Newt Lens Rejenerasyon Eğitim Kültürleme İris Pigment Epitel Hücreler için Sistem

Bu prosedürün genel amacı, semenderde lens rejenerasyonunu incelemek için iris pigmentli epitel hücrelerini kültüre etmektir. Bu işlem, öncelikle bir semenderin uyutma solüsyonu ile anestezi altına alınması ve gözlerin çıkarılmasıyla gerçekleştirilir.

Prosedürün ikinci adımı, önce retinal dokunun çıkarılmasını, ardından kornea iris fragmanlarının dorsal ve ventral yarılarına kesilmesini takip ederek göz dokusundan iris pigmente epitelyal hücrelerini izole etmektir. İris hücreleri daha sonra stromadan ayrılır ve iki hafta boyunca in vitro olarak kültüre edilir. İki haftalık Turing işleminden sonra, IPE hücreleri agregle edilir ve ardından lin optimiz uygulanmış bir alıcıya implante edilir.

Bir aylık iyileşme sürecinin ardından histoloji, dorsal ve ventral IPE hücrelerinin lens rejenerasyon potansiyelini ortaya koyar. Mikro diseksiyon ve cerrahi operasyonlar için çok sayıda beceri gerektirdiğinden öğrenilmesi zor olan hücre kültürü ve implantasyon basamaklarında, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir. En az yedi nude fareyi %0,1 etil 3-aminobenzoat metansülfonik asit ile anestezi ederek başlayın; konjonktiva ile birlikte göz kapaklarını keserek forseps ve cerrahi makas yardımıyla gözlerini cerrahi olarak çıkarın. Ardından optik siniri kesin.

Şimdi diseke edilen gözleri hızlıca bir çeker ocağa taşıyın ve lugo etanolünde üç saniye boyunca sterilize edin. Ardından gözleri kalsiyum ve magnezyum içermeyen Hank çözeltisi ile iki kez yıkayın. Taze Hank çözeltisine aktarın ve diseksiyona devam edin.

Bir skalpel kullanarak gözde bir kesik oluşturun. Ardından, kornea kenarı boyunca kesmek için makas kullanın. Lensle birlikte kalan retina dokusunu ve sklera tabakasını çıkarıp kesin.

İris kornea komplekslerini 15 numara bir bistüri kullanarak taze hanks içeren bir kaba aktarın. Kompleksleri dorsal ve ventral yarılarına ayırın. Dorsal ve ventral irisler, dorsal tarafın sklera üzerindeki siyah lekelerin varlığı ve ventral iris üzerindeki V şeklinde bir kesi ile ayırt edilir.

Ventral iris ve dorsal irisi birbirinden ayırın. İris fragmanlarını, bir mililitre L 15 çözeltisi içeren 35 milimetrelik bir kaba toplayın. Dorsal ve ventral yarıları ayrı kaplarda tutun.

Şimdi kaplara 150 µL dispa çözeltisi ekleyin ve bunları 27 °C'de iki saat boyunca inkübe edin. Stromadan IPE hücrelerini toplamak için, pens yardımıyla toplanan tüm doku fragmanlarından IPE hücrelerini nazikçe soyun.

Ardından, IPE hücrelerini 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında iki dakika boyunca 1000 RPM'de santrifüjleyin, ardından süpernatantı uzaklaştırın. Peleti bir mililitre Hanks çözeltisi içinde yeniden süspande edin ve hücreleri ayırmak için santrifüjleme işlemini tekrarlayın. Hanks çözeltisini uzaklaştırın ve peleti yeniden süspande edin.

1/250'lik tripsin çözeltisinin bir mililitresi içerisinde, 27 °C'de iki saat boyunca inkübe edin; hücreleri yıkamak için santrifüjleyin ve tripsini uzaklaştırın. Bir mililitre L 15 çözeltisi ekleyip tekrar santrifüjleyin, yıkama işlemini bir kez daha tekrarlayın ve ardından 800 µL taze L 15 ile değiştirip hücreleri nazikçe pipetleyerek çözeltiye alın. Şimdi hücreleri kolajen ile kaplanmış 24 kuyucuklu plakalara ekleyin.

Yedi N'den elde edilen olağan verim, dört kuyucuk dorsal hücre ve dört kuyucuk ventral hücredir. Kabı iki hafta sonra 27 °C'de iki hafta boyunca inkübe edin. Burada gösterildiği üzere, lens rejenerasyonundaki işlevlerini incelemek için IPE genlerle transfekte edilebilir.

Ventral IPE hücrelerinin bu iki haftalık kültürü, dorsal hücrelerle aynı morfolojiyi sergilemektedir. Pigmentasyonun, hem dorsal hem de ventral iris hücrelerinde bu aşamaya kadar devam ettiğine dikkat edin. IPE hücrelerini implante etmeden önce, hücrelere 400 microliters taze kültür ortamı içinde 20 microliters dyse ekleyerek agrege edilmeleri gerekir; plakayı hafifçe çalkalayın ve hücreleri 27 degrees Celsius sıcaklıktaki bir inkübatörde gece boyunca bekletin.

Ertesi gün, hücreleri yerinden ayırmak için nazikçe pipetleme yapın ve ardından hücreleri 1,5 mililitrelik tüplere aktarın; şimdi tüpleri santrifüjleyerek ve süpernatantı bir mililitre L 15 ile değiştirerek hücreleri yıkayın. Bu adımı iki kez tekrarlayın. Standart yöntemleri kullanarak hücre sayısını hesaplamak için hücre süspansiyonundan 10 mikrolitre kullanın.

Hesaplama yapıldıktan sonra, agregat başına 200 µL L 15 içerisinde 3000 ila 5.000 hücre hazırlayın. Ardından hücreleri santrifüjle çöktürün ve 48 saat boyunca inkübe edin. 27 °C sıcaklıkta hücreler artık bir alıcı hayvana implante edilebilir.

Yetişkin bir yenişeyi, hareket etmeyi bırakana kadar uyutma solüsyonu ile anestezi ederek başlayın. Şimdi, gözün korneasında bir kesik oluşturmak için bir skalpel bıçağı kullanın. Ardından, bir penset yardımıyla lensi çıkarın.

Lens çıkarıldıktan sonra, IPE hücre agregatı gözün ventral tarafında, kornea dokusunun hemen altına yerleştirilir. Ardından semenderi ayrı bir kaba geri koyun ve iyileşmesine izin verin. Bu süre boyunca, iyileşen dokuya zarar vermemek için semenderi dikkatli bir şekilde tutun.

Nakledilen hücrelerin yeni bir merceğe dönüşmesi için bir ay süre gereklidir. Bir ay geçtikten sonra, agrega hücreler implant edilen yeni gözleri çıkarın ve dokuyu fikse edin. Standart birdehidratasyon protokolü kullanarak, fikse edilen doku, 15 µm kalınlığında kesitler alınması ve uygun şekilde boyanması için uygun gömme kalıplarına gömülebilir.

Agregatın göze implante edilmesinin ardından, dorsal IPE hücrelerinden elde edilen agregat yeni lens oluşumunu indükler. Ventral implantın bulunduğu gözde, dorsal iristen konakçı lens indüksiyonu da gözlenir. Ventral IPE hücrelerinden hazırlanan agregattan herhangi bir lens indüksiyonu gözlenmezken, six 3 geni aşırı eksprese edildiğinde ve retinoik asit varlığında ventral agregattan lens indüksiyonu gözlenir.

Ayrıca, gelişimin ardından gözün dorsal irisinden konak lens indüksiyonu gözlemlenir. Bu teknik, lens rejenerasyonu alanındaki araştırmacıların farklı genlerin rolünü yeni bir bakış açısıyla keşfetmelerine yol açmıştır.