zebra balığı embriyolarında glikanların hızlı ve invaziv olmayan etiketlenmesi yöntemini. Bu teknik, fukozillenmiş glikanların dinamik görüntülenmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Albert Einstein College of Medicine başlangıç ​​fonları; Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (RDS 3U54AI057158-06S1 PW GM093282) tarafından kısmen desteklenmiştir.

1. Yumurta Toplama ve Dechorionation <ol><li> 35mm petri Zebra balığı yumurtaları toplamak ve aktarmak mümkün olduğu kadar su olarak kaldırmak ve sonra 1 mg / ml E3 embriyo orta Pronease D (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl 2 · 2H 2 O, 0.33 mM MgSO eklemek koryon sindirmek için 4, pH = 7,4). </li><li> 3-5 dakika sonra, balık suyu (litre başına 60 mg "anında Ocean" damıtılmış H 2 O) ile dolu bir behere çanak birleştirme ve beher hafifçe yumurta ve yumurta suya "düşmek" için izin. </li><li> Yumurta balık üç kez su ile durulayın. En yumurta koryon piyasaya sürülecek. </li><li> Bir yangın parlatılmış cam Pasteur pipeti kullanarak, E3 embriyo orta ile dolu agaroz kaplı petri kaplarına dechorionated yumurta transferi. </li></ol> 2. GSYİH-FucAl ile Mikroenjeksiyon <ol><li> Rapor protokol 7 enjeksiyon yemekleri hazırlayın. </li><li> E3 embriyo orta ile dolu enjeksiyon yemekleri içine dechorionated yumurta transferi. </li><li> Iğne hazırlayın ve 2 mcL enjeksiyon çözüm yük. Bu çözüm, bir izleme veya 0.2 M KCl fenol kırmızısı yükleme boyası (% 0.1 w / v) olarak 20 mM ve GSYİH-FucAl chemoenzymatically sentezlenmiş 8 ya Alexa Fluor 594-dekstran (% 5 w / v) içerir. Negatif kontrol olarak, enjeksiyon çözüm GSYİH fucose ile GDP-FucAl değiştirin. </li><li> Break iğne ve enjeksiyon basıncı ve süresi 1 nL damla 9 verim ayarlayın. </li><li> Ya çözüm 1 nL yumurta enjekte edilir. </li><li> E3 embriyo orta ile dolu agaroz kaplı petri kutularının içine yumurta transferi. </li><li> Yumurta 28 ° C'de inkübe ve döllenme sonrası 3-4 saat içinde döllenmemiş yumurta kaldırmak. </li></ol> 3. BTTES-Cu (I) katalize tıklayın Kimya Reaksiyon <ol><li> Embriyoların gelişim evreleri (örneğin geç gastrula, doku segmentasyonu ve erken larva), agaroz ile 96-plaka taban kat istenilen ulaştığınızda. </li><li> Her bir kuyu için 92 mcL E3 embriyo orta, (H 2 O bir 2.5 mM stok) 4 mcL Alexa Fluor-488 azid ek 2 mcL BTTES CuSO 4 06:01 karmaşık ve karıştırmak için hafifçe sallayın. </li><li> Tıklayarak kimya reaktif içeren bir yangın parlatılmış cam Pasteur pipeti kullanarak içine embriyolar transfer. Her iyi beş embriyolar daha az içermelidir. </li><li> Tıklama reaksiyon başlatmak için 3 2.5 mcL taze hazırlanmış sodyum askorbat (H 2 O, 100 mM stok) ekleyin . Her reaktifin Final konsantrasyon: Alexa Fluor-488 azid: 100 mcM; CuSO 4: 50 mcM; BTTES: 300 mcM, sodyum askorbat: 2.5 mM. </li><li> 3 dakika sonra, sonra tepki gidermek için 100 mcL E3 embriyo orta ile hemen sulandırmak, 2 mcL bathocuproine sülfonat (H 2 O 50 mM hisse senedi), biyouyumlu bir bakır şelasyon ekleyin. </li><li> Bir cam petri embriyoların transferi ve 15 ml E3 embriyo orta ile tedavi edilen embriyoların 2 kez yıkayın. </li></ol> 4. Görüntüleme <ol><li> Mattek cam alt kuyu çanak, ultra erime noktası agaroz (E3 embriyo orta% 1,2 (w / v)) bir damla koyun ve agaroz açılan bir embriyo. </li><li> Dorsal veya yanal embriyoların yerleştirin ve agaroz damla katılaşmaya 5 dakika buz üzerinde çanak. Agaroz açılan kapakları kadar çanak hafifçe E3 embriyo orta ekleyin. </li><li> Floresan ve parlak alan görüntüleri sırayla konfokal mikroskop kullanılarak elde edilir. Tüm embriyo görüntüleri 5 mikron adım aralığı kullanılarak elde edilir. Kompozit rakamlar ImageJ yazılımı kullanılarak hazırlanmıştır. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 1, iki adımlı bir etiketleme stratejisi iş akışı gösterir. Şekil 2, 9.5 saat sonra döllenme (hpf) BTTES aracılı CuAAC ile zebrafish embriyoların etiketleme gösterir. BTTES tris (triazolylmethyl) amin tabanlı ligand. Situ üretilen Cu (I) ile koordine dramatik CuAAC hızlandırır ve belirgin toksisite olmadan yaşayan sistemlerinde hızla Siklokatılma tepki teşvik. 3 dakikalık bir tıklama reaksiyon hemen ardından, GSYİH-FucAl tedavi edilen embriyoların sağlam bir etiket (Şekil 2, sol panel) tespit edebilmektedir. Sadece arka plan floresan GSYİH-fucose (Şekil 2, sağ panel) ile microinjected kontrol embriyolar tespit edilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/2686/2686fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 zebrafish embriyoların saran tabaka fucosylated glukanlardır etiketleme stratejisi. <img src="/files/ftp_upload/2686/2686fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 BTTES-Cu (I)-katalize tıklayın kimyası ile zebrafish embriyogenez sırasında fucosylated glukanlardır in vivo görüntüleme. Tek hücreli aşamasında zebrafish embriyolar tek bir doz ile GDP-FucAl microinjected ve devel izin9.5 hpf op. Embriyolar daha sonra Alexa Fluor BTTES-Cu (I) 488-azid katalize tepki. Tepki embriyolar konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülü. Aydınlık alan (alt panel); Alexa Fluor 488 floresan (üst panel) maksimum yoğunluğu z-projeksiyon görüntüleri. Ölçek çubuğu: 100 mm. Sorun Giderme <table border="1"><tbody><tr><td> Sorun </td><td> Neden </td><td> Çare </td></tr><tr><td> Embriyolar sağlıksız görünüm </td><td> Microinjected çözüm kirletici içerir </td><td> Nükleotid şekerlerin saflığı% 85 daha fazla olmalıdır. Kaynağını kontrol edin. </td></tr><tr><td> Etiketleme sonra hiçbir tepki var. </td><td> Bakır konsantrasyonu 30 mcM </td><td> Embriyoların eklerken bakır konsantrasyonu 30 mcM altında olduğunda reaksiyon hızını önemli ölçüde azalır, aşırı E3 embriyo orta ekleyerek reaksiyon çözümü sulandırmak için dikkatli olun. </td></tr><tr><td> Embriyolar reaksiyon sonra ölür </td><td> Embriyoların yanlış kullanım </td><td> Pipetlemeyin yangın cilalı ve reaksiyon kabı,% 0.5 'lik agaroz bir çok ince bir tabaka ile kaplı olduğundan emin olun. </td></tr><tr><td> Görüntüler lekeli görünüm </td><td> Reaktifler düzgün embriyoların eklemeden önce karıştırılır. </td><td> Reaktiflerin Ayrıca önerilen sırayla izleyin ve tıklama kimya reaktifleri düzgün embriyoların eklemeden önce karışık olduğunu emin olun. </td></tr><tr><td> Görüntüleri embriyoların zarar </td><td> Reaksiyon sırasında Güçlü zararlardan sallayarak embriyolar </td><td> Embriyoların çözüm kez en az 10 saniye süreyle yavaşça sallayın. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

<ol><li>Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+glycome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Imaging the glycome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 12-17 (2009).</li>
<li>Baskin, J. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+click+chemistry%3A+Covalent+labeling+in+living+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Qsar+Comb.+Sci%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal click chemistry: Covalent labeling in living systems.</a> Qsar Comb. Sci. 26, 1211-1219 (2007).</li>
<li>Soriano del Amo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatible+copper%28I%29+catalysts+for+in+vivo+imaging+of+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Biocompatible copper(I) catalysts for in vivo imaging of glycans.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 16893-16899 (2010).</li>
<li>Chang, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+labeling+of+sialic+acids+in+living+animals+with+alkynyl+sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Metabolic labeling of sialic acids in living animals with alkynyl sugars.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 4030-4033 (2009).</li>
<li>Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+membrane-associated+glycans+in+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish.</a> Science. 320, 664-667 (2008).</li>
<li>Baskin, J. M., Dehnert, K. W., Laughlin, S. T., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+enveloping+layer+glycans+during+zebrafish+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Visualizing enveloping layer glycans during zebrafish early embryogenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 10360-10365 (2010).</li>
<li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoenzymatic+synthesis+of+GDP-L-fucose+and+the+Lewis+X+glycan+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Chemoenzymatic synthesis of GDP-L-fucose and the Lewis X glycan derivatives.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16096-16101 (2009).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22THE+ZEBRAFISH+BOOK%2C+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">THE ZEBRAFISH BOOK, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).</li>
<li>Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+organization+of+the+zebrafish+fate+map%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Origin and organization of the zebrafish fate map.</a> Development. 108, 581-594 (1990).</li>
</ol>

<p class="jove_content"&gt; Görüntüleme biyomoleküllerin<em&gt; In vivo</em&gt; Kendi doğal ortamlarında kendi biyolojik faaliyetleri kritik bilgiler sağlar. Bu video, zebrafish embriyoların saran tabaka fucosylated glukanlardır etiketleme BTTES aracılı biyouyumlu CuAAC ile GSYİH FucAl ile tek hücreli aşamada embriyo ve ikinci bir adım fluorofor konjugasyon microinjecting tarafından gerçekleştirilen nasıl göstermek<sup&gt; 3</sup&gt;. Sağlam etiketleme 2-3 dakika içinde elde edilebilir ve etiketli glukanlardır 2.5 hpf olarak erken saptanabilir....

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifin Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Bakır (II) sülfat pentahidrat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 203165 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 azid </td><td> Invitrogen </td><td> A10266 </td></tr><tr><td> dekstran, Alexa Fluor 594 </td><td> Invitrogen </td><td> D-22.913 </td></tr><tr><td> (+)-Sodyum L-askorbat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7631 </td></tr><tr><td> Bathocuproinedisulfonic asit </td><td> Acros Organics </td><td> 164060010 </td></tr><tr><td> Cam alt kuyu çanak </td><td> Mattek </td><td> P35G-1.5-14-C </td></tr></tbody></table>

metabolik etiketleme ve bioorthogonal tıklayın kimya zebra balığı embriyolar görüntüleme glukanlardır

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

In vivo Görüntüleme glukanlardır azid veya alkin etiketli Monosakkaritler 1, 2 ya da organizma hücreleri tedavi ederek son zamanlarda bir bioorthogonal kimyasal muhabiri stratejisi kullanılarak etkin olmuştur. Glukanıdır biyosentetik makine tarafından işlenen değiştirilmiş Monosakkaritler, hücre yüzeyinde glycoconjugates içine dahil edilmiştir. Bioorthogonal azid veya alkin etiketleri sonra görünüm için floresan problar ile kovalent konjugasyon, izin veya zenginleştirme ve glycoproteomic analiz afinite probları. Saran tabaka fucosylated glukanlardır etiketleme 1) GSYİH-5-alkynylfucose (GSYİH FucAl), 2 ile tek hücreli aşamada embriyo mikroenjeksiyon): Bu protokol da dahil olmak üzere genellikle zebrafish embriyolar fucosylated glukanlardır noninvaziv görüntüleme için kullanılan prosedürler açıklanmaktadır biyouyumlu konfokal mikroskopi 3 Cu (I) katalize azid-alkin Siklokatılma (CuAAC), ve 3) görüntüleme ile azid-konjuge fluorophores zebrafish embriyolar. Burada açıklanan yöntem glukanlardır diğer sınıflar, örneğin glukanlardır içeren sialik asit 4 ve N-acetylgalactosamine 5, 6, gelişmekte olan Zebra balığı ve diğer canlı organizmaların kolayca görselleştirmek için uzatılabilir.

Zebra balığı embriyolar alkin etiketli glukanlardır hızlı, noninvaziv ve sağlam etiketleme için izin veren bir tıkla-kimya temelli yöntem açıklanmıştır. Bu çalışmada geç gastrulasyon aşamasında zebrafish embriyoların saran tabaka Fucosylated glukanlardır görüntülenmiştir.

Metabolik Etiketleme ve Bioorthogonal tıklayın Kimya Zebra balığı Embriyolar Görüntüleme glukanlardır

Canlı organizmalarda (in vivo) glikanların görüntülenmesi, yakın zamanda hücrelerin veya organizmaların azid veya ... ile işleme tabi tutulduğu biyortogonal bir kimyasal raporlayıcı stratejisi kullanılarak mümkün hale gelmiştir.

Glikanların in vivo görüntülemesine yönelik güncel gösterimler, hücrelerin veya organizmaların alkin veya azit etiketli monosakkaritlerle işleme tabi tutulduğu biyortogonal bir kimyasal raportör stratejisi kullanmaktadır. Glikan biyosentez mekanizması tarafından işlenen modifiye monosakkaritler, hücre yüzeyi glikokonjugatlarına biyortogonal alkin veya azit etiketleri olarak dahil edilir. Bu durum, görselleştirme için floresan problarla veya zenginleştirme ve glikoproteomik analizler için afinite problarıyla kovalent konjugasyona olanak tanır.Click kimyasına dayalı bu yöntem, zebra balığı embriyolarındaki alkin veya azi tespit edilebilir glikanların hızlı, non-invaziv ve sağlam bir şekilde etiketlenmesini sağlar ve gelişmekte olan organizmalardaki diğer glikan sınıflarını görselleştirmek için kolayca genişletilebilir. Bu tekniğin, lektin veya antikor bazlı glikan tespit yöntemleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, dinamik in vivo görüntüleme için uygulanabilmesidir. Lektin ve antikor bazlı görüntüleme yöntemleri, glikanların yalnızca belirli bir zaman noktasındaki anlık görüntüsünü sunar.Bunların dinamik çalışmalar bağlamında uygulanması zordur. Ek olarak, glikanların lektinler veya antikorlarla işaretlenmesi, ilgili hücrelerin veya dokuların doğal ortamlarından çıkarılmasını ve analizden önce fikse edilmesini gerektirir. Buna karşılık, biyortogonal kimyasal raporlayıcı stratejisi kullanılarak glikanların işaretlenmesi bu sınırlamaları ortadan kaldırır ve zebra balığı embriyoları ile C. elegans embriyoları gibi canlı sistemlerde glikanların non-invaziv görüntülemesine doğrudan uygulanabilir.Qlik kimyasının biyouyumlu bir versiyonu olan BTT Es aracılı Azi Aine Cyclo düzenlemesi kullanılarak, bir ila beş dakika içinde güçlü bir etiketleme gerçekleştirilebilir. Prosedürü uygulayanlar şu adımları izlemelidir: Zebrafish yumurtalarını 35 mm'lik bir Petri kabına toplayın ve aktarın. Mümkün olduğunca fazla suyu uzaklaştırın ve ardından koriyonu sindirmek için embriyo ortamında 1 mg/mL pronase E ekleyin; koriyonun kabarcıklanmaya başlayabileceği üç ila beş dakika sonra, kabı balık suyuyla dolu bir behere daldırın.Yumurtaların suyun içine düşmesini sağlayarak onları beherle nazikçe aktarın. Yumurtaların çoğunun koriyonlarından ayrılmasını sağlayacak şekilde, onları balık suyu ile kapsamlıca durulayın. Şimdi, ateşle cilalanmış bir pipet kullanarak, kaplamalı yumurtaları E three embriyo medyumu ile doldurulmuş agros kaplamalı Petri kaplarına aktarın. Hazırlanan enjeksiyon kaplarını E three embriyo medyumu ile doldurun ve kaplamalı yumurtaları buralara aktarın.Ardından, iğneyi hazırlayın ve 20 millimolar GDP Fuk all ile beraber izleyici olarak %5lor, 5 94 dekstrin veya negatif kontrol olarak 0,2 molar potasyum klorür içinde %0,1 fenol kırmızısı yükleme boyası içeren iki mikrolitre enjeksiyon solüsyonu ile doldurun. Enjeksiyon solüsyonundaki GDP FUCA yerine GDP Fuco koyun. Şimdi iğneyi kırın ve bir nanolitre damla elde edene kadar enjeksiyon basıncını ve süresini ayarlayın.Ardından, yumurtalara çözeltiden bir nanolitre enjekte edin. Son olarak, enjekte edilen yumurtaları E3 embriyo ortamı ile doldurulmuş agroz kaplı Petri kaplarına aktarın ve döllenmeden sonraki üç ila dört saat içinde 28 °C'de inkübe edin. Embriyolar geç gastrülasyon doku segmentasyonu ve erken larva gibi istenen gelişim aşamalarına ulaştığında, döllenmemiş yumurtaları uzaklaştırın.96 kuyucuklu bir plakanın tabanını aros ile kaplayın. Her bir kuyucuğa 92 µL embriyo medyumu ekleyin, ardından su içindeki 2,5 mM stoktan 4 µL 4 88 azide ve alevle cilalanmış cam pastier pipet kullanarak 2 µL B-T-T-E-S bakır sülfat altı-bir kompleksini ekleyin. Kuyucuğa beşten az embriyo transfer edin.Klik kimyası reaktiflerini eklemeye devam ederek, taze hazırlanmış 100 millimolar sodyum askorbatın 2,5 microliters'ini ekleyin. Klik reaksiyonunu başlatmak için üç dakika boyunca reaksiyona bırakın. Şimdi, reaksiyonu sonlandırmak için biyouyumlu bir bakır şelatlayıcı olan 50 millimolar batho Cooper wine sulfonate'den iki microliters ekleyin ve hemen 100 microliters embriyo medyumu ile seyreltin.Embriyoları cam bir petri kabına aktarın ve işlem görmüş embriyoları 15 mililitre embryo.Medium ile iki kez yıkayın. Mat tek cam tabanlı mikro kuyucuklu bir kaba bir damla ultra düşük erime noktalı agar koyun ve bir embriyoyu agar damlasına aktarın. Embriyoyu konumlandırın ve kabı beş dakika boyunca buz üzerinde bekletin.Agros damlasını katılaştırmak için, agrosu kaplayana kadar kaba yavaşça embriyo medyumu ekleyin. Damlatma işlemini sırayla gerçekleştirin. Konfokal mikroskop kullanarak beş mikronluk adım aralıklarıyla floresan ve aydınlık alan görüntüleri elde edin ve kompozit figürler oluşturun.Görüntü kullanılarak. J-B-T-T-E-S, NC two tarafından üretilen bakır one ile koordine olduğunda bakır a c'yi dramatik şekilde hızlandıran ve belirgin bir toksisite olmaksızın canlı sistemlerde siklo ekleme reaksiyonunu hızla teşvik eden triamin tabanlı bir ligandır. Burada, zebrafish embriyoları B-T-T-E-S aracılı bakır ile işaretlenmiştir.Üç dakikalık click reaksiyonunun hemen ardından, döllenmeden 9,5 saat sonra A a C. Beklendiği gibi, GDPF ile işlem görmüş tüm embriyoların güçlü etiketlemesi tespit edilmektedir. GDP ile mikroenjekte edilen kontrol embriyoları için yalnızca arka plan floresanlığı tespit edilmiştir. Etiketleme ve görüntüleme, döllenmeden sonraki 2,5 ile 96 saat arasındaki herhangi bir zamanda gerçekleştirilebilir.Bu görüntüler, döllenmeden 24 ve 48 saat sonra elde edilmiştir. Pulse chase yöntemi. Bu stratejinin kullanımı, farklı zaman noktalarında üretilen Alcon fukoların farklı renklerdeki floroforlarla işaretlendiği sated glikanların dinamik biyosentezinin izlenmesini sağlar.Bu prosedür, zebra balığı embriyogenezi sırasında bireysel glikan sentezleyici enzimlerin spesifik rollerini incelemek için genetik mutantlar veya morfoloji tabanlı genetik baskılama teknikleriyle birleştirilebilir. Bu yöntem gliko biyosentezi hakkında bilgi sağlayabildiği gibi, likidasyon sırasında asetilasyon gibi diğer post-translasyonel modifikasyonlara da uygulanabilir.Ayrıca yeni sentezlenen proteinlerin incelenmesinde de uygulanabilir.

imaging-glycans-zebrafish-embryos-metabolic-labeling-bioorthogonal

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz zebrafish transgenik embriyolar multiwell plakaları otomatik olarak görüntüleme ve analiz için bir sistem geliştirme raporu. Fibroblast Büyüme Faktörü muhabiri gen ekspresyonu üzerine küçük bir molekül, BCI, doza bağımlı etkileri ölçmek ve yüksek verimli zebrafish kimyasal ekranlar kurulması için teknoloji yeteneğini göstermektedir.

Zebrafish kimyasal ekranlar için otomatik görüntüleme ve analiz geliştirilmesi.

Erken embriyo şekli morfogenetik süreçleri anlamanın anahtarı, yüksek çözünürlükte görüntü hücrelerinin yeteneği. Biz burada tüm zebrafish embriyolar membran hedefli Yeşil Floresan Protein hücrelerin tek hücreler veya küçük kümeler etiketleme için kullanılan bir tekniktir açıklar.

Zebra balığı Beyin Etiketleme ve Görüntüleme Hücreleri

Bu video, zebra balığı radyal glia progenitörlerinde Notch/DeltaD sinyalini görüntülemek için bir antikor alım testini göstermektedir. Agaroza gömülü dekoryonlu zebra balığı embriyolarının monte edilmesini, RGP'ler üzerinde DeltaD ligandlarını hedefleyen bir boya çözeltisinin enjekte edilmesini ve Notch / DeltaD sinyal aktivasyonunu doğrulayan asimetrik hücre bölünmesi için bir floresan mikroskobu altında görüntülemeyi içerir.

Zebra Balığı Radyal Glia Progenitörlerinde Çentik/DeltaD Sinyalini Görüntülemek için Bir Antikor Alım Testi

Zebra balığı embriyo gelişim biyoloji araştırma için mükemmel bir model. Embriyogenez sırasında, zebra balığı örnek gözlem ve analiz için üç-boyutlu zorluklar sunuyor, bir yumurta sarısı kitle ile gelişir. Bu protokol situ (DİLERİZ) lekeli Zebra balığı embriyo örnekleri içinde bütün montaj iki-boyutlu düz monte hazırlıkları nasıl oluşturulacağı açıklanır.

Tüm Dağı ile Zebra balığı Embriyo örnekler Vitray gözlenmesi ve Analiz Daire Dağı Hazırlık<em&gt; In situ</em&gt; Melezleme

Organellerin ve diğer hücre altı yapıların dinamik davranışlarını in vivo olarak görüntülemek, fizyolojik ve hastalık durumlarındaki işlevlerine ışık tutabilir. Burada, iki organeli, sentrozomları ve mitokondriyi genetik olarak etiketlemek ve dinamiklerini geniş alan ve konfokal mikroskopi kullanarak canlı zebra balığı embriyolarında görüntülemek için yöntemler sunuyoruz.

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

Zebra balığı embriyolarında bulunan düşük bolluktaki endojen reseptörlerin tespiti için yeni bir teknik tanımlanmıştır. Buna AFLIP adını verdik çünkü reseptörün immünopresipitasyona bağlı ligandı tarafından afinite etiketlemesinden oluşuyor.

Zebra balığı Embriyolar Endojen Reseptör Affinity Etiketleme Tespiti

Bu çalışma, zebra balığı içinde akut ve kronik hiperglisemi modelleri oluşturmak için kullanılan yöntemleri açıklamaktadır. Amaç, hipergliseminin, yapısal ve yaralanmaya bağlı nörogenez gibi fizyolojik süreçler üzerindeki etkisini araştırmaktır. İş ayrıca PET / CT'yi kullanarak radyoaktif işaretlenmiş molekülleri (burada [18F] -FDG) takip etmek için zebrafish kullanımını vurguluyor.

Zebra basımında Akut ve Kronik Hiperglisemi Modelleri: Hipergliseminin Nörogenez Üzerindeki Etkisini ve Radyoaktif Etiketli Moleküllerin Biyo Dağılımını Değerlendiren Bir Yöntem

Burada, rutin mikroskopi ekipmanı kullanarak hücre içi sialillenmiş N-glikoproteinlerin biyogörüntülemesine izin veren metabolik oligosakkarit mühendisliği, tıklama kimyası ve genleşme mikroskobunu birleştiren basit bir protokol öneriyoruz.

Click Kimyası ve Genleşme Mikroskobu ile Hücre İçi Sialilasyonun Görselleştirilmesi

Burada, özellikle zebra balıklarında düşük bolluktaki proteinleri görselleştirmek için yararlı olan, yeni geliştirilen ve modifiye edilen bir in vivo sistem olan zebra balığı larvalarında proteinleri floresan protein etiketi ile etiketlemek için bir protokol sunuyoruz.

Zebra balıklarında düşük eksprese edilen proteinleri görselleştirmek için floresan etiketleme

Mikroenjeksiyon döllenmiş zebrafish embriyolar içine yabancı maddeler tanıtmak için bir köklü ve etkili bir yöntemdir. Burada, mRNA aşırı ekspresyonu gerçekleştirmek için sağlam bir mikroenjeksiyon tekniği ve morfolino oligonükleotid gen devirme çalışmaları zebrafish göstermektedir.

Zebra balığı Embriyolar mRNA ve morfolino Antisens Oligonükleotidler Mikroenjeksiyon.

Öğrenin, bioorthogonal tıklama kimyası kullanarak zebra balığı embriyolarında glikanların hızlı ve invaziv olmayan etiketlenmesi yöntemini. Bu teknik, fukozillenmiş glikanların dinamik görüntülenmesini sağlar.

Metabolik Etiketleme ve Bioorthogonal tıklayın Kimya Zebra balığı Embriyolar Görüntüleme glukanlardır

Daha fazla video keşfet