Name: Newt Lens Rejenerasyon Eğitim Kültürleme İris Pigment Epitel Hücreler için Sistem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Öğrenin iris pigment epitel hücrelerini kültürleme ve lens rejenerasyonunu inceleme yöntemini. Bu teknik, Notophthalmus viridescens kullanarak rejeneratif biyoloji araştırmalarında uygulanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma PAT için bir Ulusal Sağlık Enstitüsü, hibe Ey10540 tarafından finanse edildi.

1. İris Hücre Kültürü <ol><li> 7 SBD (anestezi, PBS içinde hazırlanan 3-aminobenzoate metan sülfonik asit etil% 0.1) ve kalsiyum magnezyum ücretsiz Hanks solüsyonu (CMF) yer gözbebekleri toplayın. </li><li> Eldivenleri değiştirin ve doku kültürü kaputu çalışır. </li><li> Lugol's-EtOH göz topları 3 saniye süreyle sterilize edin. </li><li> CMF 2 kez yıkayın. </li><li> Hanks gözleri aktarın ve diseksiyon başlayın. </li><li> Iris kornea kompleks inceleyin ve nöral retina kaldırmak. </li><li> Kompleksleri Hanks yeni bir çanak içine aktarın. </li><li> # 15 bistüri, ayrı kompleksleri, sırt ve karın yarısı içine kullanma. </li><li> 1 ml L-15 içeren bir tabak içinde iris parçaları (ilk ventral) ve yer çıkarın. </li><li> % 15 (150 ul) dispase hacmi (7.5 adet / ml konsantrasyon) ekleyin. </li><li> 27 ° C (parafilm sarın yemek) 2 saat süreyle inkübe edin. </li><li> Stroma (27 Place tripsin çözüm ° C) IPE hücrelerin izole. </li><li> 1.5 ml tüp içine IPE hücreleri toplayın. </li><li> RT 1000 rpm (oda sıcaklığında) 2 dakika süreyle santrifüj, supernatant çıkarın. </li><li> RT 1000 devirde 2 dakika boyunca 1 ml Hanks ve santrifüj ile yıkayınız süpernatant kaldırmak. </li><li> 2 saat boyunca inkübe 27 ° C, 1 ml tripsin çözüm ekle </li><li> 2 dakika boyunca oda sıcaklığında 1000 rpm'de santrifüj, tripsin çıkarın. </li><li> 2 dakika 1000 rpm'de santrifüj, yıkamak için 1 ml L-15 ekleyin. </li><li> Yavaş yavaş yukarı ve aşağı 800 ul L-15, pipetlemeyin ~ 10 kat (12 kat fazla bağlılık azaltır) ekleyin. </li><li> Plaka 27 24 iyi kollajen kaplı plaka ve inkübe IPE hücreleri ° C 2 hafta (Genellikle, 4 dorsal ve ventral 4 kuyulardan 7 SBD elde edilen). </li><li> Bu aşamada hücre, gen transfeksiyon veya indükleyen veya lens rejenerasyon ile müdahale rollerini belirlemek için faktörler ile tedavi için uygundur. </li></ol> 2. İris Hücreler Birleştirilmesi <ol><li> Plakalar içeren iris hücreleri hafifçe 400 inoküle, girdap dispase çözüm 20μl ekleyin. </li><li> Plakalar 27 ° C'de gece boyunca inkübe edin. </li><li> Pipetleyin yavaşça yukarı ve aşağı hücreleri çıkarmak için </li><li> Eppendorf tüp ve RT az 1000 rpm'de 2 dakika spin icine koyun hücreleri. </li><li> 1 ml tam L-15 ekleyerek orta ve yıkama çıkarın, oda sıcaklığında 1000 rpm'de 2 dakika döndürmek orta kaldırmak. </li><li> Toplam ortalama 2000-7000 hücreleri kullanın. Her bir tüp içine agrega başına 200 ul L-15 ekleyin. </li><li> Yeni Eppendorf tüpleri böler hücreleri (200 ul). </li><li> 2 dakika süreyle 1000 rpm'de RT dönerler. </li><li> 48 saat boyunca inkübe 27 ° C. </li></ol> 3. Aggregrated Hücreler implantasyonu <ol><li> Newt gözün kornea bir yarık olun ve objektif çıkarın. </li><li> Lens çıkarıldıktan sonra, ventral tarafında gözün kornea dokusunun hemen altında IPE hücre agrega yerleştirin. </li><li> SBD onlara lens yeniden sağlamak için bir ay süre ile muhafaza edilir. </li></ol> 4. Newt Göz gömülmesi <ol><li> Agrega ile implante newt gözleri kaldırın ve fosfat tamponlu salin (PBS). </li><li> En az 4 saat veya gece boyunca 4 ° C'de% 4 paraformaldehid sabitleyin. </li><li> PBS, 4 ° C de 30 dakika yıkayın. </li><li> 4 ° C, 30 dakika: 0.85% serum fizyolojik ile şımartın. </li><li> RT: Tuzlu / Ethanol (1:1) 15 dakika boyunca yıkayın. </li><li> % 70 Etanol Yıkama: RT, 15 dakika. Bir kez tekrarlayın. </li><li> RT, her biri 30 dakika% 85 Etanol ve% 95 Etanol yıkayın. </li><li> % 100 Etanol Yıkama: RT, 30 dakika. Bir kez tekrarlayın. </li><li> Mağaza, 4 ° C veya devam. </li><li> % 100 ksilen Yıkama: RT, 30 dakika. Bir kez tekrarlayın. </li><li> 60 ° C, 45 dakika ksilen / parafin (1:1) ile tedavi. </li><li> 60 ° C'de 20 dakika:% 100 Parafin ile şımartın. Iki kez daha tekrarlayın. </li><li> Kalıpları gömme gömün. </li></ol> 5. Kesit <ol><li> Gömülü göz 15 mikron bölümleri mikrotom kullanarak hazırlayın. </li><li> Jelatin kaplı bir slayt göz bölümleri yerleştirin ve sıcak bir slayt bırakın. </li></ol> 6. Boyanma <ol><li> Place 10 dakika için ksilen slaytlar. Bir kez daha tekrarlayın. </li><li> Hidrat:% 100,% 95,% 80,% 70,% 30 etanol her biri için 1 dakika </li><li> Bir dakika için DI suyla durulayın. </li><li> PBS içinde 15 dakika boyunca yıkayın. </li><li> PBST (% 0.2 Triton-X 100 PBS içinde) 15 dakika boyunca yıkayın. </li><li> PBS içinde 15 dakika boyunca yıkayın. </li><li> Solüsyonu (% 10 keçisi sekonder antikoru) bir saat boyunca bloke yerleştirin. </li><li> Gece için primer antikor yerleştirin. </li><li> Primer antikor PBS içinde 15 dakika boyunca yıkayın. </li><li> PBST 15 dakika boyunca yıkayın. </li><li> PBS içinde 15 dakika boyunca yıkayın. </li><li> Yeri karanlıkta 2 saat için sekonder antikoru (1:100 seyreltme PBS). </li><li> Her biri ve daha sonra montaj için 15 dakika PBS, PBST ve PBS içinde yıkayın. </li><li> Floresan mikroskop altında slaytlar uyun. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar: Kültür newt ir Bu prosedürolan hücreler dorsal ve ventral IPE hücrelerin yenilenme potansiyelini incelemek için kullanılmıştır. Ayrıca, newt gözünde lens yenilenme mekanizması katkıda belirli genlerin çalışma da mümkündür. Hücreleri, 2 hafta boyunca kültüre edilmiştir (Şekil 1) objektif yenilenme fonksiyonunu incelemek için genler tarafından transfekte olabilir . Özellikle ilgi çekici olan ventral iris neden olabilir genler. Ventral iris hücrelerinin lens transdifferentiate olamayacağına göre (Şekil 2) bir aday gen endüktif işlevi incelenebilir. Geçmişte, bu tekniği kullanarak altı-3 üzerinden retinoik asit lens indüksiyon huzurunda ifade edildi ventral iris 6 gözlenen olduğunu göstermiştir. Şekil 3'te ventral dorsal iris (ok) ev sahibi lens farklı değil, tam olarak gelişmiş bir ve farklılaşmış bir lens (ok ucu), iris agrega sebebiyet verdiğini görebilirsiniz. <img src="/files/ftp_upload/2713/2713fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. a) Dorsal iris pigmente epitel hücreleri 2 haftalık bir süre için in vitro kültür. b) Ventral iris pigmente epitel hücreleri, 2 haftalık bir süre için in vitro kültüre . Pigmentasyon hem dorsal ve ventral iris hücreleri bu aşamada devam edin. <img src="/files/ftp_upload/2713/2713fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Kültürlü IPE hücrelerin yenilenmesi yeteneği. a) Objektif dorsal IPE hücre agrega (ok ucu) indüksiyon. Objektif indüksiyon dorsal iris (ok), di Host: dorsal iris, vi: ventral iris le: lens epitel, lf: lens lifleri. b) objektif indüksiyon ventral IPE hücre agrega (ok ucu) olmaması. Dorsal iris (ok) lens indüksiyon ev sahipliği yapmaktadır. <img src="/files/ftp_upload/2713/2713fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Lens indüksiyon ventral toplam altı-3 ile transfekte ve retinoik asit ile tedavi. Dorsal iris (ok) lens indüksiyon ev sahipliği yapmaktadır. Ventral agrega (ok ucu) Lens indüksiyon.

<ol><li>Tsonis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Regeneration in vertebrates.</a> Dev Biol. 221, 273-284 (2000).</li>
<li>Tsonis, P. A., Madhavan, M., Tancous, E. E., Del Rio-Tsonis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+newt%27s+eye+view+of+lens+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A newt's eye view of lens regeneration.</a> Int. J. Dev. Biol. 48, 975-980 (2004).</li>
<li>Del Rio-Tsonis, K., Tsonis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eye+regeneration+at+the+molecular+age%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Eye regeneration at the molecular age.</a> Dev. Dyn. , 226-2211 (2003).</li>
<li>Okamoto, M., Ito, M., Owaribe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Difference+between+dorsal+and+ventral+iris+in+lens+producing+potency+in+normal+lens+regeneration+is+maintained+after+dissociation+and+reaggregation+of+cells+from+the+adult+newt%2C+Cynops+pyrrhogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Develop+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Difference between dorsal and ventral iris in lens producing potency in normal lens regeneration is maintained after dissociation and reaggregation of cells from the adult newt, Cynops pyrrhogaster.</a> Develop Growth Differ. 40, 11-18 (1998).</li>
<li>Hayashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+transfection+system+for+functional+gene+analysis+in+adult+amphibian+lens+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Develop+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Highly efficient transfection system for functional gene analysis in adult amphibian lens regeneration.</a> Develop Growth Differ. 43, 361-370 (2001).</li>
<li>Grogg, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+inhibition-driven+regulation+of+six-3+underlies+induction+of+newt+lens+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BMP inhibition-driven regulation of six-3 underlies induction of newt lens regeneration.</a> Nature. 438, 858-862 (2005).</li>
<li>Nakamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNAs+in+Newt+Lens+Regeneration%3A+Specific+Control+of+Proliferation+and+Evidence+for+miRNA+Networking%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">miRNAs in Newt Lens Regeneration: Specific Control of Proliferation and Evidence for miRNA Networking.</a> PLoS One. 5, e12058-e12058 (2010).</li>
<li>Madhavan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Pax-6+in+lens+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The role of Pax-6 in lens regeneration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14848-14853 (2006).</li>
<li>Maki, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte-type+linker+histone+B4+is+required+for+transdifferentiation+of+somatic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Oocyte-type linker histone B4 is required for transdifferentiation of somatic cells in vivo.</a> FASEB J. 24, 3462-3467 (2010).</li>
</ol>

Bu protokol SBD lens yenilenme mekanizmasını çalışma in vitro sistemi kurmuştur. Agrega bu yana (ya dorsal veya ventral sadakatle rejenerasyon bu tekniği sırasında in vivo davranış SBD yılında transgenesis için gerekli ve fonksiyon kazanç yanı sıra, fonksiyon deneyler 7,8,9 kaybı için kullanılabilir büyük çaba hafifletmek izleyin . , bir bütün olarak agrega veya süsen, büyüme faktörleri ile kolayca tedavi edilen ve bu protokol açıklandığı gibi bunların etkilerini incelemek. Örneğin BMP yolun rol, bu tekniği 6 kullanılarak incelenmiştir olabilir.

<table><tbody><tr><td>Lugol&amp;rsquo;s çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-6146</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-4034</td><td></td></tr><tr><td>Etil 3-aminobenzoat metansülfonik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-10521</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 1:250</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>27250018</td><td></td></tr><tr><td>L-15 ( Leibovitz)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-4386</td><td></td></tr><tr><td>DNase 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-150KU</td><td></td></tr><tr><td>Kanamisin Sülfat</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>100x, 15160</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone (amfoterisin B çözeltisi)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>24 kuyucukli kolajen kaplı plaka</td><td>BD Biosciences</td><td>354408</td><td></td></tr></tbody></table>

newt lens rejenerasyon eğitim kültürleme İris pigment epitel hücreler için sistem

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Newt ve axolotl gibi Semenderler kayıp vücut parçaları gibi uzuvların, omurilik, göz, beyin, kalp, çene 1 ile kuyruk gibi pek çok yeniden yeteneğine sahip. Özellikle, SBD objektifi rejenerasyon yeteneği için benzersiz. Objektif kaldırılması üzerine, dorsal iris IPE hücrelerinin lens hücrelerinin transdifferentiate ve sonunda, yaklaşık bir ay 2,3 yeni bir mercek formu . Bu özellik, rejenerasyon ventral iris hücreleri tarafından sergilenen asla. Iris hücrelerinin yenilenme potansiyeli, in vitro kültür IPE hücrelerinin nakli yaparak incelenebilir. Kültür, dorsal ve ventral iris hücreleri ilk göz izole edilir ve 2 hafta (Şekil 1) bir süre için ayrı ayrı kültür. Bu kültür hücreleri reaggregated ve geri newt göz implante. Geçmişte yapılan çalışmalar, ventral toplam 4,5 (Şekil 2), in vivo sürecinde böylece yansıtan bir mercek formu gelmez ise dorsal reaggregate objektif oluşturan kapasitesi koruduğunu göstermiştir. Dorsal ve ventral iris hücrelerinin yenilenme potansiyeli belirleme sistemi objektif rejenerasyon ilgili genler ve proteinlerin rolü eğitim çok yararlı olur.

Newt, lens, iris pigmente epitel hücreleri (IPEs) transdiferansiye dorsal iris her zaman yeniler. Burada newt göz kültür dorsal ve ventral newt IPE hücreleri ve implantasyon için bir prosedür açıklanmaktadır. Implante edilen hücreler daha sonra doku kesit ve immünohistokimya tarafından incelenir.

Newt Lens Rejenerasyon Eğitim Kültürleme İris Pigment Epitel Hücreler için Sistem

Semender ve aksolotl gibi semenderler; uzuvlar, spinal kord içeren kuyruk, göz ve beyin gibi kaybolmuş birçok vücut parçasını rejenerasyonla yeniden oluşturma yeteneğine sahiptir.

Bu prosedürün genel amacı, semenderde lens rejenerasyonunu incelemek için iris pigmentli epitel hücrelerini kültüre etmektir. Bu işlem, öncelikle bir semenderin uyutma solüsyonu ile anestezi altına alınması ve gözlerin çıkarılmasıyla gerçekleştirilir.Prosedürün ikinci adımı, önce retinal dokunun çıkarılmasını, ardından kornea iris fragmanlarının dorsal ve ventral yarılarına kesilmesini takip ederek göz dokusundan iris pigmente epitelyal hücrelerini izole etmektir. İris hücreleri daha sonra stromadan ayrılır ve iki hafta boyunca in vitro olarak kültüre edilir. İki haftalık Turing işleminden sonra, IPE hücreleri agregle edilir ve ardından lin optimiz uygulanmış bir alıcıya implante edilir.Bir aylık iyileşme sürecinin ardından histoloji, dorsal ve ventral IPE hücrelerinin lens rejenerasyon potansiyelini ortaya koyar. Mikro diseksiyon ve cerrahi operasyonlar için çok sayıda beceri gerektirdiğinden öğrenilmesi zor olan hücre kültürü ve implantasyon basamaklarında, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir. En az yedi nude fareyi %0,1 etil 3-aminobenzoat metansülfonik asit ile anestezi ederek başlayın; konjonktiva ile birlikte göz kapaklarını keserek forseps ve cerrahi makas yardımıyla gözlerini cerrahi olarak çıkarın. Ardından optik siniri kesin.Şimdi diseke edilen gözleri hızlıca bir çeker ocağa taşıyın ve lugo etanolünde üç saniye boyunca sterilize edin. Ardından gözleri kalsiyum ve magnezyum içermeyen Hank çözeltisi ile iki kez yıkayın. Taze Hank çözeltisine aktarın ve diseksiyona devam edin.Bir skalpel kullanarak gözde bir kesik oluşturun. Ardından, kornea kenarı boyunca kesmek için makas kullanın. Lensle birlikte kalan retina dokusunu ve sklera tabakasını çıkarıp kesin.İris kornea komplekslerini 15 numara bir bistüri kullanarak taze hanks içeren bir kaba aktarın. Kompleksleri dorsal ve ventral yarılarına ayırın. Dorsal ve ventral irisler, dorsal tarafın sklera üzerindeki siyah lekelerin varlığı ve ventral iris üzerindeki V şeklinde bir kesi ile ayırt edilir.Ventral iris ve dorsal irisi birbirinden ayırın. İris fragmanlarını, bir mililitre L 15 çözeltisi içeren 35 milimetrelik bir kaba toplayın. Dorsal ve ventral yarıları ayrı kaplarda tutun.Şimdi kaplara 150 µL dispa çözeltisi ekleyin ve bunları 27 °C'de iki saat boyunca inkübe edin. Stromadan IPE hücrelerini toplamak için, pens yardımıyla toplanan tüm doku fragmanlarından IPE hücrelerini nazikçe soyun.Ardından, IPE hücrelerini 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında iki dakika boyunca 1000 RPM'de santrifüjleyin, ardından süpernatantı uzaklaştırın. Peleti bir mililitre Hanks çözeltisi içinde yeniden süspande edin ve hücreleri ayırmak için santrifüjleme işlemini tekrarlayın. Hanks çözeltisini uzaklaştırın ve peleti yeniden süspande edin.1/250'lik tripsin çözeltisinin bir mililitresi içerisinde, 27 °C'de iki saat boyunca inkübe edin; hücreleri yıkamak için santrifüjleyin ve tripsini uzaklaştırın. Bir mililitre L 15 çözeltisi ekleyip tekrar santrifüjleyin, yıkama işlemini bir kez daha tekrarlayın ve ardından 800 µL taze L 15 ile değiştirip hücreleri nazikçe pipetleyerek çözeltiye alın. Şimdi hücreleri kolajen ile kaplanmış 24 kuyucuklu plakalara ekleyin.Yedi N'den elde edilen olağan verim, dört kuyucuk dorsal hücre ve dört kuyucuk ventral hücredir. Kabı iki hafta sonra 27 °C'de iki hafta boyunca inkübe edin. Burada gösterildiği üzere, lens rejenerasyonundaki işlevlerini incelemek için IPE genlerle transfekte edilebilir.Ventral IPE hücrelerinin bu iki haftalık kültürü, dorsal hücrelerle aynı morfolojiyi sergilemektedir. Pigmentasyonun, hem dorsal hem de ventral iris hücrelerinde bu aşamaya kadar devam ettiğine dikkat edin. IPE hücrelerini implante etmeden önce, hücrelere 400 microliters taze kültür ortamı içinde 20 microliters dyse ekleyerek agrege edilmeleri gerekir; plakayı hafifçe çalkalayın ve hücreleri 27 degrees Celsius sıcaklıktaki bir inkübatörde gece boyunca bekletin.Ertesi gün, hücreleri yerinden ayırmak için nazikçe pipetleme yapın ve ardından hücreleri 1,5 mililitrelik tüplere aktarın; şimdi tüpleri santrifüjleyerek ve süpernatantı bir mililitre L 15 ile değiştirerek hücreleri yıkayın. Bu adımı iki kez tekrarlayın. Standart yöntemleri kullanarak hücre sayısını hesaplamak için hücre süspansiyonundan 10 mikrolitre kullanın.Hesaplama yapıldıktan sonra, agregat başına 200 µL L 15 içerisinde 3000 ila 5.000 hücre hazırlayın. Ardından hücreleri santrifüjle çöktürün ve 48 saat boyunca inkübe edin. 27 °C sıcaklıkta hücreler artık bir alıcı hayvana implante edilebilir.Yetişkin bir yenişeyi, hareket etmeyi bırakana kadar uyutma solüsyonu ile anestezi ederek başlayın. Şimdi, gözün korneasında bir kesik oluşturmak için bir skalpel bıçağı kullanın. Ardından, bir penset yardımıyla lensi çıkarın.Lens çıkarıldıktan sonra, IPE hücre agregatı gözün ventral tarafında, kornea dokusunun hemen altına yerleştirilir. Ardından semenderi ayrı bir kaba geri koyun ve iyileşmesine izin verin. Bu süre boyunca, iyileşen dokuya zarar vermemek için semenderi dikkatli bir şekilde tutun.Nakledilen hücrelerin yeni bir merceğe dönüşmesi için bir ay süre gereklidir. Bir ay geçtikten sonra, agrega hücreler implant edilen yeni gözleri çıkarın ve dokuyu fikse edin. Standart birdehidratasyon protokolü kullanarak, fikse edilen doku, 15 µm kalınlığında kesitler alınması ve uygun şekilde boyanması için uygun gömme kalıplarına gömülebilir.Agregatın göze implante edilmesinin ardından, dorsal IPE hücrelerinden elde edilen agregat yeni lens oluşumunu indükler. Ventral implantın bulunduğu gözde, dorsal iristen konakçı lens indüksiyonu da gözlenir. Ventral IPE hücrelerinden hazırlanan agregattan herhangi bir lens indüksiyonu gözlenmezken, six 3 geni aşırı eksprese edildiğinde ve retinoik asit varlığında ventral agregattan lens indüksiyonu gözlenir.Ayrıca, gelişimin ardından gözün dorsal irisinden konak lens indüksiyonu gözlemlenir. Bu teknik, lens rejenerasyonu alanındaki araştırmacıların farklı genlerin rolünü yeni bir bakış açısıyla keşfetmelerine yol açmıştır.

a-system-for-culturing-iris-pigment-epithelial-cells-to-study-lens

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu makale, tavşan retina ve parçacık GFP veya retina ganglion hücrelerinin içine Subselüler belirteçleri çeşitli kodlama plazmid aracılı gen transferi diseksiyonu ve inkübasyon göstermektedir.

Yetişkin Tavşan Retina Organotipik Kültürü

FGF-2 varlığı kültüre sıçan lens epitel merkez bölgesi eksplantlarındaki eşzamanlı ayırt. Gibi kültürlerin İmmünofloresan mikroskopi gen ekspresyonu ve terminal farklılaşma ile ilgili sinyalizasyon olaylar hakkında yeni bilgiler sağlar.

Terminal Farklılaşma incelenmesi için hazırlanması ve Rat Lens Epitel eksplantlar Kültür

Biz insan fetal retina pigment epitel hücreleri (hfRPE) hücrelerin kültür konfluent mono tabakaları, morfoloji, fizyoloji, polarite, ve yetişkin doğal doku protein ve gen ekspresyonu sergilediği için tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Bu çalışma, çeşitli göz hastalıkları bir hayvan modeli uzatıldı.

Retina Pigment Epitel Fizyoloji ve Patofizyoloji Çalışma Deneysel Modeller

Bu videoda, bir tavşan modelinden oküler pigment epitel hücreleri elde etmek için bir prosedür gösteriyoruz. Hücreler, retinal dejeneratif hastalıklar için terapötik stratejiler geliştirmede yardımcı olur.

IPE ve RPE Hücrelerinin İzole Edilmesi: Tavşan Gözünden Oküler Pigment Epitel Hücrelerinin Elde Edilmesi İçin Bir Teknik

Bu video, retina pigment epitel veya RPE hücrelerini ve iris pigment epitel veya IPE hücrelerini hasat edilen sığır gözlerinden izole etme prosedürünü gösterir. İzole edilen hücreler, oküler hastalıkların tedavisindeki rollerini incelemek için kültürlenebilir.

Sığır Gözünden RPE ve IPE Hücrelerinin İzole Edilmesi: Sığır Primer Pigment Epitel Hücrelerinin Hasat ve Kültür Prosedürü

Burada açıklanan, epitel dokularının doğal mikro çevreleri içindeki yaralanma tepkisinin mekanizmalarını araştırmak için kullanılabilecek klinik olarak anlamlı bir ex vivo sahte katarakt cerrahisi modelinin oluşturulmasıdır.

Bir Klinik İlgili kurulması<em&gt; Ex Vivo</emYerli mikroçevresinin Epitelyal Yara Tamir incelenmesi için&gt; Mock Katarakt Cerrahisi Modeli

Bu iletişim kuralı, yaşlı ve/veya hastalıklı insan Bruch'ın membran retina pigment epitel (RPE) hücre kültürü çalışmalarının göstermek için hedeftir. Bu yöntem RPE hücre davranış güvenliği aşılan bir hücre dışı matriks üzerinde çalışmaya uygundur.

Bir Ex Vivo modeli yaşlı insan Bruch'ın membran bir retina Pigment epitel hücrelerinin kültürü

Burada, birincil iris ve retina pigment epitel hücrelerini çeşitli memelilerden (fareler, sıçan, tavşan, domuz ve sığır) izole etmek ve transfekte etmek için bir protokol sunulmaktadır. Yöntem, insanlara aktarılabilir ex vivo analizleri ve in vivo çalışmalar için çeşitli kurulumlarda oküler gen tedavisi yaklaşımlarını incelemek için idealdir.

Viral Olmayan Gen Tedavisi için Memeli Primer Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu, Kültürü ve Genetik Mühendisliği

Bu makale, katarakt ve arka kapsül opaklaşmasında (PCO) tekrarlanabilirliği iyileştirmeyi ve araştırmalara yardımcı olmayı amaçlayan primer lens epitel hücrelerinin (LEC'ler) kültürlenmesi için ayrıntılı bir video protokolünü özetlemektedir. Lens diseksiyonu, LEC izolasyonu ve validasyonu hakkında adım adım talimatlar sunarak, özellikle bu alanda yeni başlayanlar için değerli bir rehber görevi görür.

Fare Primer Lens Epitel Hücre Kültürünü Optimize Etme: Tripsinizasyon için Kapsamlı Bir Kılavuz

Mevcut protokoller, oküler lensteki periferik yapıların görüntü niceleme yöntemleriyle görselleştirilmesi için yeni tam montajlı görüntülemeyi tanımlamaktadır. Bu protokoller, lens mikro ölçekli yapıları ile lens gelişimi/işlevi arasındaki ilişkiyi daha iyi anlamak için yapılan çalışmalarda kullanılabilir.

Periferik lens yapısını, hücre morfolojisini ve organizasyonunu görselleştirmek ve ölçmek için tam montajlı görüntüleme

Göz lensin ışığı retinaya odaklama işlevi, doku şeffaflığına, biyomekaniğe ve kırılma indeksine bağlıdır. Bu inceleme, lensin üç boyutlu mimarisini vurgular ve doku homeostazını koruyan karmaşık mekanizmaları tartışır.

Memeli Göz Merceği: Gelişim, Anatomi, Fizyoloji, Şeffaflık, Biyomekanik ve Yaşa Bağlı Zorluklar

Öğrenin iris pigment epitel hücrelerini kültürleme ve lens rejenerasyonunu inceleme yöntemini. Bu teknik, Notophthalmus viridescens kullanarak rejeneratif biyoloji araştırmalarında uygulanır.

Newt Lens Rejenerasyon Eğitim Kültürleme İris Pigment Epitel Hücreler için Sistem

Daha fazla video keşfet