3D parçacıklarının Üretimi için Basit Asma Bırak Hücre Kültürü Protokolü

Bu deneyin amacı, steroidler gibi 3 boyutlu doku üretmektir. Bu, önce kültürlenmiş hücrelerin hasat edilmesi ve daha sonra tek hücreli bir süspansiyonun üretilmesiyle gerçekleştirilir. Hücre süspansiyonunun sonraki damlaları, bir doku kültürü kabından ters çevrilmiş kapağın alt tarafına bırakılır.

Daha sonra kapak, hidrasyon odasına ters çevrilir. Son adım, agregaların oluşmasına izin vermek için asılı damlaları 24 ila 48 saat inkübe etmektir. Bunlar daha sonra çalkalanan bir su banyosuna aktarılabilir ve beş güne kadar daha inkübe edilebilir.

Sonuç olarak, sıkıştırma testleri, doku yüzeyi 10 simetrisi veya epi floresan mikroskobu yoluyla agrega kohezyonu veya hücre sıralamasında farklılıklar gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu tekniğin, örneğin geleneksel 2D doku kültürü gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, 3D olarak yetiştirilen hücrelerin, bir doku ortamındaki hücrelerin yaşadığı hücresel etkileşimleri daha yakından taklit etmesidir. Size bir PI'nin bile yapabileceği kadar basit olduğunu göstermek için bu yöntemi göstereceğim.

Bu deneye başlamak için, yapışma hücrelerini %90 co akıcılığında hasat edin. İlk olarak, kültür ortamını aspire edin ve hücre tabakasını PBS ile iki kez durulayın. Daha sonra PBS'yi aspire edin ve tek katmanlı tabaka üzerine EDTA çözeltisinde iki mililitre% 0.05'lik tripler pipetleyin.

Plakayı 37 santigrat derece doku kültürü inkübatörüne yerleştirin ve hücreler ayrılana kadar inkübe edin. Ardından, plakayı inkübatörden çıkarın ve izasyonu durdurun. İki mililitre tam ortam ekleyerek.

Hücreler tamamen süspansiyon haline gelene kadar karışımı tritrate etmek için beş mililitrelik bir pipet kullanın. Daha sonra hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Mililitre başına 10 miligramlık 40 mikrolitrelik DNA solüsyonunu hücre süspansiyonuna pipetleyin ve inkübasyonu takiben beş dakika oda sıcaklığında inkübe edin.

Hücre süspansiyonunu kısa bir süre vorteksleyin ve ardından beş dakika boyunca yerçekiminin 200 katında santrifüjleyin. Santrifüjleme tamamlandıktan sonra, S süpernatanı aspire edin ve atın, ardından paleti yıkamak için bir mililitre tam ortamda yeniden süspanse edin. Santrifüjlemeyi ve Reese'i peletten bir mililitre tam ortamda tekrarlayın.

Ardından, otomatik bir hücre sayacı veya hemo sitometre kullanarak bir hücre sayımı yapın. Ortam ile hücre süspansiyonunu mililitre başına altı hücreye 2,5 kez 10 kez nihai konsantrasyona ayarlayın. Sonra asılı damla oluşumuna devam edin.

Kapağı 60 milimetrelik bir doku kültürü kabından çıkararak ve tabağın dibine beş mililitre PBS pipetleyerek bir hidrasyon odası hazırlayın. Plakanın kapağını ters çevirin ve kapağın alt tarafına 2010 mikrolitreye kadar hücre süspansiyonu damlatın. Damlaların birbirine değmeyecek şekilde yeterince aralıklı olduğundan emin olun.

Damla kültürlerini içeren kapağı yavaşça PBS içeren tabağın altına geri yerleştirin. Kültür plakasını bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin. 37 santigrat derece, %5 karbondioksit ve %95 neme ayarlayın ve gece boyunca inkübe edin.

Damlaları günlük olarak izleyin ve hücre tabakaları veya agregalar oluşana kadar inkübasyona devam edin. Hücre tabakaları veya agregalar oluştuktan sonra, bunları üç mililitre tam ortam içeren yuvarlak tabanlı cam çalkalayıcı şişelerine aktarın. Hücre tabakalarını veya agregaları içeren şişeleri çalkalanan bir su banyosunda inkübe edin.

Steroid oluşumu diseksiyon mikroskobu altında görüntülenene kadar yaklaşık 24 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte tutulur. Steroidler oluşturulduktan sonra, deneysel manipülasyonların steroid oluşumu üzerindeki etkisi, yazılı protokolde belirtilen prosedüre göre ölçülebilir. Ayrıca, daha önce dahil edilmiş herhangi bir floresan boyanın membran interkalasyonu artık floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilebilir.

Bu parlak alan mikroskobu görüntüsü, asılı damla yöntemi kullanılarak 18 saatlik inkübasyondan sonra sıçan prostat kanseri MLL hücrelerinin toplanmasını göstermektedir. Bu görüntü, asılı damla yöntemi kullanılarak 18 saatlik kültürden sonra oluşan ikinci bir MLL hücresi agregasını göstermektedir. Bu hücreler, MEK inhibitörü PD 9, 8, 0, 5, 9'un 25 mikromolar varlığında kültürlendi ve bu da önemli ölçüde daha kompakt bir hücre agregatı ile sonuçlandı.

Burada, MEK inhibitörü ile muamele edilen MLL asılı damla kültürü, agrega boyutu ve muamele edilmemiş kontrol agrega boyutu arasındaki fark gösterilmiştir. Yıldız işareti, 0,0001'den küçük P'lik istatistiksel olarak anlamlı bir farkı temsil eder. Öğrenciler tarafından belirlendiği gibi, tedavi edilmemiş ve MEK inhibitörü ile tedavi edilmiş agregatlar arasında T-testi ve MEK inhibitörü tedavisinin önemli ölçüde daha küçük ve daha kompakt agregalarla sonuçlandığını göstermektedir.

Bu görüntü bir Nikon Smz 800 stereo mikroskop kullanılarak yakalanmıştır ve civciv embriyonik karaciğer hücrelerinin 18 saat boyunca asılı damla kültüründe inkübe edilmesiyle oluşturulan bir steroidi göstermektedir. Daha sonra 48 saat boyunca 37 santigrat derece sallanan su banyosunda. Bu konfokal mikroskop görüntüsü, asılı damla kültürüne geçmeden önce belirli hücre popülasyonları asılı damla yöntemi kullanılarak birlikte kültürlendiğinde meydana gelen sıralama davranışını göstermektedir: civciv embriyonik karaciğer hücreleri pkh iki zar arası kaplama boyası ve civciv embriyonik ile boyanmıştır.

Kalp hücreleri PKH 26 ile boyandı. Hücre süspansiyonları daha sonra karıştırıldı ve damla asılı bırakıldı. Kültür 18 saat boyunca gerçekleştirildi, ardından 37 santigrat derece çalkalanan su banyosunda 48 saat inkübasyon yapıldı.

Optik bölümden sarı renkli kalp hücrelerinin karaciğer hücreleri tarafından sarıldığı görülebilir. Burada yalancı renkli mavi, yüzeylerinde NCA'yı eksprese eden iki nardi ve transfekte L hücresi klonu. 2.4'e bir oranında, floresan membran ile harmanlama boyalarına, PKH iki ve PK KH 26'ya boyandı ve daha önce olduğu gibi asılı damlalar olarak kültürlendi.

Bu örnekte, yalancı yeşil renkli üst düzey cadian eksprese eden hücreler, psödo-kırmızı renkli olan daha düşük en cadian seviyelerini ifade edenler tarafından sarılır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa 30 dakika veya daha kısa sürede yapılabilir.