Name: Konsantrasyon belirlenmesi Micro hacimli Bio-spec Nano Spektrofotometre Nükleik Asitler ve Proteinler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-17T18:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Öğrenin mikro hacimli spektrofotometre ile nükleik asit ve protein konsantrasyonlarını hızlı ve tekrarlanabilir şekilde ölçme yöntemini. BioSpec-nano cihazı ultra küçük örnek hacimlerinde yüksek doğruluk sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. DNA kantitasyonu Prosedürü <ol><li> Cihazı ON açın. </li><li> PC masaüstü BioSpec nano yazılımı açın. </li><li> Basit Nükleik Asit-dsDNA sekmesinde (Şekil 1) üzerine tıklayın. </li><li> Yazılım aracı ile iletişim kurmak ve bir başlatma sırası çalışacaktır. Bu cihazın özelliklerine göre performans olduğunu doğrular. </li><li> 0.7 veya 0.2 mm yollu kaydırıcıyı seçin. Bu yollu seçer ve tüm hesaplamalar seçilen yollu dayanmaktadır. </li><li> BioSpec-nano yazılımını tıklatın Setup Autowiping kurulum Next. 1 veya 2 seçeneğini seçin. </li><li> Pipet 2 mcL (0.7 mm), H 2 O veya kaide tampon . </li><li> Boş veya F6 boş ölçümü için tıklayın. Her zaman yeni yollu boş bir kayıt için gerekli olan seçilir. </li><li> Pipet 2 mcL kaide üzerinde örnek. </li><li> Başlat yazılım veya cihazın start düğmesine basınız tıklayın. Üst pencere örnek damlacık ile temas yapmak için harekete geçti. Xenon yanıp söner görülebilir. </li><li> Tekrarlanabilirlik belirlemek için aynı örnek 3 kez tekrarlayın. </li><li> Kaydedilen tüm veriler. Bud dosyası olarak kaydedilir. </li><li> Pdf / csv veya F9 bir pdf veya. Csv dosyası olarak kaydetmek için Kaydet'i tıklatın. Sonuçlar ayrıca, kaydetme sekmesinde uygun seçimi kullanarak bir. Csv dosyası olarak kaydedilebilir. </li></ol> 2. Protein kantitasyonu Protokolü <ol><li> Protein kantitasyonu sekmesini seçin (Şekil 2). </li><li> Eğer biliniyorsa, yok olma katsayısı e280 girin. </li><li> E280 bilinmemektedir e280Calc kullanarak hesaplayabilirsiniz. </li><li> 0.7 veya 0.2 mm yollu kaydırıcıyı seçin. </li><li> Setup Autowiping kurulumu tıklayın. 2 seçin veya yukarıda. </li><li> Pipet 3 mcL (0.2 mm), H 2 O veya kaide tampon . </li><li> Boş veya F6 boş ölçümü için tıklayın. </li><li> Pipet 3 mcL kaide üzerinde protein örnek. </li><li> Başlat yazılım veya cihazın start düğmesine basınız tıklayın. </li><li> Tekrarlanabilirlik belirlemek için aynı örnek 3 kez tekrarlayın. </li><li> Kaydedilen tüm veriler. Bud dosyası olarak kaydedilir. </li><li> Pdf / csv veya F9 bir pdf veya. Csv dosyası olarak kaydetmek için Kaydet'i tıklatın. </li></ol> 3. Temsilcisi Sonuçlar: 1. DNA kantitasyonu Sonuçları Şekil 3 tipik bir çift iplikli DNA örneği üzerinde yapılan ölçümlerde elde edilen veriler göstermektedir. Konsantrasyon ve OD 260/280 oranı hesaplanır de gösterilir. Şekil 4 DNA kantitatif için tekrarlanabilirlik test sonuçları içerir. Şekil 3 ve 4 gösterileri sonuçları veri 0.26% düşük bağıl standart sapma belirgin olarak yüksek oranda tekrarlanabilir. Not 1: DNA kantitatif yanlışlığından UV bölgede absorbe tampon bileşenlerinin varlığı ortaya çıkabilir. Ayrıca homojen bir örnek çözümü kullanmak gereklidir. Pipetle numune miktarı, doğru ciltlik kabarcıkları giriş olmadan sadece 1-2 mcL dikkatli pipetleme olduğu için gereklidir. 2. Protein kantitasyonu Sonuçları Şekil 5 BSA için protein konsantrasyonu analizi temsil eder. Mcg / ml protein konsantrasyonu e280 değeri dayanmaktadır. Şekil 6 tekrarlanabilirlik analiz gösterir. DNA için değil, aynı zamanda proteinlerin sadece BioSpec-nano tam konsantrasyonu ölçen 0.51% bağıl standart sapma açıktır. Not 2: protein konsantrasyonu etkileyen faktörler PH, tamponlar, sıcaklık veya katkı kaynaklanan istikrarsızlık itibaren en az etkileri vardır, doğru protein konsantrasyonu tespiti mümkün olmaktadır. En çok saflaştırılmış protein işleme çeşitli adımlar geçer; dolayısıyla protein damlacık oluşumu ile etkileyebilir yüzey veya diğer katkı maddeleri içerebilir mümkündür. Bu tür örnekler için, 5 mm yollu kuvars hücre kullanarak şiddetle tavsiye edilir. <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1, çift iplikli DNA kantitatif için analit seçim penceresi <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 etiketli olmayan protein kantitatif analit seçim penceresi <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 DNA kantitatif Temsilcisi veri <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 Tekrarlanabilirlik veri DNA kantitatif <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5 protein kantitatif veri Temsilcisi <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig6.jpg" alt="Şekil 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt='"Şekil'> Şekil 6 protein kantitatif veri Tekrarlanabilirlik

<ol><li>Aisubel, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAisubel%2C+F+%22Short+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Short Protocols in Molecular Biology</a>. , 4th edition, WILEY. (1999).</li>
<li>Pace, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+measure+and+predict+molar+absorption+coefficient+of+a+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">How to measure and predict molar absorption coefficient of a protein.</a> Protein Science. 4, 2411-2423 Forthcoming.</li>
</ol>

Suja Sukumaran, Doktora Shimadzu bir çalışanın bu makalede yer alet yapar.

BioSpec-nano DNA kantitatif yöntemleri doğasında mevcut sorunlar, tutarsız sonuçlar ve sıkıcı el emeği çözmek için tasarlandı. Her ölçüm deneyimli bir moleküler biyolog, bir dakika içinde 3-6 hakkında birden fazla numune analiz etmek için izin, sadece 3 saniye sürer. Benzersiz silecek özelliği sadece ölçüm verimini artırır, aynı zamanda, ölçümler arasında ihmal edilebilir taşınmasını kaideleri manuel temizlik ihtiyacını ortadan kaldırır. Ayrıca, 1000 ng / ml içeren DNA örnekleri için sadece 2 mendil kullanarak, testler, taşınmasını belirtilen en az 2 ng / mcL. 5 mm yollu hücre durumu seyreltik nükleik asit ve protein örnekleri analiz etmek için bir seçenek sunar ve diğer uygulamalar için bu alet kullanımı uzanır.

<table><tbody><tr><td>BioSpec-nano</td><td>Shimadzu Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buzağı Timus DNA'sı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

konsantrasyon belirlenmesi micro hacimli bio-spec nano spektrofotometre nükleik asitler ve proteinler

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nükleik Asit kantitatif prosedürleri, son üç yıl içinde önemli ölçüde gelişmiş var. Daha fazla, moleküler biyologlar, deneyler için nükleik asit örneklerinin tutarlı küçük hacimli bir analiz gerektirir. BioSpec-nano sorunları özel optik ve hassas bir PDA dedektörü ile doğasında mevcut DNA kantitatif yöntemler yanlış, non-tekrarlanabilir sonuçlar, olası bir çözüm sağlar. BioSpec-nano fiber optik eleman ve manuel temizleme, sıkıcı tekrarlayan ve tutarsız yerleştirme da böylece ortadan kaldırarak, montaj, ölçme ve temizleme aracı tarafından yapılır böyle otomatik bir işlevselliğe sahiptir. Bu çalışmada, veriler, DNA ve protein, ölçüm tekrarlanabilirlik ve doğruluk gibi miktarının sunulmaktadır. Otomatik numune temas ve hızlı tarama mükemmel verim, üç saniye ölçüm sağlar. Veri analizi yazılımı yerleşik özellikleri kullanarak yapılmaktadır. DNA konsantrasyonu hesaplamak için kullanılan formül: Örnek Konsantrasyon = DF · (OD260-OD320) · NACF (1) Nerede = örnek seyreltme faktörü ve NACF = nükleik asit konsantrasyon faktörü DF. Nükleik Asit konsantrasyon faktörü 1 seçilen analit göre ayarlanır. Protein konsantrasyonu sonuçları mcg / mL ya da e280 ve molekül ağırlığı değerleri sırasıyla girerek mol / L olarak ifade edilebilir. E280Calc sekmesinde Tyr, Trp ve Sistein (SS bağı) kalıntı değerleri girildiğinde, yok olma katsayısı değerleri e280 olarak hesaplanan 5500 = x (Trp artıkları) + 1490 x (Tyr artıkları) + 125 x (sistein SS bond) . E280 değeri yazılım tarafından konsantrasyonunun hesaplanması için kullanılır. BioSpec-nano, nükleik asitler ve protein konsantrasyonu tayin ek olarak diğer birçok analitler için ultra mikro hacim spektrofotometre ya da 5 mm yollu hücreleri kullanarak, standart bir spektrofotometre olarak kullanılabilir.

Bu iletişim, doğruluk ve tekrarlanabilirlik dsDNA ve protein kantitatif BioSpec-nano UV-VIS spektrofotometre veri sunmaktadır. Ultra-küçük birimler bile otomatik silme fonksiyonu, hacmi ve daha kesin sonuçlar için en az taşınmasını sonuçları artırıyor (1 ila 2 L), tekrarlanabilirlik, mükemmel.

Konsantrasyon belirlenmesi Micro hacimli Bio-spec Nano Spektrofotometre Nükleik Asitler ve Proteinler

Nükleik asit miktar tayini prosedürleri son otuz yılda önemli ölçüde gelişmiştir. Moleküler biyologlar giderek daha fazla tutarlı ...

Bu prosedürün genel amacı, bir mikro hacim spektrofotometresi kullanarak nükleik asit ve protein konsantrasyonlarını doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde belirlemektir. Bu işlem, öncelikle ölçülecek örnek için uygun ışık yolu uzunluğunun seçilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı ise bir kör ölçüm yapmaktır.Ardından, DNA veya protein örneği ölçülür. Prosedürün son adımı, verilerin PDF veya CSV formatında kaydedilmesidir. Nihayetinde, DNA ve protein için yüksek düzeyde tekrarlanabilir sonuçlar elde edilir.Bu yöntemle hızlı ve doğru bir şekilde kantitasyon sağlanabilir. Bu tekniğin temel avantajı hızlı, hassas ve tekrarlanabilir olmasıdır. DNA Kantitasyonu prosedürüne başlamak için BIOS spec nano spektrofotometreyi açın.PC masaüstünden BIOS spec nano yazılımını açın. Basit nükleik asit D-S-D-N-A sekmesine tıklayın. Yazılım, cihazla iletişim kuracak ve bir başlatma dizisi çalıştıracaktır.Bu, cihazın spesifikasyonlara uygun şekilde çalıştığını doğrular. Ardından, ışık yolu uzunluğunu seçin. Işık yolu uzunluğu sürgüsünü kullanın.Mikrolitre hacmindeki numuneler için üç seçenek mevcuttur. 0.2 milimetre veya 0.7 milimetre kullanılabilir. Seyreltik numuneler için ise beş milimetre yol uzunluğuna sahip bir küvet kullanma seçeneği bulunmaktadır.Bu gösterimde, iki mikrolitre örneğin ölçümü için 0,7 milimetre seçilmiştir. Tüm hesaplamalar seçilen yol uzunluğuna dayanmaktadır. Ardından yazılımda, kurulum sekmesine tıklayın ve otomatik silme kurulumunu seçin.Tek seferlik silme işlemi için bir tane seçin. Örnek ölçümü öncesinde veya yeni bir yol uzunluğu seçildiğinde her seferinde bir kör ölçüm yapılması gerekir. 0.7 mm yol uzunluğu için kaide üzerine iki µL su veya tampon ekleyin. Kör ölçüm için "blank" düğmesine tıklayın.Üst pencere, örnek damlacığıyla temas kurmak için hareket edecek ve ksenon flaşları gözlemlenebilecektir. Ölçüm tamamlandığında, silecek örneği otomatik olarak temizleyecektir. Artık örnek ölçülebilir.Çözünmemiş partiküllerin varlığı tekrarlanamayan verilere yol açacağından, homojen bir numune çözeltisi kullanmak önemlidir. Hava kabarcığı oluşumunu önlemek için numuneden iki mikrolitre dikkatlice aspire edin ve ardından numuneyi pipet ucundan pedestal üzerine homojen bir şekilde pipetleyin.Cihaz üzerindeki başlat düğmesine basın. Daha önce olduğu gibi, üst pencere örnek damlacığıyla temas kurmak için hareket edecektir ve tekrarlanabilirliği belirlemek için xenon flaşları gözlemlenebilir; aynı örneğin ölçümünü üç kez tekrarlayın; kaydedilen tüm veriler otomatik olarak bir BUD dosyası olarak kaydedilir. PDF veya CCSV dosyası olarak kaydetmek için save P-D-F-C-S-V seçeneğine tıklayın.Sonuçlar, kaydet sekmesindeki uygun seçim kullanılarak bir CSV dosyası olarak da kaydedilebilir. Protein miktar tayini, 280 nm absorbans yöntemi kullanılarak yapılabilir. Protein miktar tayini için protein miktar tayini sekmesini seçin.Biliniyorsa söndürme katsayısı epsilon 280 değerini girin; eğer Epsilon 280 bilinmiyorsa, Epsilon 280 calc kullanarak hesaplayın. 3 µL örneği ölçmek için yol uzunluğu sürgüsünden 0.2 mm seçeneğini belirleyin. Ardından yazılımda, kurulum sekmesine tıklayın ve otomatik silme kurulumunu seçin. Herhangi bir örnek taşınmasını önlemek ve doğru bir okuma sağlamak için iki silme işlemi için 2 değerini seçin.Boş pipet ölçümü yapmak için kaide üzerine üç microliters su veya tampon ekleyin, ardından boş ölçüm için blank seçeneğine tıklayın. Sonra, dikkatlice üç microliters protein örneğini kaide üzerine pipetleyin. Örnek ölçümüne başlamak için, içeriye hava kabarcığı girmemesine dikkat ederek yazılımdaki start düğmesine tıklayın veya cihaz üzerindeki start düğmesine basın.Gösterilen tekrarlanabilirliği belirlemek için aynı örneğin ölçümünü üç kez tekrarlayın. Burada, tipik bir çift sarmallı DNA örneği üzerindeki ölçümlerden elde edilen veriler yer almaktadır. DNA konsantrasyonunu hesaplamak için kullanılan formül; örnek konsantrasyonu, DF çarpı (OD 260 eksi OD 320) çarpı NACF'ye eşittir; burada DF örnek dilüsyon faktörünü, NACF ise nükleik asit konsantrasyon faktörünü temsil eder.Nükleik asit konsantrasyon faktörü, seçilen analite uygun olarak ayarlanır. Hesaplanan nükleik asit konsantrasyonu ve OD 260/280 oranı belirtilir. Bu tablo, DNA kantifikasyonu için tekrarlanabilirlik testi sonuçlarını içermektedir.Veriler birlikte ele alındığında, %0,26'lık düşük bağıl standart sapmadan da anlaşıldığı üzere sonuçların oldukça tekrarlanabilir olduğu görülmektedir. BSA için yapılan bir protein konsantrasyon analizinden elde edilen temsili sonuçlar burada gösterilmiştir. Mililitre başına mikrogram protein konsantrasyonu, Epsilon iki 80 değerine dayanmaktadır. Son olarak, bu tablo protein miktar tayininin tekrarlanabilirlik analizini göstermektedir.%0,51'lik bağıl standart sapma, BIOS spec nano'nun sadece DNA için değil, proteinler için de optik yoğunluğu (OD) doğru bir şekilde ölçtüğünü göstermektedir. Yöntem kavrandıktan sonra, bir dakika içinde birden fazla örnek analiz edilebilir.

concentration-determination-nucleic-acids-proteins-using-micro-volume

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Microvolume örnekleri doğal yüzey gerilimi, küvet ya da kılcal damarların kullanmadan örnekleri korumak için kullanan bir spektrofotometre sistem tarafından sayısal. Ölçülebilir olan protein konsantrasyonları ve hız dinamik aralık, bu yöntem büyük ölçüde artmıştır.

NanoDrop 2000c Spektrofotometre kullanılarak Microvolume Protein Konsantrasyonu Tayini

Kütle spektrometresi büyük protein kompleksleri ve analiz etmek için değerli bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Bu yöntem, çok-altbirim meclislerinin bileşimi, stokiyometri ve genel mimari içgörüler sağlar. Burada, tarif, adım-adım yapısal bir kütle spektrometresi analizi gerçekleştirmek ve makromoleküler yapıları karakterize etmek için nasıl.

Yapısal Kütle Spektrometresi büyük protein kompleksleri Analiz

Pratik ve verimli bir alternatif olarak geleneksel nükleik asit kantitatif metodolojiye NanoDrop microvolume sistemlerinin kullanımı iki microvolume nükleik asit kantitatif protokolleri gösteri ile tarif edilir.

Nükleik Asitlerin NanoDrop Microvolume kantitasyonu

Nanoparçacık izleme analizi (NTA) ve polimerik gen teslimat nanopartiküller değerlendirmek için high-throughput Akım sitometri için bir protokol tanımlanmıştır. NTA nanoparçacık parçacık büyüklüğü dağılımı ve plazmid başına parçacık dağılımını karakterize etmek için kullanılmaktadır. Yüksek throughput flow sitometri gen teslimat biyomalzemelerin bir kütüphane için nicel transfeksiyon etkinliği değerlendirilmesini sağlar.

Polimerik Gen Taşıyıcı Değerlendirilmesi Nanoparçacık İzleme Analizi ve Yüksek throughput Flow Sitometri tarafından Nanopartiküller

Nanoparçacık tabanlı optik problar, Raman ve UV-Vis spektroskopisi kullanarak antijenleri tespit etmek için bir araç olarak tasarlanmıştır. Burada, gelecekteki çoğullama yeteneklerini içerecek şekilde bir UV-Vis/Raman spektroskopisi immünolojik testi için bu tür probların hazırlanması için bir protokol açıklanmaktadır.

Bir UV-Vis ve Raman Spektroskopisi İmmunoassay Platformu imalatı

Biz kızılötesi nanospectroskopi ve yüksek çözünürlüklü atomik kuvvet mikroskobu oligomerik agregalar ve amiloid fibrils içine protein kendini montaj sürecini görselleştirmek için uygulama açıklar, yakından başlangıç ve geliştirme ile ilişkilidir insan nörodejeneratif bozuklukların geniş bir yelpazede.

Bireysel Protein Agregalarının Kızılötesi Nanospektroskopi ve Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Karakterizeleştirilmesi

Fare perigonadal yağ dokusundan ve insan plazmasından izole edilmiş hücre dışı veznelerin boyut dağılımını ve toplam partikül konsantrasyonu tahmin etmek için yeni bir nanopartikül izleme analiz aracının nasıl kullanılacağını gösteriyoruz.

Hücre Dışı Veziklinlerin Nicelleştirilmesi ve Boyut Tayini için Nanopartikül Takip Analizi

Burada, nanodiskler içeren biyoaktif ajanların üretimini ve karakterizasyonunu açıklıyoruz. Amfoterisin B nanodiskleri, protokolü aşamalı olarak tanımlamak için örnek olarak alınmıştır.

Nanodisk İçeren Biyoaktif Ajanın Formülasyonu ve Karakterizasyonu

Burada, bir evaporatif ışık saçılma dedektörü (ELSD) ile birleştirilmiş yüksek performanslı sıvı kromatografisi kullanarak bir lipid nanopartikül (LNP) RNA dağıtım sistemindeki dört bileşen için kantitatif bir analiz yöntemi oluşturuyoruz. Yöntem iyi ayırma, yüksek hassasiyet ve yüksek verime sahiptir.

Evaporatif Işık Saçılma Dedektörü ile Birleştirilmiş Sıvı Kromatografisi ile Bir Lipid Nanopartikül RNA Taşıyıcı Sistemdeki Dört Bileşenin Belirlenmesi

Burada lipidik mesophases membran proteinlerinin kristalizasyon denemeleri elle kurmak için Caffrey Membran Yapısal ve Fonksiyonel Biyoloji Grubu uygulanan prosedür açıklanmıştır.

Lipidik Mesophases kullanarak Yapı Tayini için Membran Proteinleri Kristalize

Öğrenin mikro hacimli spektrofotometre ile nükleik asit ve protein konsantrasyonlarını hızlı ve tekrarlanabilir şekilde ölçme yöntemini. BioSpec-nano cihazı ultra küçük örnek hacimlerinde yüksek doğruluk sağlar.

Konsantrasyon belirlenmesi Micro hacimli Bio-spec Nano Spektrofotometre Nükleik Asitler ve Proteinler

Daha fazla video keşfet