Name: Floresan Proteinleri Polarize Translokasyon Xenopus Wnt Sinyalizasyonu Cevabı Ektoderm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Öğrenin, Xenopus embriyo ektoderminde floresan proteinlerin polarize translokasyonunu inceleyerek Wnt sinyalizasyonuna yanıtı gözlemleyin. Bu yöntem, hücre polaritesi ve sinyal yolaklarının mekânsal düzenlenmesini anlamanıza yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Sokol laboratuvar Araştırma Ulusal Sağlık enstitüleri tarafından desteklenmektedir.

1 Xenopus Yumurta Vücut Dışında Döllenme <ol><li> Deney insan koryonik gonadotropin (400 ünite / kurbağa) 12 saat önce enjekte edildi dişi kurbağa yumurta alın. </li><li> 1 x Marc güncellenmiştir Zil yumurta solüsyonu (MMR) 10 ve disseke testis küçük bir parça ile in vitro döller küçük bir miktarı (0.5-1 ml) içine yerleştirin yumurta. 2-3 dakika sonra, yumurta tüm yüzeyini kaplayan 0,1 x MMR ekleyin. HCL (sodyum hidroksit ile pH 8 ayarlanabilir) - 20 dakika, yumurta jöle kat% 3 sistein tarafından kaldırıldı. Yumurta enjeksiyonları (13 ° C) 0,1 x MMR üç kez yıkanır ve soğuk bir inkübatör sol. </li><li> Döllenmiş yumurtalar 2-4 hücre aşamasına geliştirmek için izin verilir. Enjeksiyonlar için, embriyoların% 3 Ficoll, 0.5 x MMR içeren çözüm aktarılır. </li></ol> 2. RNA Mikroenjeksiyon <ol><li> RNA'lar mMessage mMachine kiti (Ambion) kullanarak Lineerleştirilmiş DNA şablonlardan sentezlenmiş ve 0.1-1 mg / ml stok konsantrasyonu RNaz içermeyen su ile seyreltilir. Enjeksiyonlar için optimal doz RNA'lar pilot deneylerde belirlenir. Diversin RFP, membran işaretleyici GFP-CAAX ve 8 Frizzled RNA'lar enjeksiyon başına 0.1-1 ng kullanılır. </li><li> Enjeksiyon iğneleri, sonra bir iğne değirmeni ve bir kılcal bir iğne çektirmenin ile hazırlanmıştır. Enjeksiyondan önce, her iğne sıvı enjeksiyon başına 10 nl çıkarmak için su ile kalibre edilir. </li><li> Enjeksiyonlar için, embriyolar% 3 Ficoll, 0.5 x MMR büyük bir damlacık içine plastik bir kaba yerleştirilir. Bir RNA çözüm mikrolitrelik Narishige mikroenjektör bir enjeksiyon iğnesi içine emilir. RNA 10 nl, 8 hücreli embriyolar 2-3 kez hayvan blastomer içine enjekte edilir. 12 plaka bir kuyuya enjekte edilen embriyolar transfer edilir. </li></ol> 3. Hazırlanması Ektodermal eksplantlar <ol><li> Enjekte edilen embriyoların erken gastrula sahne ulaştığınızda, 0,6 x 3 cm plastik tabak% 1 agaroz ile kaplı bir MMR çözüm aktarılır. Vitellin membran forseps bir çift el ile kaldırılır. Ektodermal eksplantlar Tungsten iğne ve hairloop kullanarak embriyolardan eksize. </li><li> Ektodermal eksplantlar bir cam şişenin içine aktarılır ve fosfat,% 3.7 formaldehit ile sabit 30 dakika tamponlu salin (PBS). Sabit eksplantlar PBS üç kez (her biri 10 dakika) ile yıkanır. DAPI çekirdekleri leke üçüncü yıkama dahil. </li><li> Eksplantlarındaki bir slayt cam monte edilmiştir. Seloteyip iki şerit slayt eklenir ve eksplantları iki şeritler arasına yerleştirilir. Eksplant dış yüzeyi pigmentli olduğundan, eksplant iç tarafında mikroskop amacı bakmalıdır. Iki-üç montaj çözümü 11 (PBS 25 mg / ml DABCO, anti-solmaya reaktif de dahil olmak üzere% 70 gliserol) 20 ul damla ekleyin. Lamel üstüne koyun. </li></ol> 4. Floresan Mikroskop altında eksplant Görüntüleme <ol><li> Numuneler uygun filtreler ile Zeiss Axioplan floresan mikroskop altında görülüyor. </li><li> Görüntüler belirli bir düzlemde birçok bağımsız eksplantlar görselleştirmek için Apotome eki ile alınır. </li></ol> 5. Cryosectioning Cryosectioning floresan proteinlerin hücre ve immün için daha uygun dağıtım görselleştirmek için alternatif bir yol. Evre 10 embriyolar Dent fiksatif (% 20 DMSO,% 80 metanol) ile 1-2 saat boyunca sabit PBS ile yıkanır ve% 15 balık gelatin/15% sakaroz çözeltisini 11 gömülü. Gömülü embriyolar hızlı kuru buz üzerinde donmuş ve cryosections Leica Kriyostat üretilir. Kesitler enjekte RNA'lar ve tercüme protein ürünleri miras ektodermal hücreler içerir. Bölümleri floresan korumak ve spesifik antikorlar ile boyanmış ve ardından floresan ile konjuge sekonder antikor ile etiketli olabilir. Çekirdekler DAPI ile boyandı. Montaj medya yukarıda açıklandığı gibi aynıdır. Yukarıda açıklandığı gibi görüntüleme yapılabilir. 6. Temsilcisi Sonuçlar: <img src="/files/ftp_upload/2700/2700fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Frizzled reseptör hücre zarı Diversin acemi Frizzled 8 (Xfz8) ve Div-RFP RNA'lar ifade Ektoderm hücreler yerine, hücre zarı Div-RFP ortaya centrosome (g-tubulin co-boyama ile ortaya). Deney düzen üst kısmında yer alır; tipik bir kesiti gösterilmiştir.

<ol><li>Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+induction+---+molecular+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic induction --- molecular aspects.</a> Development. 99, 285-306 (1987).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Principles+of+Developmental+Genetics%22">Principles of Developmental Genetics</a>. Moody, S. A. , Academic Press. (2007).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin signaling in development and disease.</a> Cell. 127, 469-480 (2006).</li>
<li>Klaus, A., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signalling+and+its+impact+on+development+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Wnt signalling and its impact on development and cancer.</a> Nat Rev Cancer. 8, 387-398 (2008).</li>
<li>Gordon, M. D., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling%3A+multiple+pathways%2C+multiple+receptors%2C+and+multiple+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling: multiple pathways, multiple receptors, and multiple transcription factors.</a> J Biol Chem. 281, 22429-22433 (2006).</li>
<li>Schwarz-Romond, T., Asbrand, C., Bakkers, J., Kuhl, M., Schaeffer, H. J., Huelsken, J., Behrens, J., Hammerschmidt, M., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ankyrin+repeat+protein+Diversin+recruits+Casein+kinase+Iepsilon+to+the+beta-catenin+degradation+complex+and+acts+in+both+canonical+Wnt+and+Wnt%2FJNK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The ankyrin repeat protein Diversin recruits Casein kinase Iepsilon to the beta-catenin degradation complex and acts in both canonical Wnt and Wnt/JNK signaling.</a> Genes Dev. 16, 2073-2084 (2002).</li>
<li>Moeller, H., Jenny, A., Schaeffer, H. J., Schwarz-Romond, T., Mlodzik, M., Hammerschmidt, M., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversin+regulates+heart+formation+and+gastrulation+movements+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Diversin regulates heart formation and gastrulation movements in development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 15900-15905 (2006).</li>
<li>Itoh, K., Jenny, A., Mlodzik, M., Sokol, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosomal+localization+of+Diversin+and+its+relevance+to+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Centrosomal localization of Diversin and its relevance to Wnt signaling.</a> J. Cell Sci. 122, 3791-3798 (2009).</li>
<li>Itoh, K., Jacob, J., Sokol, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Xenopus+Frizzled+8+in+dorsal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">A role for Xenopus Frizzled 8 in dorsal development.</a> Mech Dev. 74, 145-157 (1998).</li>
<li>Newport, J., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+developmental+transition+in+early+Xenopus+embryos%3A+I.+characterization+and+timing+of+cellular+changes+at+the+midblastula+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage.</a> Cell. 30, 675-686 (1982).</li>
<li>Itoh, K., Brott, B. K., Bae, G. U., Ratcliffe, M. J., Sokol, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+localization+is+required+for+Dishevelled+function+in+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear localization is required for Dishevelled function in Wnt/beta-catenin signaling.</a> J Biol. 4, 3-3 (2005).</li>
</ol>

Biz Diversin hücre içi lokalizasyonu karakterize etmek için, yukarıdaki protokolünü kullandık. Hayvan kutup eksplantlar, Diversin-RFP çekirdeğin yanında tespit edildi ve cryosections (Şekil 1) g-tubulin, centrosomal işaretleyici, kolokalize. Bir proteinin hücre içi lokalizasyonu tespit edildikten sonra, silme yapıları, hücre içi lokalizasyonu için gerekli ve yeterli olan protein etki alanı kurmak için oluşturulabilir. Bu yaklaşımı kullanarak, Diversin centrosomal yerelleştirme etki alanı ortasında eşlenmiş var ve protei...

floresan proteinleri polarize translokasyon xenopus wnt sinyalizasyonu cevabı ektoderm

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Hücre polarite, dinamik, embriyonik gelişim 1, 2 sırasında hem içsel ve dışsal faktörler tarafından düzenlenir ökaryotik hücrelerin temel bir özelliğidir. Bu yönetmelikte yer alan sinyal yollarının Bir Wnt yolunun, embriyogenez sırasında pek çok kez kullandım ve insan hastalığı 3, 4, 5 için kritik. Bu yolun birden fazla moleküler bileşenleri koordineli bir mekansal sınırlı bir şekilde sinyal düzenleyen, ancak altta yatan mekanizmalar tam olarak anlaşılmış değildir. Xenopus embriyonik epitel hücreleri çeşitli sinyal proteinlerin hücre içi lokalizasyonu çalışmak için mükemmel bir sistemdir. Floresan füzyon proteinleri RNA mikroenjeksiyon Xenopus embriyolar ifade, ektodermal eksplantlar hazırlanır ve protein yerelleştirme Epifloresans tarafından değerlendirilir. Bu deney protokolünde Diversin, sinyalizasyon ve hücre polarite tayini 6, 7 karışmış olan bir sitoplazmik proteinin hücre içi lokalizasyonu Wnt sinyal iletimi 8 çalışma Xenopus ektodermal hücreler görüntülenmiştir nasıl açıklar. Wnt ligand veya Frizzled reseptör Koekspresyon kırmızı floresan proteini, RFP erimiş Diversin dağılımını değiştiren ve kutuplaşmış bir moda 8, 9, hücre zarındaki bu işe. Bu ex vivo protokolü yararlı bir ek sinyal mekansal kontrol, sağlam doku farklıdır ve analiz etmek için çok daha zor olduğu kültür memeli hücrelerinin, in vitro çalışmalar olmalıdır .

Xenopus embriyonik ektoderm hücre polarite çalışmaları için cazip bir model haline gelmiştir. Bir tahlil floresan proteinlerin hücre içi dağıtım ektoderm hücreler değerlendirilir olduğu açıklanmıştır. Bu protokol adresi sorular sinyal mekansal kontrolü ile ilgili yardımcı olacaktır.

Floresan Proteinleri Polarize Translokasyon Xenopus Wnt Sinyalizasyonu Cevabı Ektoderm

Hücre polaritesi, embriyonik gelişim sırasında hem içsel hem de dışsal faktörler tarafından dinamik olarak düzenlenen, ökaryotik hücrelerin temel bir özelliğidir...

Bu prosedürün genel amacı, büyüme faktörü sinyalleşmesi üzerine proteinlerin hücre altı lokalizasyonundaki değişiklikleri incelemektir. Bu işlem, öncelikle erken evre xenopus embriyolarının hayvan blastomerlerine RFP ve sinyal reseptörü FRIZZLED sekiz'i kodlayan RNA'ların enjekte edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, elektrodermal implantlar ve/veya embriyo kriyokesitleri hazırlanır ve immün boyama yapılır.Son olarak, immün boyama yapılan hücreler floresan mikroskop kullanılarak görüntülenir. Nihayetinde, belirli bir proteinin hücre altı lokalizasyonunun embriyonik sinyal yollarına nasıl bağımlı olduğunu gösteren sonuçlar elde edilebilir. Örnek olarak, diverse proteininin FRIZZLED eight reseptörü tarafından sentrozomdan hücre membranına çekildiğini göstermekteyiz.Bu yöntem, araştırmacıların signaling proteinlerinin hücre altı lokalizasyonunu xenopus embriyolarını kullanarak in vivo olarak görselleştirmelerine olanak tanır. Bu, sinyal iletiminin uzaysal düzenlemesi ve hücre önceliği mekanizmaları üzerine yapılan çalışmalar gibi gelişim ve hücre biyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. İn vitro fertilizasyon sürecini başlatmak için, human chorionic gonadotr

polarized-translocation-fluorescent-proteins-xenopus-ectoderm

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Genetik Đndüklenebilir Kader Haritalama (GIFM) işaretleri ve ince, mekansal ve zamansal kontrolü ile parça...

Genetik Đndüklenebilir Kader Haritalama Pratik Bir Yaklaşım: Hücreler Mark ve Track Görsel Bir Rehberi In Vivo</em

Hücre yüzeyindeki akson kılavuz reseptörlerinin mekansal-zamansal dinamiklerini incelemek için pH'a duyarlı yeşil floresan protein varyantı pHluorin'in kullanımını burada açıklıyoruz. pHluorin etiketli reseptör hem hücre kültüründe hem de in vivoolarak ifade edilir Civciv embriyosunun elektroporasyonunu kullanarak.

Hücre Kültüründe ve Civciv Embriyosunda Akson Kılavuz Reseptörlerinin Dinamiklerini Değerlendirmek için pHluorin Kullanımı

El yazması burada Xenopus floresan levhası 'ligandların salgılanmasını ve difüzyon analiz yöntemleri basit bir kümesi sağlar. Bu ligand dağılımını değiştirmek için başka proteinlerin yeteneğini test ve morfojen degradeler düzenleyen mekanizmalar içgörü verebilir deneyleri izin verdiği için bir ortam sağlar.

Konfokal Analizi Kullanımı<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Wnt ve Shh morfogen Gradyanların modülyatorlar Soruşturma

Xenopus embriyolarında, blastocoel'in çatısından alınan hücreler pluripotenttir ve çeşitli dokular oluşturmak üzere programlanabilir. Burada, erken nöral gelişimin temel in vivo ve in vitro özelliklerini araştırmak için bir test sistemi olarak amfibi blastocoel çatı eksplantlarını kullanma protokollerini açıklıyoruz.

Kök hücre benzeri<em&gt; Xenopus</em&gt; Embriyonik Eksplantlarındaki Erken Nöral Gelişim Özellikleri Okuyacak<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ve<em&gt; İn Vivo</em

Biz Ciona intestinalis, mikroenjeksiyon ve elektroporasyon teknikleri kullanarak omurgalılar bir kordalısı kardeş grubunda, geçici transgenesis ve gen demonte sunuyoruz. Bu tür yöntemler Notokordun ve baş duyusal epitel ve insan hastalıklarla ilişkili genlerin pek ortologlar dahil omurgalıların ilkel özellikleri, özellikleri bu basit omurgasız fonksiyonel genomik kolaylaştırır.

Kordalı embriyo Mikroenjeksiyon ve Elektroporasyon<em&gt; Ciona intestinalis</em

Bu video makalede sistematik ve verimli birçok omurgasız embriyolar karmaşık sinyal yolları ve düzenleyici ağları bileşenleri karakterize etmek için kullanılabilir in vivo metodolojisi basit ayrıntıları.

Sadelik Gücü: olarak deniz kestanesi Embriyolar<em&gt; Vivo</em&gt; Karmaşık Hücre-hücre Sinyal Ağ Etkileşimleri incelenmesi için Gelişim Modelleri

Bu protokol, hücre farklılaşması ve Xenopus embriyonik gelişimi sırasında mitojenle aktive protein kinaz (MAPK) aktivitesini modüle etmek için bir optogenetik strateji tanımlamaktadır. Bu yöntem, yüksek mekansal ve zamansal çözünürlüğe sahip Xenopus embriyoları gibi memeli hücre kültüründe ve çok hücreli canlı organizmalarda MAPK sinyal yolağının geri dönüşümlü aktivasyonuna izin verir.

Hücre Farklılaştırması Sırasında Mitojenle Aktive Edilen Protein Kinaz Yolunun Hafif-Uyumlu Geri Dönüşümlü Modülasyonu ve<em&gt; Xenopus</em&gt; Embriyonik Gelişim

Bu iletişim kuralı bir protein nükleer translocation ısı stres altında bir yeşil floresans protein (GFP) füzyon proteini bir işaretleyici olarak ve 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kullanarak izlemek gösterilmiştir boyama. İletişim kuralı boyama DAPI hızlı ve GFP ve protein hücre altı yerelleştirme sinyalleri korur.

Protein hücre altı yerelleştirme yeşil floresans Protein etiketleme ve 4', 6-Diamidino-2-phenylindole Caenorhabditis elegans içinde boyama tarafından tespit

Bu protokol, bir günlük Xenopus laevis embriyolarının göz tomurcuklarına bir DNA/DOTAP karışımının nasıl mikroenjekte edilebildiğini ve tek tek yeşil floresan proteinin (GFP) tek tek görüntülenme ve yeniden nasıl yeniden yapılandırılabildiğini göstermeyi amaçlamaktadır. bozulmamış, yaşayan Xenopus kurbağa yavruları.

Xenopus laevis Embriyolarında Göz tomurcuklarına DNA'nın mikroenjeksiyonu ve GFP'nin Sağlam Optik Aksonal Arbors'u İfade Etme Görüntülemesi, Yaşayan Xenopus Kurbağaları

Bir moleküler marker olarak γH2AX oluşumu kullanarak DNA çift iplikli çizgiler Niceleme radyasyon biyoloji paha biçilmez bir araç haline gelmiştir. Burada hücreler radyasyona maruz kaldıktan sonra γH2AX odakları ölçümü için immünofloresan testinin kullanımını göstermek.

İyonlaştırıcı Radyasyon Cevabı γH2AX Foci Kantitasyonu

Öğrenin, Xenopus embriyo ektoderminde floresan proteinlerin polarize translokasyonunu inceleyerek Wnt sinyalizasyonuna yanıtı gözlemleyin. Bu yöntem, hücre polaritesi ve sinyal yolaklarının mekânsal düzenlenmesini anlamanıza yardımcı olur.

Floresan Proteinleri Polarize Translokasyon Xenopus Wnt Sinyalizasyonu Cevabı Ektoderm

Daha fazla video keşfet