Sivrisinek Fonksiyonel Analiz için Kalsiyum Biyoparlaklık Testi ( Aedes aegypti) Ve Tick ( Rhipicephalus Microplus) G Protein-çiftli Reseptörler

Aşağıdaki deneyin genel amacı, sentezlenen eklembacaklı nöropeptidlerinin ilgili gpcr üzerindeki yapı-aktivite ilişkilerini analiz etmektir. Bu işlem, öncelikle istenen G PCR R ekspresyon vektörü ile Çin hamster yumurtalık (CHO), K one boş hücrelerinin transfekte edilmesiyle tek bir hücreden türetilmiş stabil transformasyonlu hücre hatları elde edilerek gerçekleştirilir; ikinci adımda, stabil hücre hattı, kalsiyum biyolüminesans plaka analizinde hücre içi biyolüminesansı ölçmek için reporter Gina Quaran taşıyan quaran plazmidi ile transfekte edilir. Ardından, bu rekombinant hücrelere peptit ligand uygulaması sonrası sitoplazmik kalsiyum seviyelerini belirlemek amacıyla kalsiyum biyolüminesans plaka analizi gerçekleştirilir.

Plaka analizindeki raporlayıcı bir korrin tarafından tespit edilen uyarılmış hücre içi kalsiyum salınımına dayanarak, rekombinant hücrelere yapısal olarak farklı peptidlerin veya farklı peptid konsantrasyonlarının uygulanması üzerine biyolüminesans birimlerinde farklılıklar olduğunu gösteren sonuçlar elde edilir. Rekombinant GPCR'lar eksprese eden stabil olarak transforme edilmiş klonal hücre hatlarını kullanmanın, trendler ve ekspresyon protokollerine kıyasla temel avantajı, reseptör ekspresyon seviyelerinin daha üniform olması, böylece tutarlılık ve sonuçlar sağlanmasıdır. Ayrıca, akvaryum proteininin mitokondriye hedeflenmesi, biyolüminesans yoluyla hassas kalsiyum ölçümlerine olanak tanır; bugünkü deneyi laboratuvarımdan iki lisansüstü öğrenci olan Lie ve Simon Kersch ile bir doktora sonrası araştırmacı gerçekleştirecektir.

Stabil hücre hatları oluşturmak için, öncelikle Chinese hamster ovary, K one boş hücrelerini 37 °C'de, %5 karbon dioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde büyüterek başlayın. Hücreler sağlıklı bir şekilde büyüdükten sonra, boş hücreleri 1x antibiyotik antimikotik içeren büyüme ortamında muhafaza edin. Chinese hamster ovary K one hücrelerini T 25 doku kültürü flasklarına aktarın ve hücreler yaklaşık %30 konfluans düzeyine ulaşana kadar antibiyotiksiz büyüme ortamında gece boyunca büyümeye bırakın.

Transfeksiyondan önce, yazılı protokolde açıklandığı şekilde ilgilenilen GPCR'yi içeren bir DNA ekspresyon vektörü hazırlayın. DNA'yı 100 µL Optum düşük serumlu ortam ile birleştirin.

Altı µL lipofeksiyon reaktifini 100 µL serumsuz F 12 K besiyerine ekleyip karıştırın ve oda sıcaklığında 30 ila 45 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, DNA ve lipofeksiyon çözeltilerini damla damla ekleyerek nazikçe karıştırın. Karışımı 15 mL'lik bir tüp içerisinde oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika bekletin.

Transfeksiyon karışımını, damla damla yöntemle 1.8 milliliters taze F 12 K besiyerine nazikçe karıştırın. Ardından hücreleri PBS ile yıkayın ve bu yeni transfeksiyon solüsyonunu hücrelere ekleyin. 18 saatlik inkübasyonun ardından.

Besiyerini, antibiyotik içermeyen %10 FBS eklenmiş F 12 K besiyeri ile değiştirin ve ertesi güne kadar gece boyunca inkübe edin. Yazılı prosedürde açıklandığı gibi, hücreleri antibiyotik içermeyen %10 FBS eklenmiş F 12 K besiyeri kullanarak iki adet T 25 flask'a bölün. 18 saat daha inkübe edin.

Besiyerini seçici besiyeri ile değiştirin. Ardından, hücreleri seçici besiyeri kullanarak üç ila dört hafta boyunca kültüre edin. Bu işlem, plazmidi genomik DNA'larına stabil bir şekilde entegre etmiş hücrelerin seçilmesini sağlayacaktır.

Hücreleri bakım besiyeri kullanarak sürdürmeye devam edin; beklenmedik bir kontaminasyon durumunda kayıpları önlemek için hücre hatlarını periyodik olarak dondurun. Klonal hücre hatlarını seçmek için, önce yazılı protokolde açıklandığı gibi hücreleri tripsinize edin ve bakım besiyeri ile santrifüjleyin. Ardından hücreleri beş mililitre bakım besiyeri içinde yeniden süspande edin.

Hücre süspansiyonundan 0,5 milliliters alın ve 10 kat dilüsyon yapmak için 4,5 milliliters taze bakım besiyeri ekleyin; ardından tek hücre seçimi yapmak için 10 kat dilüsyonun 100 microliters kısmını bir 96 kuyucuklu plakanın 12 kuyucuğuna aktarın. Teorik olarak 100 microliters başına tek bir hücre içeren nihai bir süspansiyon elde edene kadar, bu hücrelerin 10 katlık seri dilüsyonlarını yaklaşık 19 kez yapmaya devam edin ve her seri dilüsyonun 100 microliters kısmını bir 96 kuyucuklu plakanın 12 kuyucuğuna aktarın. 18 saatlik inkübasyonun ardından, 96 kuyucuklu plakaları ters ışık veya floresan mikroskobu altında inceleyin ve yalnızca tek bir hücre veya belirgin şekilde tek bir hücreden bölünmüş iki hücre içerdiği görülen kuyucukları işaretleyin.

Besiyerini her üç günde bir değiştirerek plakları her gün gözlemleyin. Hücrelerin yaklaşık %80 konfluens düzeyine ulaşana kadar bir hafta boyunca büyümesine izin verin. Ardından, işaretli kuyucukları 200 µL PBS ve tripsin ile durulayın.

Üzerlerine 100 µL PBS tripsin EDTA çözeltisi ekleyin. PBS TRİPSİN EDTA çözeltisini uzaklaştırın. 100 µL bakım ortamı ekleyin ve işaretlenmiş her kuyudaki hücreleri, bir mililitre bakım ortamı içeren altı kuyucuklu bir plakanın tek bir kuyusuna aktarın.

Hücreleri altı kuyucuklu plakada üç gün boyunca büyüttükten sonra, hücreleri ayrı T 25 flasklara aktarın. Hücrelerin tutarlılığı bozulursa geri çağrılabilmeleri için hücre hattını periyodik olarak dondurun. En yüksek yanıta sahip olan hücre hattını belirlemek için, aktarılan hücreleri reseptör, peptid, ligand veya diğer pozitif kontrol agonist gibi aktif bir ligand kullanarak kalsiyum biyolüminesans testi ile analiz edin.

Kalsiyum biyolüminesans analizi bu videonun ilerleyen bölümlerinde ayrıntılı olarak gösterilecektir. Deneye geçmeden önce tek hücre seçimini ikinci kez gerçekleştirin. Analizler için klonal hücre hatları seçildiğinde ve kültürde tutulduğunda, pasaj numaralarının takibi kritik öneme sahiptir çünkü yüksek pasaj sayılı hücreler T 25 flask içinde performans göstermeyi bırakabilir.

İstenen reseptörü eksprese eden brüt hücre hatlarını bakım ortamında yaklaşık %90 konfluense kadar büyütün. Hücreleri trypsine tabi tutup santrifüjledikten sonra onları bakım ortamında resüspanse edin, hücreleri bakım ortamı ile yaklaşık 10 kat seyreltin ve bir hemositometre ile hücre sayısını belirleyin. Ardından hücre sayısını mililitre başına yaklaşık 2 x 10⁵ hücreye ayarlayın; altı kuyucuklu bir plakadaki her bir kuyucuğa iki mililitre hücre ekleyin ve plakayı 24 saat boyunca inkübe edin; bu sürenin sonunda, kalsiyum biyolüminesans plaka testi başlamadan önce hücreler yaklaşık %60 konfluense ulaşmış olmalıdır.

Ekspresyon vektör konstrüktünde ilgilenilen raporlayıcı geni hazırlayın. Burada, mitokondrilerde eksprese edilen bir kuorum raporlayıcısı kullanılmıştır. Ardından, yazılı protokolde açıklandığı şekilde hücreleri bu raporlayıcı plazmidin bir mikrogramı ile transfekte edin.

Hücreleri altı kuyucuklu bir plakada 24 saat inkübe ettikten sonra tripsinize edin, santrifüjleyin ve yeniden süspande edin; hücre sayısını mililitrede 400.000 hücre olacak şekilde ayarlayın ve beyaz, ince tabanlı 96 kuyucuklu bir mikro titer plakasının her bir kuyucuğuna 100 µL aktarın; yaklaşık %80 konfluens sağlanana kadar 24 saat daha inkübe edin. Bu, biyolüminesans analizi için optimal hücre konsantrasyonudur. Sonraki adımlar karanlıkta gerçekleştirilmelidir ancak burada aydınlıkta gösterilmiştir.

Gösterim amaçlı olarak, kaynak başına 90 µL için beş µM CHO terezin içeren yeterli miktarda kalsiyumsuz DME medyumu hazırlayın. Plakadaki eski medyumu uzaklaştırın ve her kuyuya 90 µL ekleyin. Plakaları karanlıkta, 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında üç saat boyunca inkübe edin; bu sürenin sonunda hücreler test edilmeye hazır olacaktır.

Bu demonstrasyon, biyolüminesans modundaki bir Nova star plaka okuyucu kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Temizleme işlemine başlamak için, makine pompaları karanlık ortamdayken plaka tutucuya yerleştirilmelidir. Peptitleri 1,5 mililitrelik bir EOR tüpünde çözünür hale getirin.

Kuyu başına 10 x peptidden 10 µL için yeterli kalsiyumsuz DME ve medya kullanın. Kullanımdan önce peptid çözeltisinin aspirasyon derinliğini ve konum belirlemesini ayarlayın. Hücreleri 10 µL peptid ile uyarın ve ışık emisyonunu kaydetmeye hemen başlayın.

Bu gösterimde cihaz, her bir kuyucuk için toplam 50 saniye boyunca, her iki saniyede bir 465 nanometre dalga boyundaki ışık emisyonunu kaydedecek şekilde ayarlanmıştır. Çalışma tamamlandıktan sonra makine pompalarını yıkayın. İşlemi her bir peptit örneği için tekrarlayın, verileri kaydedin ve analiz sonrası makine pompalarını tekrar yıkayın.

Her kuyucuktan elde edilen ışık emisyon verileri, yazılım programı aracılığıyla otomatik olarak bir Microsoft Excel veri sayfasına aktarılır. Verileri Excel'den Prism Yazılımı 4.0'a yapıştırın. X ekseninde çeşitli peptit konsantrasyonlarının ve biolüminesans birimlerinin yer aldığı bir grafik oluşturun.

Y ekseninde, her bir peptit için konsantrasyon yanıt eğrileri ve bunlara karşılık gelen EC 50 değerlerini elde etmek amacıyla doğrusal olmayan regresyon eğri uyum analizini seçin. Veri analizi için her deney üç kez tekrarlanmalıdır. Çin hamster yumurtalığı (CHO), K1 hücrelerinde eksprese edildiğinde, Aedes aegypti sivrisineğinden gelen kinin reseptörü çoklu ligand reseptörü gibi davranmış ve 1 nM kadar düşük konsantrasyonlara fonksiyonel yanıt vermiştir.

Kalsiyum biyolüminesans plaka testi kullanılarak tek tek test edilen üç endojen Rhipicephalus microplus kinini için; Rhipicephalus microplus kinin 3 için yaklaşık 16 nanomolar, Rhipicephalus microplus kinin 2 için 26 nanomolar ve Rhipicephalus microplus kinin 1 için 49 nanomolar şeklinde istatistiksel olarak farklı EC 50 değerleri belirlenmiş olup, bu durum en güçlü olan Rhipicephalus microplus kinin 3 ve en az güçlü olan Rhipicephalus microplus kinin 1 şeklinde bir etkinlik sıralamasıyla sonuçlanmıştır. Burada, altı alfa-aminoizobütirik asit kinin analoğunun, kene kinin reseptörü eksprese eden Çin hamster yumurtalığı (CHO) K1 hücre hattı üzerindeki aktivite karşılaştırması kalsiyum biyolüminesans plaka testi ile sunulmuştur.

Y ekseni, her bir analog için gözlemlenen biyolüminesans konsantrasyonunun, test edilen tüm konsantrasyonlarda gözlemlenen maksimum yanıta oranı olarak ifade edilen yüzde maksimum biyolüminesans birimlerini temsil etmektedir; KININE HEXA peptid F-F-F-S-W-G amit, reseptör aktivitesi için pozitif kontroldür. Tekli değişim kinine analoğu olan double F amino izobütirik asit WG amit, pozitif kontrol HEXA peptid KININE analoğundan daha aktifti; iki aminobütirik asit değişimi içeren KININE analoğu, aminobütirik asit FF aminobütirik asit WG amit ise test edilen çift değişim analogları arasında en güçlü olanıydı. Bu videoyu izledikten sonra, A-G-P-C-R'yi nasıl ifade edeceğiniz ve kalsiyum biyolüminesans testi ile ligandların reseptörler üzerindeki yapı-aktivite ilişkilerini analiz etmek için nasıl klonal hücre hatları elde edeceğiniz konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.