Floresan Proteinleri Polarize Translokasyon Xenopus Wnt Sinyalizasyonu Cevabı Ektoderm

Bu prosedürün genel amacı, büyüme faktörü sinyalleşmesi üzerine proteinlerin hücre altı lokalizasyonundaki değişiklikleri incelemektir. Bu işlem, öncelikle erken evre xenopus embriyolarının hayvan blastomerlerine RFP ve sinyal reseptörü FRIZZLED sekiz'i kodlayan RNA'ların enjekte edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, elektrodermal implantlar ve/veya embriyo kriyokesitleri hazırlanır ve immün boyama yapılır.

Son olarak, immün boyama yapılan hücreler floresan mikroskop kullanılarak görüntülenir. Nihayetinde, belirli bir proteinin hücre altı lokalizasyonunun embriyonik sinyal yollarına nasıl bağımlı olduğunu gösteren sonuçlar elde edilebilir. Örnek olarak, diverse proteininin FRIZZLED eight reseptörü tarafından sentrozomdan hücre membranına çekildiğini göstermekteyiz.

Bu yöntem, araştırmacıların signaling proteinlerinin hücre altı lokalizasyonunu xenopus embriyolarını kullanarak in vivo olarak görselleştirmelerine olanak tanır. Bu, sinyal iletiminin uzaysal düzenlemesi ve hücre önceliği mekanizmaları üzerine yapılan çalışmalar gibi gelişim ve hücre biyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. İn vitro fertilizasyon sürecini başlatmak için, human chorionic gonadotropin enjekte edilmiş dişi kurbağalardan yumurtaları temin edin.

Deneyden 12 saat önce, yumurtaların üzerine 0,5 ila 1 ml 1X Marx modifiye ringer çözeltisi ekleyin ve küçük bir diseke testis parçası ile in vitro dölleyin. İki ila üç dakika sonra, sperm motilitesini aktive etmek için tuz konsantrasyonunu 0,1 XMMR ile düşürün. 20 dakika inkübe edin.

Döllenmenin ardından, yumurtalar animal polleri yukarı gelecek şekilde konumlanır. MMR çözeltisini beş dakika boyunca sudaki %3'lük sistein çözeltisi ile değiştirerek yumurta jöle tabakasını uzaklaştırın. Yumurtaları 0.1 XMMR ile üç kez yıkayın.

İki ila dört hücreli aşamaya gelene kadar 13 °C'de inkübe edin. Ardından embriyoları mikroenjeksiyon için 0,5 XMMR içeren %3'lük fi'ye aktarın.

M message M machine kiti kullanılarak lineerleştirilmiş DNA şablonlarından RNA'lar sentezleyin ve RNA'sız su ile 0.1 ile 1 µg/µL konsantrasyona seyreltin. Çeşitli RFP'ler, membran markörü GFP CX ve FRIZZLED 8 için RNA'lar, enjeksiyon başına 0.1 ile 1 ng miktarında kullanılır. Enjeksiyondan önce, bir iğne çekici ve iğne taşlayıcı kullanarak kapiler tüplerden enjeksiyon iğneleri hazırlayın.

Enjeksiyonlar için her bir iğneyi, enjeksiyon başına 10 litrelik sıvı püskürtecek şekilde su ile kalibre edin. Embriyoları, plastik bir kabın üzerindeki %3'lük fial 0.5 XMMR'nin oluşturduğu büyük bir damlanın üzerine yerleştirin. Dar uçlu bir mikro enjektör kullanarak, enjeksiyon iğnesine bir mikrolitre RNA çözeltisi çekin.

İki hücreli embriyoların her birinin iki hayvan kutubuna 10 nanolitre RNA enjekte edin. Enjekte edilen embriyoları 12 kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğuna aktarın ve erken gastrula evresine ulaşana kadar 13 °C'de inkübe edin.

Gastro evresindeki embriyoları, %1 aeros kaplı altı santimetrelik plastik bir kaba, 0,6 XMMR çözeltisi içine aktarın. Vitellin membranını pensle manuel olarak çıkarın. Ardından, embriyolardan ektodermal eksplantları çıkarmak için bir tsin iğnesi ve kıl loop kullanın.

Örnekleri PBS içerisindeki %3.7'lik formaldehitte 30 dakika boyunca sabitleyin. X explan'ı PBS ile üç kez, her biri 10 dakika sürecek şekilde yıkayın. Çekirdekleri boyamak için üçüncü yıkamaya davi ekleyin.

Ardından, X explan örneğini, içteki pigmentsiz tarafı objektife bakacak şekilde iki parça scotch bant arasına yerleştirerek bir lam üzerine monte edin. İki ila üç adet 20 µL damla montaj solüsyonu ekleyin. Üzerine bir lameli yerleştirin.

Enjekte edilen embriyolar, hücredeki floresan proteinlerin dağılımını görselleştirmek ve spesifik antikorlarla karşı boyama yapmak için kriyoseksiyonlara ayrılabilir. 10. evrede, embriyoları dört mililitrelik bir cam şişe içerisinde yoğun fiksatif ile oda sıcaklığında bir ila iki saat boyunca fikse edin. Ardından, PBS ile yıkamanın ardından embriyoları aynı şişe içerisindeki %15 balık jelatini ve %15 sükroz çözeltisine gömün.

Ertesi gün, gömülü embriyoları plastik bir kalıba aktarın. Gömülü embriyoları kuru buz üzerinde hızla dondurun. Ardından, bir kriyostat kullanarak kriyoseksiyonlar hazırlayın.

Kesitler üzerinde immünofloresan boyama yapın, lamları kapatın ve ektoderm implantları için açıklanan yöntemle aynı şekilde enine kesitli embriyoların görüntülerini alın. Uygun filtrelerle bir Zeiss Axio plan floresan mikroskobu kullanarak görüntüleri toplayın ve X düzlemi içindeki spesifik Z düzlemlerini tanımlayıp görüntüleyin. Bu şekilde, ersin ektodermal hücrelerde sentrozoma lokalize olmuştur, ancak hücre membranına transloke olmuştur.

Frizzled eight'e yanıt olarak, cex GFP hücre membranını yeşil renkte işaretler. Diverse in RFP kırmızı renkte, DPI ile işaretlenmiş çekirdekler ise burada mavi renktedir. Embriyo kriyo kesitlerinde Diverse in RFP, Frizzled eight tarafından hücre membranına çekilir.

Gama tübülin, sentrozomal bir belirteçtir. Bu videoyu izledikten sonra, protein kenetlenme yetkilendirmesi ve sinyal iletim süreçlerinin hücre altı çözünürlükteki çalışmalarında XUS embriyolarının ve embriyonik hücrelerin kullanışlılığı hakkında iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.