Travmatik Beyin Hasarı Eğitim için Nöronal Hücre Dürtüsel Basınçlandırma

Bu prosedürün genel amacı, travmatik beyin hasarı çalışması için kültürlenmiş beyin hücrelerine impulsif basınç uygulamak ve bunu gözlemlemektir. Bu işlem, öncelikle retinoik asit kullanılarak kültürlenen hücrelerin nöronal diferansiyasyonunun indüklenmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, nöronal hücreler ksky bar tabanlı hücre basınçlandırma cihazına yerleştirilir ve blast kaynaklı travmatik beyin hasarı ile ilgili büyüklük ve sürede impulsif basınca maruz bırakılır.

Son olarak, hücre hasarlarını ve travmatik beyin hasarının olası mekanizmalarını değerlendirmek amacıyla hücrelere moleküler biyoloji analizleri uygulanır. Mikroskobik inceleme sonuçları, 2 megapascal büyüklüğünde ve 0.7 milisaniye süreli impulsif basınçlandırmada nöronal hücre ölümü ve nörit aksonal yapı kaybı olduğunu göstermektedir. Bu tekniğin sıvı perküsyonu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, negatif basınç bölümlerinin olmaması ve süre süresinin iyi kontrol edilebilmesidir.

Bu yöntem, impulsif basınç, büyüklük, süre ve yükleme şeklinin bir fonksiyonu olarak nöron hücre ölümü veya hasarı için eşik değer gibi, travmatik beyin hasarı (TBI) alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem şimdiye kadar grubumuz tarafından blast kaynaklı TBI'yi incelemek için kullanılmış olsa da, darbe kaynaklı TBI gibi diğer travmatik beyin hasarı türleri için de kullanılabilir. Prosedür, Profesör Chen fang'in laboratuvarından lisansüstü öğrenci Matthew ve benim laboratuvarımdan teknisyen li ha tarafındanle gösterilecektir.

Bu deneyde, hücre basınçlandırma düzeneği olarak yapılandırılmış bir Ksky bar kullanılmaktadır. Düzenek, hizalanmış pirinç yataklarla asılmış iki adet altı metrelik alüminyum alaşımlı çubuktan ve bir in vitro hücre basınçlandırma odasından oluşur. Çubukların arasına yerleştirilen hücre basınçlandırma odası, bir piston silindirinden meydana gelmektedir.

Silindirin boşluğunun tabanında, hücre örneği yerleştirilmesi sırasında havayı ve fazla sıvıyı tahliye eden küçük bir delik bulunmaktadır. Piston, çubukla aynı tüpten yapılmıştır ve iki veya üç kat Teflon bant ile sarılmıştır. Uç kapak, cam lamelleri iki küçük paslanmaz çelik vida ile sabitler.

Bu demonstrasyonda SH SY five Y insan nöroblastoma hücreleri kullanılmıştır. Bununla birlikte, protokol birçok hücre modeli kültürüne uygulanabilir. Hücreler, 18 milimetre çapındaki cam lameller üzerine santimetrekare başına 3000 hücre yoğunluğunda ekilmiştir.

Hücreleri inkübe ederken, besiyerine yedi gün boyunca her iki günde bir değiştirilmek üzere 10 micromolar retinoic acid ekleyerek DMEM'de farklılaşmalarını tetikleyin. Yedinci günde hücreler, iyi gelişmiş nörit aksonal yapı sergiler ve basınç uygulanmaya hazır hale gelir. Basınç odasının tüm parçalarını otoklav kullanarak sterilize edin ve oda kurulumu sırasında parçaları UV ışığı altında muhafaza edin.

Bir kültür kabininde, haznedeki havalandırma vidasının hava çıkışına gevşek bir şekilde yerleştiğinden emin olun. Boşluğun tabanında, hazneyi taze hazırlanmış sıcak büyüme ortamı ile doldurun. Ardından, hücreler dışa bakacak şekilde, hücre kültürü yapılmış bir cam lamı piston kapağına vidalayın ve pistonu dikkatlice hazne boşluğuna yerleştirin.

Havalandırma vidasını çıkarın, havalandırma ağzını yukarı doğru eğin ve pistonu oda içerisindeki önceden belirlenmiş referans çizgisine kadar itin. Bu işlem, hücre basınçlandırma odası içinde yaklaşık altı milimetrelik bir sıvı derinliği bırakır. Kabarcık oluşumundan kaçının, havalandırma vidasını sterilize edin ve odayı sızdırmaz hale getirmek için vidayı tekrar yerine takın.

Hazne, statik yük altında sızdırmamalıdır. Ksky bar sistemini sıfırlayın. Ağır kütleyi orijinal konumuna geri getirin ve kilitleme cıvatasını yerine takın.

Kilitleme cıvatası, pimler kırılana kadar gelen barın hareketini önleyen bir sıkıştırma kuvveti sağlar. Yeni kilitleme cıvatasını hidrolik kriko ile yaklaşık 200 PSI değerine getirin. Gelen barın ön yükleme bölümünü, istenen değerden biraz daha yüksek bir basınca getirmek için makaslı kriko kullanın ve ardından JAK vidasının tam sürtünmesini sağlamak için geri çekin. Basınçlandırma yaklaşık bir milisaniye sürdüğü için şimdi veri toplama sistemini ayarlayın.

Bir Wheatstone köprüsü devresinde 2000 ohm'luk gerinim ölçerler kullanarak bir megahertz'lik bir örnekleme frekansı ayarlayın. Voltaj, iletim çubuğunda 45 volt olarak ayarlanmalıdır. Hücre haznesini, piston iletim çubuğuna bakacak şekilde monte edin.

Hücre haznesini, küçük laboratuvar makas krikosu tarafından desteklenen ve iki çubukla hizalanmış bir V bloğuna yerleştirin. Her bir arayüzü hafifçe yağlayın ve birbirine nazikçe sürterek temas eden yüzeyler arasındaki havayı giderin. Sistem şu an hazır durumdadır.

Veri toplama sistemini etkinleştirin ve hidrolik klemp sürücüsünü hızla pompalayarak testi gerçekleştirin. Bu işlem kilitleme cıvatasının kırılmasını sağlayarak klembin ayrılmasına ve hücrelere bir basınç dalgasının iletilmesine neden olur. Testten sonra, lamı kültür kabininde odağından çıkarın ve hücre davranışının değerlendirilmesine geçin.

Deneyimle beraber, düzenek saatte yaklaşık dokuz hücre kültürü lamına basınç uygulamak için kullanılabilir. Okuma analiz edilirken, iletilen çubuk sinyalinin başlangıcında hava kabarcığı hataları görülebilir, ancak bu gösterimde bunlar görülmemektedir.

Geçirgenlik çubuğu yeterince uzunsa, en önemli veriler ilk bozulma ile başlamalı ve ölçümlerin negatif basınç gösterdiği yerde sonlanmalıdır; bu voltaj okuması, strain gauge analizi yoluyla hücrelerin maruz kaldığı strese orantılıdır. İletilen darbenin süresi, gelen darbeden daha kısa olabilir. Hücre basınçlandırma odasındaki sıvıya küçük bir hava kabarcığı hapsolursa, iletilen darbenin genliği gelen darbeninkini aşmayabilir ancak boşaltmadan önce yeterince uzun bir platoya sahip olmalıdır.

Aksi takdirde, ya sızdırmaz hazne içinde büyük bir hava kabarcığı kalmıştır ya da düzenek ile bar hizalanmamıştır. Basınçlandırmanın ardından hücreler hemen incelenebilir veya daha sonraki incelemeler için inkübasyona devam edilebilir. Basınçlandırılmış hücreleri, aynı şekilde işlem görmüş ancak basınçlandırmaya tabi tutulmamış hazne kontrol hücreleriyle karşılaştırın ve inkübasyon sonrası çeşitli zaman noktalarında optik mikroskopi ile nörit uzunluğundaki değişimleri değerlendirin.

Aktin immünofloresan boyama,le sitoiskeletsel değişiklikleri değerlendirmek için kullanılabilir. Ayrıca, mikrotübül ilişkili protein iki (MAP2) antikoru, temel nöronal belirteçlerden birindeki değişiklikleri görselleştirmek için kullanılabilir.

İmpulsif basınçlandırmanın nöronal ve apoptotik gen ekspresyonu üzerindeki etkisini değerlendirmek için, istenirse R-T-P-C-R gibi standart moleküler biyoloji tekniklerini kullanın. İmmünobloting için yeterli hücre lizatı, aynı basınca maruz bırakılmış birkaç hücre örneğinden toplanabilir. Bu örnekte, basınçlandırma profilinde, ksky bar aparatı, optik mikroskop görüntülerinde görüldüğü üzere, kültürlenmiş nöronal hücrelere yaklaşık 0,7 milisaniye süreli, iki megapascal seviyesinde tek darbeli impulsif basınç başarıyla uygulamıştır; iki megapascal impulsif basınca maruz kalan SHSY five Y insan nöronal hücreleri, basınçlandırılmamış kontrol hücrelerine kıyasla belirgin nörit akson yıkımı göstermektedir.

Bu prosedürü uygularken, hücrelerin gelişim sonrası negatif basınca maruz kalmaması için sıvı basınçlandırma odasını her zaman bu şekilde tutmalı ve asla şu şekilde tutmamalısınız. Bu teknik, nörobilim alanındaki araştırmacıların, kontrollü basınçlandırma koşulları altında travmatik beyin hasarının hücresel mekanizmasını incelemelerinin yolunu açmıştır. Army UNL Center for Trauma Mechanics'ten sağlanan finansal destek için teşekkür ederiz.