Konsantrasyon belirlenmesi Micro hacimli Bio-spec Nano Spektrofotometre Nükleik Asitler ve Proteinler

Bu prosedürün genel amacı, bir mikro hacim spektrofotometresi kullanarak nükleik asit ve protein konsantrasyonlarını doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde belirlemektir. Bu işlem, öncelikle ölçülecek örnek için uygun ışık yolu uzunluğunun seçilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı ise bir kör ölçüm yapmaktır.

Ardından, DNA veya protein örneği ölçülür. Prosedürün son adımı, verilerin PDF veya CSV formatında kaydedilmesidir. Nihayetinde, DNA ve protein için yüksek düzeyde tekrarlanabilir sonuçlar elde edilir.

Bu yöntemle hızlı ve doğru bir şekilde kantitasyon sağlanabilir. Bu tekniğin temel avantajı hızlı, hassas ve tekrarlanabilir olmasıdır. DNA Kantitasyonu prosedürüne başlamak için BIOS spec nano spektrofotometreyi açın.

PC masaüstünden BIOS spec nano yazılımını açın. Basit nükleik asit D-S-D-N-A sekmesine tıklayın. Yazılım, cihazla iletişim kuracak ve bir başlatma dizisi çalıştıracaktır.

Bu, cihazın spesifikasyonlara uygun şekilde çalıştığını doğrular. Ardından, ışık yolu uzunluğunu seçin. Işık yolu uzunluğu sürgüsünü kullanın.

Mikrolitre hacmindeki numuneler için üç seçenek mevcuttur. 0.2 milimetre veya 0.7 milimetre kullanılabilir. Seyreltik numuneler için ise beş milimetre yol uzunluğuna sahip bir küvet kullanma seçeneği bulunmaktadır.

Bu gösterimde, iki mikrolitre örneğin ölçümü için 0,7 milimetre seçilmiştir. Tüm hesaplamalar seçilen yol uzunluğuna dayanmaktadır. Ardından yazılımda, kurulum sekmesine tıklayın ve otomatik silme kurulumunu seçin.

Tek seferlik silme işlemi için bir tane seçin. Örnek ölçümü öncesinde veya yeni bir yol uzunluğu seçildiğinde her seferinde bir kör ölçüm yapılması gerekir. 0.7 mm yol uzunluğu için kaide üzerine iki µL su veya tampon ekleyin. Kör ölçüm için "blank" düğmesine tıklayın.

Üst pencere, örnek damlacığıyla temas kurmak için hareket edecek ve ksenon flaşları gözlemlenebilecektir. Ölçüm tamamlandığında, silecek örneği otomatik olarak temizleyecektir. Artık örnek ölçülebilir.

Çözünmemiş partiküllerin varlığı tekrarlanamayan verilere yol açacağından, homojen bir numune çözeltisi kullanmak önemlidir. Hava kabarcığı oluşumunu önlemek için numuneden iki mikrolitre dikkatlice aspire edin ve ardından numuneyi pipet ucundan pedestal üzerine homojen bir şekilde pipetleyin.

Cihaz üzerindeki başlat düğmesine basın. Daha önce olduğu gibi, üst pencere örnek damlacığıyla temas kurmak için hareket edecektir ve tekrarlanabilirliği belirlemek için xenon flaşları gözlemlenebilir; aynı örneğin ölçümünü üç kez tekrarlayın; kaydedilen tüm veriler otomatik olarak bir BUD dosyası olarak kaydedilir. PDF veya CCSV dosyası olarak kaydetmek için save P-D-F-C-S-V seçeneğine tıklayın.

Sonuçlar, kaydet sekmesindeki uygun seçim kullanılarak bir CSV dosyası olarak da kaydedilebilir. Protein miktar tayini, 280 nm absorbans yöntemi kullanılarak yapılabilir. Protein miktar tayini için protein miktar tayini sekmesini seçin.

Biliniyorsa söndürme katsayısı epsilon 280 değerini girin; eğer Epsilon 280 bilinmiyorsa, Epsilon 280 calc kullanarak hesaplayın. 3 µL örneği ölçmek için yol uzunluğu sürgüsünden 0.2 mm seçeneğini belirleyin. Ardından yazılımda, kurulum sekmesine tıklayın ve otomatik silme kurulumunu seçin. Herhangi bir örnek taşınmasını önlemek ve doğru bir okuma sağlamak için iki silme işlemi için 2 değerini seçin.

Boş pipet ölçümü yapmak için kaide üzerine üç microliters su veya tampon ekleyin, ardından boş ölçüm için blank seçeneğine tıklayın. Sonra, dikkatlice üç microliters protein örneğini kaide üzerine pipetleyin. Örnek ölçümüne başlamak için, içeriye hava kabarcığı girmemesine dikkat ederek yazılımdaki start düğmesine tıklayın veya cihaz üzerindeki start düğmesine basın.

Gösterilen tekrarlanabilirliği belirlemek için aynı örneğin ölçümünü üç kez tekrarlayın. Burada, tipik bir çift sarmallı DNA örneği üzerindeki ölçümlerden elde edilen veriler yer almaktadır. DNA konsantrasyonunu hesaplamak için kullanılan formül; örnek konsantrasyonu, DF çarpı (OD 260 eksi OD 320) çarpı NACF'ye eşittir; burada DF örnek dilüsyon faktörünü, NACF ise nükleik asit konsantrasyon faktörünü temsil eder.

Nükleik asit konsantrasyon faktörü, seçilen analite uygun olarak ayarlanır. Hesaplanan nükleik asit konsantrasyonu ve OD 260/280 oranı belirtilir. Bu tablo, DNA kantifikasyonu için tekrarlanabilirlik testi sonuçlarını içermektedir.

Veriler birlikte ele alındığında, %0,26'lık düşük bağıl standart sapmadan da anlaşıldığı üzere sonuçların oldukça tekrarlanabilir olduğu görülmektedir. BSA için yapılan bir protein konsantrasyon analizinden elde edilen temsili sonuçlar burada gösterilmiştir. Mililitre başına mikrogram protein konsantrasyonu, Epsilon iki 80 değerine dayanmaktadır. Son olarak, bu tablo protein miktar tayininin tekrarlanabilirlik analizini göstermektedir.

%0,51'lik bağıl standart sapma, BIOS spec nano'nun sadece DNA için değil, proteinler için de optik yoğunluğu (OD) doğru bir şekilde ölçtüğünü göstermektedir. Yöntem kavrandıktan sonra, bir dakika içinde birden fazla örnek analiz edilebilir.