Name: 3D parçacıklarının Üretimi için Basit Asma Bırak Hücre Kültürü Protokolü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-06T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Öğrenin, asma bırak yöntemiyle 3D hücre küreleri oluşturmayı. Bu hızlı teknik, hücre-hücre etkileşimlerini incelemek için doku mühendisliği ve hücre biyolojisi araştırmalarında kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazar Dr. Dongxuan Jia teknik yardım için teşekkür etmek istiyorum. Bu makalede ortaya çıkan görüntülerin bazıları Dr Malcolm S. Steinberg, Moleküler Biyoloji Anabilim Dalı, Princeton Üniversitesi ile işbirliği içinde. Yazar ayrıca, Savunma Prostat Kanseri Araştırma Programı (hibe 030.482 PC ve PC-991.552) Bakanlığı ve NCI / NIH (hibe R01CA118755) cömert desteği için teşekkür etmek istiyorum.

1. Tek Bir Hücre Süspansiyon hazırlanması <ol><li> Bunun üzerine mono tabakaları yapışmış hücre kültürleri,% 90 izdiham büyüdü olmalıdır PBS ile iki kez durulanır olmalıdır. De boşalttıktan sonra, 2 ml% 0.05 tripsin-1 mM EDTA (100 mm plaka için) ekleyin ve 37 inkübe ° C hücreleri ayırmak kadar. 2 ml tam orta ekleme ve hücreleri süspansiyon kadar karışımı hafifçe çiğnemek için 5 ml pipet kullanın trypsinization Dur. 15 ml konik tüp hücreleri aktarın. </li><li> RT az 5 dakika için 10 mg / ml DNAz stok ve inkübe 40 ul ekleyin. 5 dakika boyunca 200 XG Vortex kısa ve santrifüj. </li><li> Süpernatant atın ve 1 ml tam doku kültür ortamı ile yıkayın pelet. Tekrarlama, daha sonra tekrar süspansiyon hücrelerin doku kültürü orta 2 ml. </li><li> Hemasitometre, ya da otomatik hücre sayıcı kullanarak hücre sayımı ve 2.5 x 10 6 hücre / ml konsantrasyon ayarlayabilirsiniz. Bu gösteri için bir BioRad TC10 otomatik hücre sayıcı kullanılmıştır. </li></ol> 2. Asma Damlalar oluşumu. <ol><li> 60 mm doku kültürü çanak ve çanak alt PBS 5 ml kapağını kaldırın. Bu hidrasyon odası olarak hareket edecektir. </li><li> Kapağını ters çevirin ve alt kapağın üzerine 10 ul damla yatırmak için 20 ul pipet kullanın. Dokunmatik olarak damla yeteri kadar ayrı yerleştirildiğinde olduğunu emin olun. Bulaşık başına en az 20 damla yerleştirmek mümkündür. </li><li> 37 ° PBS-dolu alt odası ve inkübe ° C /% 5 CO 2 /% 95 nem üzerine kapağı, invert günlük damla izlemek ve hücre yaprak veya agrega ya oluşturmuşlardır kadar inkübe. Stereo mikroskop toplam oluşumu değerlendirmek için kullanılabilir. </li><li> Yaprak formunda yuvarlak alt cam çalkalayıcı transfer olabilir tam orta 3 ml içeren ve 37 sallayarak bir su banyosunda inkübe şişeler ° C ve% 5 CO 2 parçacıklarının formu kadar. </li></ol> 3. Notlar <ol><li> Hücre boyutu bağlı olarak, konsantrasyon yukarı veya aşağı ayarlanması gerekebilir. </li><li> Hücreler, membran asılı damla oluşumu önce floresan boyalar intercalating ile boyanmış olabilir. </li><li> İki farklı hücre tipleri farklı asılı damla oluşumu öncesinde bir 1:1 (veya diğer) oranı boyanmış ve karışık olabilir. Bu kanser ve stromal hücreler, embriyonik dokuların veya hücrelerin genetik özel yapıştırıcı imzaları için tasarlanmış olabilir. </li><li> Hücreler, doku kültürü yemekleri kaderin fonksiyonunu korumak için% 0.05 tripsin / 2 mM kalsiyum kullanarak ayrılabilir. </li><li> Deney bağlı olarak, levha boyutları da ölçülen olabilir, ya da büyüklükler mekanik test veya biyokimyasal veya moleküler analiz için kullanılabilir. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: Yaprak veya sfero oluşumu genellikle 24 saat içinde ortaya çıkar, ancak hücre tipine bağlı olarak uzun sürebilir. Şekil 1, tedavi edilmemiş prostat kanserinin MAT-LyLu (MLL) açılan kültür asılı hücreleri (Şekil 1A) ya da 25 mikron MEK inhibitörü PD98059 ile tedavi edilen hücreler inkübasyon 18 saat sonra çekilen görüntülerin temsil eder. Not hücre sac belirgin bir sıkışma olduğunu MEKi tedavi sonuçları. Sıkıştırma 10-20 boyutunu (veya daha fazla) damla asılı ve tedavi grupları arasında ortalama büyüklüğü karşılaştırılarak ölçerek belirlenebilir. Toplam piksel görüntü alanını ortaya çıkarmak için parçacık analizi uyguladıktan bunun üzerine Biz genellikle, İkili Mod görüntüleri daha sonra her bir görüntü eşikleme dönüştürme ImageJ yazılımı kullanarak görüntüleri analiz. Bu kare mikron sonra kolayca dönüştürülebilir. Şekil 2, tedavi edilmeyen ve tedavi edilen MEKi MLL hücreler için bir boyut karşılaştırma temsil eder. Student t-testi (p &lt;0.0001) ile karşılaştırıldı olarak belirtildiği gibi, MEKi tedavi, yaprak boyutu önemli ölçüde azaltır. Bu karşılaştırma için, tedavi edilmeyen ve tedavi edilen hücrelerde her biri için 10 agrega ölçüldü. Şekil 3, 24 saat ve 2 gün çalkalayÛcÛ banyosu sonra açılan kültür asılı oluşan bir civciv embriyonik karaciğer sfero temsil eder. Asılı damla tahlil de mekansal konumlandırma benimsedi ortaya çıkarmak için birden fazla hücre tipi içerecek şekilde modifiye edilebilir. Örneğin, bir membran intercalating floresan boya ile boyanmış ve farklı bir floresan işaretleyici ile boyandı civciv embriyonik kalp hücreleri ile karışık civciv embriyonik karaciğer hücreleri izole edilebilir. Yerine kalan daha karışmış Şekil 4A gösterir, karaciğer ve kalp hücrelerinin biri diğerine "sort-out" eğilimi ve benimseyen bir küre içinde bir küre kalp hücreleri, karaciğer hücreleri tarafından zarflı olduğu yapılandırma. Bu yapılandırma, karaciğer ve kalp hücreleri arasındaki interselüler adezyon farklılıklarla açıklanabilir. Bu kavram, pankreas adacık hücre organizasyonu 5 ve hücre aynı iki hücre popülasyonları arasındaki sıralama için, amfibi 3 ve teleost 4 embriyolar için embriyonik germ tabakası doku arasındaki davranış sıralama hücre açıklamak için kullanılır olmuştur Diferansiyel Yapışma Hipotez kodlanmış .n kaderin aynı tip (6 ve Şekil 4B) ekspresyon düzeyleri dışında her açıdan. Bu sonuç, yapışma, hücre popülasyonlarının arasında basit bir fark mühendislik nasıl göstermek için özellikle önemlidir, örneğin, organ yapısı nesil neden olabilir, pankreas adacık 5. <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 damla kültür, ya da (A) yokluğu ya da varlığı 18 saat asılı inkübe hücreler Görüntüler (B) MEK inhibitörü PD98059 25 mikron . Görüntüler Nikon Eclipse TE 300 Epifloresans mikroskop ve bir Photometrics CoolSnap ES dijital fotoğraf makinesi ele geçirildi. <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 MEKi indüklenen sıçan prostat kanseri MLL hücreleri sıkıştırma Niceleme. Tedavi edilmemiş ve tedavi edilen MEKi MLL hücrelerinin asılı damla kültürleri yukarıda açıklandığı gibi toplam büyüklüğü tespit edildi bunun üzerine 18 saat süreyle inkübe edildi. Toplam büyüklüğü istatistiksel analizi Student t-testi ile oldu. Yıldız işareti, önemli ölçüde daha küçük ve daha kompakt agrega toplam boyutu tedavi edilmeyen ve tedavi edilen MEKi hücreleri ve önerir MEKi tedavi sonuçları arasında istatistiksel olarak anlamlı fark (p &lt;0.0001) temsil eder. <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3, 18 saat sonra bir kuluçka bırak kültür asılı / 48 saat boyunca banyo sallayarak civciv embriyonik karaciğer hücreleri kuluçka oluşan sfero . Bu görüntü Nikon SMZ800 stereo mikroskop ve bir Sony Siyah CCD kamera kullanılarak yakalandı. <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 damla kültürü farklı hücre türleri arasındaki davranış Hanging sıralama ortaya koyuyor. Panelinde, civciv embriyonik karaciğer hücreleri PKH-2 membran intercalating boya ile boyandı ve PKH-26 lekeli civciv embriyonik kalp hücrelerinin eşit oranda karıştırılır. Panel B, 2.4:1 oranı yüzeyler N-cad ifade iki N-kaderin-transfekte L hücre klonlarının (LN4 ve LN2a), floresan membran intercalating boyalar PKH-2 ve PKH-26 ile boyandı (Sigma-Aldrich) eşit oranda karıştırılır ve damla 7 asılı olarak kültür. 18 saat sonra kültür, hücre sayfaları sallayarak şişeler transfer edildi ve 48 saat inkübe edilebilir. Büyüklüklerdeki% 2 paraformaldehid sabit tuzlu fosfat tamponlu ve Nikon Optiphot-2 mikroskop bağlı bir BioRad MRC600 lazer tarama konfokal mikroskop sistemi ile görüntülenebilir. (A) yeşil ve kırmızı her iki kanal Optik bölümleri toplanmış ve Vital Resimler ile donatılmış bir Silikon Graphix Crimson VGX iş istasyonu Voksel Ultra görüntüleme yazılımı anatomik yapılandırmaları ifşa sahte renk, her iki kanal atamak ve görüntüleri birleştirmek için kullanılmıştır. Pseudocolor mavi karaciğer hücreleri (8), kalp hücrelerinin bir toplamı gösteren zarflama yoluyla Konfokal optik bölümü (burada sözde-renk sarı) . (B) N-kaderin (kırmızı) (6) düşük seviyelerde ifade ile yüksek N-kaderin ifade hücreleri (yeşil) bir toplamı gösteren zarflama ile Konfokal optik bölümü.

<ol><li>Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+interactions+with+three-dimensional+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell interactions with three-dimensional matrices.</a> Curr Opin Cell Biol. 14, 633-639 (2002).</li>
<li>Nelson, C. M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+extracellular+matrix%2C+scaffolds%2C+and+signaling%3A+tissue+architecture+regulates+development%2C+homeostasis%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Of extracellular matrix, scaffolds, and signaling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 287-309 (2006).</li>
<li>Davis, G. S., Phillips, H. M., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ-layer+surface+tensions+and+%26quot%3Btissue+affinities%26quot%3B+in+Rana+pipiens+gastrulae%3A+quantitative+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ-layer surface tensions and &quot;tissue affinities&quot; in Rana pipiens gastrulae: quantitative measurements.</a> Dev Biol. 192, 630-644 (1997).</li>
<li>Schotz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+differences+in+tissue+surface+tension+influence+zebrafish+germ+layer+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22HFSP+J%22%5BJournal%5D)">Quantitative differences in tissue surface tension influence zebrafish germ layer positioning.</a> HFSP J. 2, 42-56 (2008).</li>
<li>Jia, D., Dajusta, D., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+surface+tensions+guide+in+vitro+self-assembly+of+rodent+pancreatic+islet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Tissue surface tensions guide in vitro self-assembly of rodent pancreatic islet cells.</a> Dev Dyn. 236, 2039-2049 (2007).</li>
<li>Foty, R. A., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+differential+adhesion+hypothesis%3A+a+direct+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The differential adhesion hypothesis: a direct evaluation.</a> Dev Biol. 278, 255-263 (2005).</li>
<li>Li, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+casein+kinase+2+subunits+in+Chinese+hamster+ovary+and+3T3+L1+cells+provides+information+on+the+role+of+the+enzyme+in+cell+proliferation+and+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Expression of the casein kinase 2 subunits in Chinese hamster ovary and 3T3 L1 cells provides information on the role of the enzyme in cell proliferation and the cell cycle.</a> J Biol Chem. 274, 32988-32996 (1999).</li>
<li>Foty, R. A., Pfleger, C. M., Forgacs, G., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+tensions+of+embryonic+tissues+predict+their+mutual+envelopment+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Surface tensions of embryonic tissues predict their mutual envelopment behavior.</a> Development. 122, 1611-1620 (1996).</li>
<li>Wendt, D., Riboldi, S. A., Cioffi, M., Martin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+and+bottlenecks+of+bioreactors+in+3D+cell+culture+and+tissue+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Potential and bottlenecks of bioreactors in 3D cell culture and tissue manufacturing.</a> Adv Mater. 21, 3352-3367 (2009).</li>
<li>Berry, D. P., Harding, K. G., Stanton, M. R., Jasani, B., Ehrlich, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+wound+contraction%3A+collagen+organization%2C+fibroblasts%2C+and+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Human wound contraction: collagen organization, fibroblasts, and myofibroblasts.</a> Plast Reconstr Surg. 102, 124-131 (1998).</li>
<li>Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+biology+in+three-dimensional+collagen+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fibroblast biology in three-dimensional collagen matrices.</a> Trends Cell Biol. 13, 264-269 (2003).</li>
<li>Wang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+interactions+between+beta1-integrin+and+epidermal+growth+factor+receptor+in+three-dimensional+basement+membrane+breast+cultures%3A+a+different+perspective+in+epithelial+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reciprocal interactions between beta1-integrin and epidermal growth factor receptor in three-dimensional basement membrane breast cultures: a different perspective in epithelial biology.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 14821-14826 (1998).</li>
<li>Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversion+of+the+malignant+phenotype+of+human+breast+cells+in+three-dimensional+culture+and+in+vivo+by+integrin+blocking+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies.</a> J Cell Biol. 137, 231-245 (1997).</li>
<li>Boudreau, N., Werb, Z., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+apoptosis+by+basement+membrane+requires+three-+dimensional+tissue+organization+and+withdrawal+from+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Suppression of apoptosis by basement membrane requires three- dimensional tissue organization and withdrawal from the cell cycle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 3509-3513 (1996).</li>
<li>Croix, B., Rak, J. W., Kapitain, S., Sheehan, C., Graham, C. H., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+by+hyaluronidase+of+adhesion-dependent+multicellular+drug+resistance+in+mammary+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nat.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Reversal by hyaluronidase of adhesion-dependent multicellular drug resistance in mammary carcinoma cells.</a> J. Nat. Cancer Inst. 88, 1285-1296 (1996).</li>
<li>Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+structure%2C+nuclear+organization%2C+and+gene+expression+in+normal+and+malignant+breast%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue structure, nuclear organization, and gene expression in normal and malignant breast.</a> Cancer Res. 59, 1757-1763 (1999).</li>
<li>Marrero, B., Messina, J. L., Heller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+tumor+spheroid+in+a+microgravity+environment+as+a+3D+model+of+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Generation of a tumor spheroid in a microgravity environment as a 3D model of melanoma.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 45, 523-534 (2009).</li>
<li>Napolitano, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-free+three-dimensional+cell+culture+utilizing+micromolded+nonadhesive+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Scaffold-free three-dimensional cell culture utilizing micromolded nonadhesive hydrogels.</a> Biotechniques. 43, 494-496 (2007).</li>
<li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnol Bioeng. 103, 655-663 (2009).</li>
</ol>

Çalışmalar, üç boyutlu bir bağlamda (3D) hücreleri kültür farklı hücresel morfoloji ve katı bir iki boyutlu (2D) kültür sistemi, 9 kıyasla sinyalizasyon ürettiğini göstermiştir . Örneğin, fibroblast nüfuslu kollajen jeller 3D fibroblast morfolojisi 2D 10,11 gözlenen oldukça farklı olduğunu göstermektedir. Benzer şekilde, 3D kültürü meme epitel hücrelerinin doku-spesifik farklılaşma neden olabilir. 3D kültür sistemleri, normal ve malign hücrelerin ayırt etmek için kullanılan ve normal bir fenotip dö...

<ul><li> otomatik hücre sayıcı (BioRad TC10) </li><li> CO 2 beşik örtüsü Model 3540 (Lab-line) ile su banyosunda sallayarak </li></ul>

3d parçacıklarının Üretimi için basit asma bırak hücre kültürü protokolü

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Katı yüzeye yapışık tek tabaka kültürler, hücre-hücre uyum ve hücre alt tabaka yapışma çalışmalar tarihsel yapılmamıştır. Ancak, Hücreler, doku içinde hücrelerin çok yakın komşuları ile ve ekstrasellüler matriks bileşenleri ile yakın bağlantıları kurmak yakından paketlenmiş bir doku kitlesi içinde genellikle kaplı bulunmaktadır. Buna göre, kimyasal ortam ve 3D doku hücreleri içinde yaşadığı fiziksel kuvvetlerin tek tabaka kültüründe yetişen hücreleri tarafından deneyimli dışında temelde farklı. Bu hücresel morfoloji ve sinyalizasyon belirgin etkisi gösterilmiştir. Kollajen jeller 1 veya biyomalzeme iskelelerde 2 hücre de dahil olmak üzere kapsülleme 3D hücre kültürleri oluşturmak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Bu tür yöntemler, yararlı olmakla beraber, normal dokularda bulunan samimi doğrudan hücre-hücre adezyon mimarisi özetlemek değil. Aksine, onlar daha yakından yaklaşık kültür sistemleri tek hücre, gevşek bir 3D ECM ürünleri ağ örgüsü içinde dağılmış bulunmaktadır. Burada, basit bir yöntem hücreleri açılan kültür asılı olarak yerleştirilir ve hücrelerin birbirleri ile ve ekstrasellüler matriks bileşenleri ile doğrudan temas halinde olan gerçek 3D parçacıklarının oluşana kadar fizyolojik şartlar altında inkübe olduğu açıklanmaktadır. Bu yöntem hiçbir özel ekipman gerektirir ve hücre-hücre veya hücre-ECM etkileşimi üzerindeki etkileri nedenlerine açıklık ilgi olabilir çok küçük miktarlarda herhangi bir biyolojik ajan eklenmesi için adapte edilebilir. Yöntemi de ko-kültür iki (veya daha fazla) farklı hücre popülasyonlarının hücreleri arasındaki mekansal ilişkileri belirterek, hücre-hücre veya hücre-ECM etkileşimleri rolünü aydınlatmak için kullanılabilir. , Hücre-hücre uyum ve hücre-ECM yapışma malign invazyon, yara iyileşmesi, doku mühendisliği uygulamaları için embriyonik gelişim, stromal tümör hücre etkileşimi çalışmaları temel taşlarından. Bu basit bir yöntem gibi doku biyomekanik özellikleri ölçümü veya hücresel, fizyolojik ilgili bir model moleküler ve biyokimyasal analiz için agrega üreten bir araç sağlayacaktır.

Biz 3D doku parçacıklarının ve potansiyel uygulama üreten hücre-hücre etkileşimleri farklılıkları ölçmek için basit ve hızlı bir yöntem açıklanmaktadır.

3D parçacıklarının Üretimi için Basit Asma Bırak Hücre Kültürü Protokolü

Hücre-hücre kohezyonu ve hücre-substrat adhezyonu üzerine yapılan çalışmalar, tarihsel olarak sert substratlara adhere olmuş tek tabaka kültürler üzerinde gerçekleştirilmiştir. Hücreler...

Bu deneyin amacı, 3D doku benzeri steroidler üretmektir. Bu işlem, öncelikle kültüre edilmiş hücrelerin hasat edilmesi ve ardından tek hücre süspansiyonu oluşturulmasıyla gerçekleştirilir. Sonrasında, hücre süspansiyonundan damlalar, bir doku kültürü kabının ters çevrilmiş kapağının alt kısmına yerleştirilir.Ardından kapak, nemlendirme haznesinin üzerine ters çevrilerek kapatılır. Son adım, agregatların oluşmasına izin vermek için asılı damlaların 24 ila 48 saat boyunca inkübe edilmesidir. Bunlar daha sonra çalkalayıcı bir su banyosuna aktarılabilir ve beş güne kadar inkübe edilebilir.Nihayetinde, sıkıştırma deneyleri, doku yüzeyi 10 simetrisi veya epifloresan mikroskopi aracılığıyla agregat kohezyonu veya hücre ayrışmasındaki farklılıkları gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu tekniğin, örneğin geleneksel 2D doku kültürü gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, 3D ortamda büyütülen hücrelerin, bir doku ortamındaki hücrelerin deneyimlediği hücresel etkileşimleri daha yakından taklit etmesidir. Bu yöntemin, bir PI'nin bile yapabileceği kadar basit olduğunu göstermek için uygulamalı olarak anlatacağım.Bu deneye başlamak için, %90 konfluens düzeyindeki adherent hücreleri hasat edin. Öncelikle, kültür ortamını aspire edin ve hücre tabakasını iki kez PBS ile durulayın. Ardından PBS'yi aspire edin ve monokatman üzerine iki mililitre %0.05'lik tripsin EDTA çözeltisi pipetleyin.Plakayı 37 °C'lik doku kültürü inkübatörüne yerleştirin ve hücreler ayrılana kadar inkübe edin. Ardından, plakayı inkübatörden çıkarın ve işlemi durdurun. İki mililitre tam besiyeri ekleyin.Hücreler tamamen süspansiyona girene kadar karışımı titre etmek için beş mililitrelik bir pipet kullanın. Ardından hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Hücre süspansiyonunun içine 10 miligram/mililitre konsantrasyonda 40 mikrolitre DNA çözeltisi pipetleyin ve inkübasyon sonrası oda sıcaklığında beş dakika bekletin.Hücre süspansiyonunu kısa süreliğine vorteksleyin ve ardından 200 ×g'de beş dakika santrifüj edin. Santrifüjleme işlemi tamamlandığında, S süpernatantını aspire ederek atın, ardından yıkama yapmak için peleti bir mililitre kompleten ortamda yeniden süspanse edin. Santrifüjleme işlemini tekrarlayın ve peleti bir mililitre kompleten ortamda yeniden süspanse edin.Ardından, otomatik bir hücre sayıcı veya hemositometre kullanarak hücre sayımı yapın. Hücre süspansiyonunu, besiyeri ile 2.5 × 10⁶ hücre/mL nihai konsantrasyona ayarlayın. Daha sonra asılı damla oluşumuna geçin.60 milimetrelik bir doku kültürü tabağının kapağını çıkarıp tabağın tabanına beş mililitre PBS pipetleyerek bir nemlendirme odası hazırlayın. Plağın kapağını ters çevirin ve kapağın alt kısmına 2010 mikrolitre hücre süspansiyonu damlaları damlatın. Damlaların birbirine değmeyecek kadar yeterli mesafede yerleştirildiğinden emin olun.Damla kültürlerini içeren kapağı, PBS içeren kabın altına nazikçe geri yerleştirin. Kültür plağını bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin. 37 °C, %5 karbon dioksit ve %95 nem değerlerine ayarlayıp gece boyunca inkübe edin.Damlaları günlük olarak takip edin ve hücre tabakaları veya agregatlar oluşana kadar inkübasyona devam edin. Hücre tabakaları veya agregatlar oluştuktan sonra, bunları üç mililitre tam besiyeri içeren yuvarlak tabanlı cam çalkalama balonlarına aktarın. Hücre tabakaları veya agregatlar içeren balonları sallamalı bir su banyosunda inkübe edin.Steroid oluşumu bir diseksiyon mikroskobu altında gözlemlenene kadar yaklaşık 24 saat boyunca 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında tutulur. Steroidler oluştuktan sonra, deneysel manipülasyonların steroid oluşumu üzerindeki etkisi, yazılı protokolde belirtilen prosedüre göre nicelendirilebilir. Ayrıca, daha önce eklenmiş olan herhangi bir floresan boyanın membran interkalasyonu, floresan mikroskobu kullanılarak gözlemlenebilir.Bu parlak alan mikroskop görüntüsü, asılı damla yöntemi kullanılarak 18 saatlik inkübasyon sonrası sıçan prostat kanseri MLL hücrelerinin agregasyonunu göstermektedir. Bu görüntü, asılı damla yöntemi kullanılarak yapılan 18 saatlik kültür sonrası oluşan ikinci bir MLL hücresi agregatını göstermektedir. Bu hücreler, 25 micromolar MEK inhibitörü PD 9 8 0 5 9 varlığında kültüre edilmiş olup, sonuçta önemli ölçüde daha kompakt bir hücre agregatı oluşmuştur.Burada, MEK inhibitörü ile işlem görmüş MLL asılı damla kültürü agregat boyutu ile işlem görmemiş kontrol agregat boyutu arasındaki fark gösterilmektedir. Yıldız işareti, P değerinin 0,0001'den küçük olduğu istatistiksel olarak anlamlı bir farkı temsil etmektedir. İşlem görmemiş ve MEK inhibitörü ile işlem görmüş agregatlar arasında yapılan öğrenci t-testi (Student's t-test) ile belirlenen bu durum, MEK inhibitörü uygulamasının anlamlı derecede daha küçük ve daha kompakt agregatlar oluşmasıyla sonuçlandığını göstermektedir.Bu görüntü bir Nikon Smz 800 stereo mikroskop kullanılarak yakalanmıştır ve civciv embriyonik karaciğer hücrelerinin 18 saat boyunca asılı damla kültüründe, ardından 48 saat boyunca 37 °C'lik çalkalamalı su banyosunda inkübe edilmesiyle oluşan bir steroid yapısını göstermektedir. Bu konfokal mikroskop görüntüsü, belirli hücre popülasyonları asılı damla yöntemiyle birlikte kültüre edildiğinde meydana gelen ayrışma davranışını ortaya koymaktadır; asılı damla kültürüne geçilmeden önce civciv embriyonik karaciğer hücreleri PKH2 membran inter kaplama boyası ve civciv embriyonik hücreleri ile boyanmıştır.Kalp hücreleri PKH 26 ile boyandı. Hücre süspansiyonları daha sonra karıştırıldı ve asılı damla yöntemi uygulandı. Kültür işlemi 18 saat boyunca gerçekleştirildi ve ardından 37 °C'deki çalkalayıcı su banyosunda 48 saatlik inkübasyon yapıldı.Optik kesitten, sarı renge boyanmış kalp hücrelerinin karaciğer hücreleri tarafından çevrelendiği görülmektedir. Burada maviye yalancı renklendirilmiş olanlar, yüzeylerinde NCA eksprese eden iki nardi ve transfekte L hücre klonlarıdır. Bunlar, 2,4'e bir oranında, eşit oranlarda karıştırılmış floresan membran içine yerleşen boyalar PKH 2 ve PKH 26 ile boyanmış ve daha önce olduğu gibi asılı damlacıklar şeklinde kültüre edilmiştir.Bu örnekte, yeşil yalancı renge boyanmış yüksek düzeyde cadian eksprese eden hücreler, kırmızı yalancı renge boyanmış daha düşük düzeylerde en cadian eksprese eden hücreler tarafından çevrelenmiştir. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde işlem 30 dakika veya daha kısa sürede tamamlanabilir.

a-simple-hanging-drop-cell-culture-protocol-for-generation-3d

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Spheroids, 2B hücre kültürü tek katmanlı modellere kıyasla bir hücrenin ortamını daha doğru bir şekilde temsil etmek için kullanılan bir tür 3B hücre kültürü modelidir. Örnek protokolde, bilim adamlarının bir kolorektal kanser hücre hattından sferoidler ürettiğini ve sferoidlerin büyümesini izlemek için canlı hücre görüntüleme uyguladığını göreceğiz.

Hücre Hatlarından Küresel Üretim: Üç Boyutlu (3D) Bir Hücre Kültürü Yöntemi

Bu videoda, melanom hücreleri kullanılarak asılı bırakma yöntemiyle üç boyutlu sferoidler oluşturma tekniği açıklanmaktadır. Oluşturulan in vitro üç boyutlu (3D) organotipik melanom sferoid modeli, malign melanomun in vivo mimarisini tasvir edebilir ve intratümöral etkileşimler hakkında bilgi verebilir.

Asılı Damla Yöntemi: 3D Melanom Sferoidleri Oluşturmak İçin Bir Teknik

Bu yöntem, kanser hücresinin sferoidlerden çevredeki bir 3B matrise invazyonunu değerlendirir.  Sferoidler, asılı damla kültürü yöntemi ile üretilir ve daha sonra bazal membran malzemeleri ve tip I kollajenden oluşan bir matrise gömülür.  Spheroidlerin istilası daha sonra izlenir.

Bir Kanseri Hücre Sfero Testi 3D ortamda Invasion Değerlendirmek için

Burada, hücre agregasyonu yoluyla 3B hücre sferoidlerinin oluşumu için hızlı ve esnek bir protokol açıklıyoruz. Bu, birden fazla hücre tipine kolayca uyarlanır ve hücre göçü, istila veya anoikis tahlilleri dahil olmak üzere çeşitli uygulamalarda ve hücre-matris etkileşimlerini görüntülemek ve ölçmek için uygundur.

3D Sfero Üretim için bir Verimli ve esnek Hücre Toplama Yöntemi

Bu protokol, ilacın belirlenmesi için, hastanın türetildiği kürlerin oluşumunu, proliferasyonun ölçülmesi, sitotoksisite testi, akış sitometri, immünofluoresesans boyama ve konfoksel görüntüleme gibi aşağı akış analizini açıklar. anti-neoplastik terapötik olarak adayların potansiyeli. Bu protokol her hasta ve hastalığın aşaması için spesifik ilaçların tanımlanması ile hassas ilacı destekler.

Fizyolojik hasta, kanser kök hücrelerini hedef alan anti-neoplastik Ilaç taraması için 3B kürler türetilmiştir

Burada, 2D kültürden çok daha iyi in vivo tümörlerin fiziko-kimyasal degradelerini taklit eden 3D kanser hücresi kürelerinin içinde canlanıyor ve ölümü değerlendirmek için birkaç basit yöntem sunuyoruz. Bu nedenle, küroid modeli, kanser ilaç etkinliğinin değerlendirilmesi için gelişmiş çeviri ile in vivo koşullara izin verir.

Hücre viability ve ölüm kanser hücrelerinin 3D Küroid kültürlerde değerlendirilmesi

Biz hücre küresel leri yetiştirmek için bir motor destekli santrifüj mikroakışkan cihaz satıyoruz. Bu cihazı kullanarak, tek veya birden fazla hücre tiplerinin küresel leri yüksek yerçekimi koşullarında kolayca cokültüre edilebilir.

Çok Hücreli Üç Boyutlu Spheroidler Üretmek için Lab-on-a-CD Platformu

Mevcut protokol, 3D baskılı damga benzeri bir cihaz kullanarak uygun maliyetli bir şekilde büyük ölçekte doku sferoidleri üretmek için bir tekniği açıklamaktadır.

3D baskılı damga benzeri bir cihaz aracılığıyla doku sferoidlerinin üretilmesi

Görüntü yakalama ve proteomik kullanarak yüksek tekrarlanabilirliğe sahip sferoidlerin yetiştirilmesi ve fenotipik karakterizasyonu için bir protokol sunuyoruz.

Fonksiyonel 3D Küresel Hücre Kültürlerinin Yarı Otomatik Fenotipik Analizi

Bu çalışma, agaroz kalıplarında mikro kuyular oluşturmak için damga tabanlı bir sistem kullanarak 3D hücre yapıları oluşturmak için uygun maliyetli ve verimli bir metodoloji sunmaktadır. Sistem, tek tip sferoidlerin/organoidlerin oluşumunu teşvik eder, böylece hücre etkileşimlerini iyileştirir. Bu yaklaşım deneysel değişkenliği azaltır ve ilaç testi ve doku mühendisliğindeki uygulamaları destekler.

Yeni Bir Damga Cihazı Kullanılarak İki Boyutlu Hücre Kültürlerinden Üç Boyutlu Sferoidlerin/Organoidlerin Üretilmesi

Öğrenin, asma bırak yöntemiyle 3D hücre küreleri oluşturmayı. Bu hızlı teknik, hücre-hücre etkileşimlerini incelemek için doku mühendisliği ve hücre biyolojisi araştırmalarında kullanılır.

3D parçacıklarının Üretimi için Basit Asma Bırak Hücre Kültürü Protokolü

Daha fazla video keşfet