3D parçacıklarının Üretimi için Basit Asma Bırak Hücre Kültürü Protokolü

Bu deneyin amacı, 3D doku benzeri steroidler üretmektir. Bu işlem, öncelikle kültürlenmiş hücrelerin hasat edilmesi ve ardından tek hücre süspansiyonunun oluşturulmasıyla gerçekleştirilir. Sonrasında, hücre süspansiyonu damlacıkları, bir doku kültürü kabının ters çevrilmiş kapağının alt kısmına damlatılır.

Ardından kapak, hidratasyon odasının üzerine ters çevrilerek kapatılır. Son adım, agregatların oluşmasına izin vermek için asılı damlaların 24 ila 48 saat boyunca inkübe edilmesidir. Bunlar daha sonra çalkalamalı bir su banyosuna aktarılabilir ve beş güne kadar daha inkübe edilebilir.

Nihayetinde; sıkışma analizleri, doku yüzey 10 simetrisi veya epi-floresan mikroskopi yoluyla agregat kohezyonundaki veya hücre seçilimindeki farklılıkları gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu tekniğin, örneğin geleneksel 2D doku kültürü gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, 3D ortamda büyütülen hücrelerin, bir doku ortamındaki hücrelerin deneyimlediği hücresel etkileşimleri daha yakından taklit etmesidir. Bu yöntemin, bir PI'nin bile yapabileceği kadar basit olduğunu göstermek için uygulamalı olarak sunacağım.

Bu deneye başlamak için, %90 konfluense ulaşmış adherent hücreleri hasat edin. İlk olarak, kültür medyasını aspire edin ve hücre tabakasını iki kez PBS ile durulayın. Ardından PBS'yi aspire edin ve monokatman üzerine iki mililitre %0,05'lik tripsin EDTA çözeltisi pipetleyin.

Plakayı 37 °C doku kültürü inkübatörüne yerleştirin ve hücreler ayrılana kadar inkübe edin. Ardından, plağı inkübatörden çıkarın ve işlemi durdurun. İki mL komple medyum ekleyin.

Hücreler tamamen süspansiyona girene kadar karışımı titrate etmek için beş mililitrelik bir pipet kullanın. Ardından hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Hücre süspansiyonuna 10 miligram/mililitre konsantrasyonunda DNA çözeltisinden 40 mikrolitre pipetle ekleyin ve inkübasyonu takiben oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

Hücre süspansiyonunu kısa bir süre vorteksleyin ve ardından 200 ×g'de beş dakika santrifüj edin. Santrifüj işlemi tamamlandığında, S süpernatanını aspire ederek atın, ardından yıkama işlemi için peleti bir mililitre tam besiyerinde yeniden süspande edin. Santrifüjleme işlemini tekrarlayın ve peleti bir mililitre tam besiyerinde tekrar süspande edin.

Ardından, otomatik bir hücre sayacı veya hemositometre kullanarak hücre sayımı yapın. Hücre süspansiyonunu, besiyeri ile 2,5 x 10⁶ hücre/mL nihai konsantrasyona ayarlayın. Daha sonra asılı damla oluşturma aşamasına geçin.

60 milimetrelik bir doku kültürü kabının kapağını çıkarıp kabın tabanına beş mililitre PBS pipetleyerek bir nemlendirme odası hazırlayın. Kabın kapağını ters çevirin ve kapağın alt kısmına 2010 mikrolitre hücre süspansiyonu damlaları pipetleyin. Damlaların birbirine değmeyecek şekilde yeterince ayrı yerleştirildiğinden emin olun.

Damla kültürlerini içeren kapağı, PBS içeren kabın altına nazikçe geri yerleştirin. Kültür plağını bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin. 37 °C, %5 karbondioksit ve %95 nem değerlerine ayarlayıp gece boyunca inkübe edin.

Damlaları günlük olarak takip edin ve hücre tabakaları veya agregatlar oluşana kadar inkübasyona devam edin. Hücre tabakaları veya agregatlar oluştuktan sonra, bunları üç mililitre komple besiyeri içeren yuvarlak tabanlı cam çalkalama erlenlerine aktarın. Hücre tabakaları veya agregatlar içeren erlenleri çalkalamalı bir su banyosunda inkübe edin.

Steroid oluşumu bir diseksiyon mikroskobu altında gözlemlenebilene kadar yaklaşık 24 saat boyunca 37 °C ve %5 karbondioksit altında tutulur. Steroidler oluştuktan sonra, deneysel manipülasyonların steroid oluşumu üzerindeki etkisi, yazılı protokolde belirtilen prosedüre göre nicelleştirilebilir. Ayrıca, önceden eklenmiş olan herhangi bir floresan boyanın membran interkalasyonu, artık floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilebilir.

Bu parlak alan mikroskop görüntüsü, asılı damla yöntemi kullanılarak 18 saatlik inkübasyon sonrası sıçan prostat kanseri MLL hücrelerinin agregasyonunu göstermektedir. Bu görüntü, asılı damla yöntemiyle 18 saatlik kültür sonrası oluşan ikinci bir MLL hücresi agregatını göstermektedir. Bu hücreler, 25 µM MEK inhibitörü PD 9 8 0 5 9 varlığında kültüre edilmiş olup, sonuçta önemli ölçüde daha kompakt bir hücre agregatı oluşmuştur.

Burada, MEK inhibitörü ile işlem görmüş MLL asılı damla kültürü agregat boyutu ile işlem görmemiş kontrol agregat boyutu arasındaki fark gösterilmiştir. Yıldız işareti, P değerinin 0,0001'den küçük olduğu istatistiksel olarak anlamlı bir farkı temsil eder. İşlem görmemiş ve MEK inhibitörü ile işlem görmüş agregatlar arasında yapılan öğrenci t-testi ile belirlenen bu sonuç, MEK inhibitörü uygulamasının anlamlı derecede daha küçük ve daha kompakt agregatlarla sonuçlandığını göstermektedir.

Bu görüntü bir Nikon Smz 800 stereo mikroskobu kullanılarak çekilmiştir ve civciv embriyonik karaciğer hücrelerinin 18 saat boyunca asılı damla kültüründe, ardından 48 saat boyunca 37 °C sıcaklıktaki çalkalayıcı su banyosunda inkübe edilmesiyle oluşan bir steroidi göstermektedir. Bu konfokal mikroskop görüntüsü, asılı damla yöntemiyle belirli hücre popülasyonları birlikte kültürlendiğinde meydana gelen ayrışma davranışını ortaya koymaktadır; asılı damla kültürüne geçilmeden önce civciv embriyonik karaciğer hücreleri pkh two membran inter kaplama boyası ve civciv embriyonik ile boyanmıştır.

Kalp hücreleri PKH 26 ile boyandı. Ardından hücre süspansiyonları karıştırıldı ve asılı damla yöntemi uygulandı. 18 saat boyunca kültür yapıldı ve ardından 37 °C'lik çalkalayıcı su banyosunda 48 saat inkübasyon gerçekleştirildi.

Optik kesitten, sarı renkli kalp hücrelerinin karaciğer hücreleri tarafından çevrelendiği görülebilir. Burada maviye yalancı renklendirilmiş olanlar, yüzeylerinde NCA eksprese eden iki nardi ve transfekte L hücre klonudur. Birle bir 2,4 oranında, eşit oranlarda karıştırılmış PKH 2 ve PKH 26 floresan membran birleştirici boyalarla boyanmış ve daha önce olduğu gibi asılı damlalar halinde kültürlenmişlerdir.

Bu örnekte, yeşil yalancı renkle işaretlenen yüksek düzeyde cadherin eksprese eden hücreler, kırmızı yalancı renkle işaretlenen ve daha düşük düzeylerde cadherin eksprese eden hücreler tarafından çevrelenmiştir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde uygulandığı takdirde 30 dakika veya daha kısa sürede tamamlanabilir.