Name: Sivrisinek Fonksiyonel Analiz için Kalsiyum Biyoparlaklık Testi ( Aedes aegypti) Ve Tick ( Rhipicephalus Microplus) G Protein-çiftli Reseptörler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-20T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Öğrenin kalsiyum biyoparlaklık testi ile Aedes aegypti ve Rhipicephalus microplus GPCR'lerinin fonksiyonel analizini. Bu yöntem, neuropeptid-reseptör etkileşimlerini ve ilaç keşfini destekler.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dr. CJP Grimmelikhuijzen Kopenhag Üniversitesi (Danimarka) ve Michael Williamson aequorin plazmid sağlamak için takdir edilmektedir. Bizim işbirlikçi ARS-USDA (Teksas, ABD), Dr. Ronald J. Nachman, peptid sentezi ve Novostar plaka okuyucu sağlamak için kabul edilmektedir.

1. Kararlı hücre hatları kurulması <ol><li> Ilgi GPCR Clone ve memeli bir sistemi en iyi şekilde ribozomal bağlanma (Kozak, 1986) için başlangıç ​​kodon etrafında 5 'Kozak konsensüs dizisi (GCCA / GCCATGG) içeren bir ifade vektör takın. Burada, sivrisinek kinin reseptör (. Pietrantonio ve ark, 2005. Holmes ve ark, 2003), kene kinin reseptörüne plazmid pcDNA3.1/Bm-KR ve plazmid pcDNA3.1/Aedae-KR kullanın. Bakteri ve memeli hücrelerinin seçimi için neomisin (G418) direnç seçimi için vektör ampisilin direnç kodlar - pcDNA3.1 (). </li><li> CHO-K1 boş hücreleri (plazmid olmadan) (ATCC, Manassas, VA, USA) veya 37 T-25 balonuna diğer istenen hücre hattı (BD Falcon) ° C,% 5 CO 2 nemlendirilmiş inkübatör (Holmes ve ark büyütün , 2003). Aksi belirtilmediği sürece Tüm bu koşullar altında daha fazla inkubasyon yapılmalıdır. Büyüme ortamında boş hücreleri (% 10 fetal sığır serumu ile F12K orta) koruyun 1X Antibiyotik antimikotik (Invitrogen, CA). </li><li> Hücreleri bölmek için, 37 ° C'ye kadar tüm çözümler ısınmak T-25 balonuna eski orta çıkarın ve 5 ml PBS ile yıkayın ve sonra PBS kaldırmak. Hücreleri trypsinize için, 2 dakika için 2 ml PBS-tripsin-EDTA (34 ml PBS, 2 ml% 7.5 sodyum bikarbonat, 4 ml 10X tripsin-EDTA) ekleyin. 3 ml besiyeri ekleyin ve hücrelerin karışımı, orta ve aşağı yukarı aspirat. Konik bir tüp ~ 200-300 g (1.000 rpm) 2 dakika süreyle santrifüj içine hücreleri ile orta aktarın. Süpernatant atın ve 5 ml orta hücreleri yeniden askıya. Taze orta ile 01:05 ya da 01:10 'lik bir konsantrasyon yeniden süspanse hücreleri seyreltilir ve yeni bir T-25 cam şişe içinde 5 ml transferi. </li><li> Antibiyotik olmadan, hücreler (2-3 gün etrafında) sağlıklı büyüyen tohum CHO-K1 hücreler, T-25 doku kültürü şişeleri ve büyüme orta gecede büyümek sonra yaklaşık% 30 konfluent (yaklaşık 18 saat) kadar. Confluency derecesi ters floresan mikroskobu altında gözlemleyerek hücreleri tespit edilebilir. </li><li> Her bir örnek için aşağıdaki karışımlar hazırlayın: <ol><li> 100 ul Opti-MEM I Serum Orta (Invitrogen) İndirimli: 1-2 mg DNA (265μg/μl pcDNA3.1/Aedae-KR kullanımı 4μl örnek) birleştirin. </li><li> DNA Lipofectin bir 1:1 oranında, 6 ul Lipofectin Reaktif (InvitrogenTM) 100 ul F12K serum ortamın içine karıştırın. 30-45 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li></ol> Yavaşça bir damla bilge moda (toplam hacmi = 200 mcL) 1.5.1 1.5.2 ile gelen çözümleri karıştırın. 10-15 dakika oda sıcaklığında bekletin. </li><li> Hücreler eski büyüme ortamı çıkarın ve 5 ml F12K serum serbest orta hücreleri yıkayın ve ardından F12K serum serbest orta kaldırmak. 15 ml'lik bir tüp içinde, 1.8 ml taze F12K ortamın içine yavaşça bir damla bilge moda transfeksiyon karışımı karıştırın. Daha sonra, PBS ile 1.5 adım hücreler yıkanır ve hücrelerin bu yeni transfeksiyon çözüm eklemek. 18 saat inkübe edin. </li><li> F12K orta artı% 10 fetal sığır serumu ve antibiyotik olmadan gece inkübe orta değiştirin. Başka bir 18 saat için antibiyotik olmadan F12K orta artı% 10 fetal sığır serumu (bölme hücreler için lütfen adım 1.3 'e bakınız) ile iki adet T-25 şişeler içine hücreleri bölün. </li><li> Seçici besiyeri (F12K orta artı 800μg/ml GENETICIN% 10 fetal sığır serumu, Invitrogen) ile orta değiştirin. 3-4 hafta için seçici besiyeri kullanarak hücrelerin Kültür. Zamanla bu hücreler için stably kendi genomik DNA plazmid dahil seçecektir. Bakım, orta (F12K orta artı 400μg/ml GENETICIN% 10 fetal sığır serumu) kullanarak hücreleri koruyarak devam edin. Hücre hatları, beklenmedik bir kirlenme durumunda kayıpları önlemek için donma medya 1:1 oranında (% 20 DMSO ile seçici orta) ile periyodik olarak dondurun. </li><li> Klonal hücre hatları seçme: İlk adım olarak, trypsinize ve bakım ortamı ile 1.8 adım adım 1.3 olarak hücreleri santrifüj. 5 ml bakım ortamında yeniden askıya alma hücreleri, hücrenin 0.5 ml askıya almak ve 10x seyreltme yapmak için 4.5 ml taze bakım orta eklemek. Tek hücre seçmek için her bir kuyunun 100 ul ekleyerek 10x seyreltme, 96 plaka 12 kuyu içine aktarın. </li><li> 100 ul başına bir hücre (10x seri dilüsyonları toplam sayısı 19, normalde son seyreltme 10 -19 10 -11 aralığında olacak) bir final süspansiyon için bu hücrelerin 10x seri dilüsyonları yapmaya devam . Hemen her seyreltme seyreltme 100 ul, 96 plaka 12 kuyu içine aktarın. 18 saat inkübasyondan sonra, bir ters ışık veya sadece tek bir hücre içeren ya da açıkça tek bir hücre ayrılmış iki hücre içeren görünen floresan mikroskop ve işareti kuyu altında 96 kuyucuğu gözlemliyoruz. Her üç günde bir, her gün ve değişim ortamında gözlemleyerek tutun. </li><li> Kuyu% 80 confluent (yaklaşık bir hafta), 200 ul PBS ile işaretlenmiş kuyuları 100 ul PBS-tripsin-EDTA çözeltisi ile yıkayın ve onları trypsinize. Hücrelerin her biri de 1 ml bakım ortamı ile 6-plaka iyi bir içine işaretli transfer. Sonra 3 gün boyunca bu hücrelerin büyümesine bireysel T25 balona hücreleri aktarmak. Agonist peptidler (bölüm 2 bakınız) ile kalsiyum biyoparlaklık assay kullanarak bu hücrelerin test edin. </li><li> Kalsiyum biyoparlaklık plaka tayininde yüksek tepki ile adım 1.11 1 hücre hattı seçin ve ikinci kez tek bir hücre seçimi aşağıdaki adımları 1,9-1,11 gerçekleştirmek. Periyodik olarak hücre hatları dondurmak. </li><li> Adım 1.12 'de açıklanan ikincil seçim, en yüksek kalsiyum biyoparlaklık plaka tayininde tepki ile 2-3 hücre hatları seçin ve daha fazla kalsiyum biyoparlaklık plaka deneyleri için kültür onları korumak. Geçit numaraları takip edin. Zaman zaman, her zaman daha pasajlar ile hücre hatları sürekli performans bırakırsam onlara geri dönmek ve böylece erken geçişleri hücre hatları dondurma. </li></ol> 2. Kalsiyum biyoparlaklık plaka tahlil <ol><li> Bir ifade vektör ilgi muhabiri gen Arter. Burada aequorin plazmid mtAEQ/pcDNA1 (bir hediye Dr. CJP Grimmelikhuijzen ve Michael Williamson, Kopenhag Üniversitesi, Danimarka) kullanılmıştır. E. plazmid Dönüşümü coli hücreleri MC1061/PS (Invitrogen) ve QIAprep dönmeye miniprep kiti (Qiagen Inc.) kullanarak onları arındırmak. Son adım olarak EDTA, su olmadan Tris tamponu ile plazmid Zehir. </li><li> Grow bakım ortamında istenilen reseptör ifade adım 1.13 hücre hatları. Hücrelerin% 90 konfluent, trypsinize santrifüj ve ardından adım 1.3 gibi 5 ml bakım ortamda hücrelerin yeniden askıya. Sulandırınız hücreleri (bakım ortamı ile ilgili 10x) ve mikroskobunda (Bright-Line hemasitometre) ile karşı hücre hücre sayısını. Hücre sayısı yaklaşık 2 x 10 5 hücre / ml ayarlayın (9 meydanlarından birinde ortalama 20 hücre hemasitometre gösterdi). Altı plaka her kuyuya medya Tohum 2 ml seyreltilmiş hücreleri. 24 saat (hücreleri inkübasyondan sonra yaklaşık% 60 confluency ulaşmak gerekir) inkübe edin. </li><li> 6 kuyu plaka medya OPTI-MEM orta değiştirin. 4 ul FuGENE 6 Transfeksiyon reaktifi (Roche Biyokimyasallar) ile her bir iyi, bir mikrofuge'de tüp içinde 96 ul OPTI-MEM karıştırın ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin. Her tüpe 1 mcg aequorin / pcDNA 1 plazmid DNA ekleyin ve sonra yavaşça 15-20 dakika süreyle oda sıcaklığında inkübe edin, 1 dakika için örnek sallamak. Plaka hafifçe sallayarak ise damla damla bir moda her kuyuya her karışımı ekleyin. Plakalar 6 saat inkübe ve antibiyotik olmadan% 10 fetal sığır serumu içeren orta F12K ortamı değiştirmek. </li><li> Altı plaka hücrelerin 24 saat süreyle inkübe sonra, trypsinize santrifüj ve 1.3 adım olarak hücreleri yeniden askıya. Hücre sayısı 400.000 hücre / ml adım 2.1 olarak sayın ve her kuyuya 96-de beyaz ince alt mikrotitre plaka (Costar 3610) 100 ul (toplam 40.000 cells/100 ul) transfer. Yaklaşık% 80 hücre confluency kadar başka bir 24 saat süreyle inkübe edin. Bu biyoparlaklık tayini için hücrelerin optimum konsantrasyonu. </li><li> Karanlıkta 5 mcM coelenterazine (Invitrogen) içeren bir kalsiyum ücretsiz DMEM medya (Invitrogen) 90μl/well hazırlayın (coelenterazine ışığa karşı hassastır). 2.4 'ten plaka, eski medya kaldırmak ve her kuyuya bu 90μl eklemek. 37 karanlıkta 3 saat plakaları ° C'de ve plaka hücrelerin test edilmesi için hazırız sonra% 5 CO 2. </li></ol> 3. Enstrüman işlem ve veri analizi <ol><li> Her biyoparlaklık plaka okuyucusu farklıdır. Biz bioluminensence modunda Novostar (BMG Labtechnologies) plaka okuyucu kullanarak tahlil gerçekleştirin. Farklı bir araç kullanıyorsanız, protokol ayak uydurması gerekmektedir. </li><li> Kullanmadan önce plaka okuyucu pompaları (veya BAŞBAKANLIK POMPALAR) temizleyin. Plaka sahibi plaka koymadan önce oda ışığı kapatın. Plaka sahibinin kapalı sonra, ışıkları açmak. </li><li> Peptidler (1,5 ml Eppendorf tüp) kalsiyum serbest DMEM medya çözünür. "Aspire Derinlik" ve "Pozisyon Belirlenmesi" Kullanmadan önce peptid çözüm ayarlayın. Peptidler konsantrasyonları (FFFSWG-NH2, Aedes-K1-3, ya da istenen başka bir peptid) değişen 10 ul (10x) hücreleri Challenge ve ışık emisyon hemen kaydetmeye başlarsınız. Biz, toplam süre 50 saniye, her iyi, her 2 saniyede bir ışık yayma (465 nm) kayıt alet var. </li><li> Gibi etkin bir analog (analog FFFSWGa Taneja-Bageshwar ve ark, 2009, kullanılmakta olan) ve vektör sadece transfekte hücreler gibi bir negatif kontrol olarak pozitif kontrol emin olun. Negatif kontrol (temsilcisi sonuçlarını görmek), temel eşik ayarlamak için veri analizi sırasında gerekli olacaktır.Alakasız bir inaktif peptid negatif kontrol olarak da eklenebilir. </li><li> Run tamamlandıktan sonra, cihaz pompa (veya BAŞBAKANLIK POMPALAR), ardından sonraki peptid örnek yerde yıkayın. Verileri kaydetmek ve pompalar tekrar yıkayın. </li><li> Veri işleme: Her iyi bir Microsoft Excel veri sayfası ışık emisyon verileri aktarın. </li><li> Excel GraphPad Software Inc (San Diego, CA, USA) Prism yazılımının 4.0 veri yapıştırın. Çeşitli peptid konsantrasyonları X ekseni ve biyoparlaklık birimleri Y ekseni. Verileri normalleştirmek için bir günlük-yanıt eğrisi arsa. Her peptid konsantrasyon-yanıt eğrileri elde etmek için bir doğrusal olmayan regresyon eğrisi uyum analizi (değişken eğim ile sigmoidal doz-yanıt denklemi) seçin. Programı araziler sonunda değerler ve AT 50 verir. </li><li> Her deney veri analizi için üç kez tekrarlanması gerekir. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: CHO-K1 hücrelerde ifade edildiğinde, sivrisinek Aedes aegypti kinin reseptör multiligand reseptör olarak davrandığını ve işlevsel 1 nM üç endogenours Aedes kininler, Aedae kininler 1-3 gibi düşük konsantrasyonlarda yanıt, tek başına kalsiyum biyoparlaklık plaka assay kullanılarak test . Aedae-K-elde potens sıralaması Aedae-K-3, 16.04 nM ilgili EC 50 değerleri dayalı Aedae-K-3&gt; Aedae-K-2&gt; Aedae-K-1, Şekil 1'de görüldüğü istatistiksel olarak (Pietrantonio ve ark, 2005) (p &lt;0.05) anlamlı derecede farklı idi 2, 26.6 nM ve Aedae-K-1, 48.85 nM. Ayrıca kinin artıkları kinin peptid-reseptör etkileşimi için kritik olduğunu belirlemek için bu testte kullanılır. Böcek kinin peptidlerin, çekirdek olarak da bilinen biyolojik aktivite için gerekli asgari sıra temsil eden bir C-terminal Pentapeptid paylaşıyoruz. Tablo 1'de, kinin peptid çekirdek analogları çekirdekli kinin Pentapeptid FFSWGa bir Alanin yedek serisi olarak sentezlenmiş ve kalsiyum biyoparlaklık plaka assay (Taneja-Bageshwar ve ark, 2006) tarafından test edilmiş. Biz amino asitler Phe 1 ve Trp 4, her iki reseptörlerine böcek kininler faaliyet için gerekli olduğu bulundu. Tahlil de, gelişmiş biostability için tasarlanmış peptidler test etmek için kullanılabilir. Tablo 2 kene rekombinant kinin reseptörü ve Şekil 2 test izobütirik amino asit (Aib) içeren tasarlanmış kinin analogları bir kalsiyum CHO-K1 hücre hattı ifade eden kene kinin reseptör alfa-amino altı izobütirik asit analogları faaliyet karşılaştırma gösterir biyoparlaklık plaka assay (Taneja-Bageshwar ve ark, 2009). Hexapeptid analog FFFSWGa reseptör aktivitesi için bir pozitif kontrol için eklenir. Analog FF [Aib] WGA, bu Hexapeptid kontrol analog daha aktif sonuçlandı. Iki aminoisobutyric asit değiştirmeleri, [Aib] FF [Aib] WGA, analog test (Tablo 2 ve Şekil 2) çift değiştirme analogları en güçlü oldu. Bu testte olmuştur ve Nahman ve Pietantonio (2010), Nachman ark uygulanabilir nasıl daha fazla örnek için. (2009), Taneja-Bageshwar ve ark. (2008a), ve Taneja-Bageshwar ve ark. (2008b). <img src="/files/ftp_upload/2732/2732fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Aedes Tahmini kalsiyum biyoparlaklık plaka yöntemi ile CHO-K1 E10 hücreleri etkili konsantrasyonu (EC 50) kininler konsantrasyon-yanıt eğrileri y-ekseni, her biri için gözlenen maksimal yanıt bir yüzdesi olarak ifade biyoparlaklık üniteleri elde edildi peptid. Veri noktaları üç bağımsız deney sırasında elde edilen ortalama altı çoğaltır temsil eder. Barlar standart hata temsil eder. (A) Tahmini Aedae-K1 EC 50 = 48 nM. (B) Tahmini Aedae-K2 EC 50 = 26 nM. (C) Tahmini Aedae-K3 EC 50 = 16 nM. EC 50 Aedae-K3 &lt;EC 50 Aedae-K2 &lt;EC 50 Aedae-K1, p &lt;0.05. İstatistiksel analizler ve grafikler GraphPad Prism 4.0 yazılımı ile. <img src="/files/ftp_upload/2732/2732fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Bir kalsiyum biyoparlaklık plaka yöntemi ile CHO-K1 hücre hattı ifade eden kene kinin reseptör alfa-amino altı izobütirik asit analogları Faaliyet karşılaştırılması. Y ekseni bir konsantrasyon gözlenen biyoparlaklık bir yüzdesi olarak ifade edilen her analog yüzde maksimum biyoparlaklık birimleri temsil eder her analog test edilen tüm konsantrasyonları arasında gözlenen maksimal yanıt karşı. İstatistiksel analizler ve grafikler GraphPad Prism 4.0 yazılımı ile yapıldı. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="2"> Reseptör hücre hattı işaretleyin </td><td colspan="2"> Sivrisinek reseptör hücre hattı </td></tr><td> Peptitler </td><td> EC 50 (nM) </td><td> 1 mM Maksimal biyoparlaklık yanıt </td><td> EC 50 (nM) </td><td> 1 mM Maksimal biyoparlaklık yanıt </td><tr><td> AFSWGa </td><td> Ben </td><td> Ben </td><td> Ben </td><td> Ben </td></tr><tr><td> FASWGa </td><td> 586 </td><td> 5.600 </td><td> ND </td><td> 400 </td></tr><tr><td> FFAWGa </td><td> 64 </td><td> 12.800 </td><td> 621 </td><td> 3.050 </td></tr><tr><td> FFSAGa </td><td> Ben </td><td> Ben </td><td> Ben </td><td> Ben </td></tr><tr><td> FFSWAa </td><td> 417 </td><td> 10.600 </td><td> 2.800 </td><td> 1.830 </td></tr><tr><td> FFSWGa </td><td> 590 </td><td> 10.800 </td><td> ND </td><td> 525 </td></tr><tr><td> FSWGa </td><td> Ben </td><td> Ben </td><td> Ben </td><td> Ben </td></tr><tr><td> FFSWa </td><td> Ben </td><td> Ben </td><td> Ben </td><td> Ben </td></tr><tr><td> FFSWG-OH </td><td> Ben </td><td> Ben </td><td> Ben </td><td> Ben </td></tr><tr><td> FFFSWGa </td><td> 259 </td><td> 13.000 </td><td> 562 </td><td> 10.000 </td></tr><tr><td> FF [Aib] WGA </td><td> 29 </td><td> 12.700 </td><td> 445 </td><td> 9.300 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Tahmini potenslerine (EC 50) ve maksimal biyoparlaklık yanıt kene ve sivrisinek reseptör transfekte hücre hatları üzerinde test edilen tüm peptidlerin *. * EC 50 yarım maksimum yanıt elde etmek için gerekli konsantrasyonu tahmin ediyor. I: biyoparlaklık yanıt en az 300 adet (yalnızca vektör transfekte hücreler seviyesi) ise İnaktif. A: peptid FFSWGa ilgili kalıntı alanin almıştır konumu. ND: Analog test edilmiş, ancak ya çok aktif olmayan veya düşük molarities aktif değildi, böylece EC50 tespit edilemedi. <table border="1"><tbody><tr><td> K-Aib-1 </td><td> [Aib] FF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K-Aib 2 </td><td> [Α MEF] FF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K-Aib-3 </td><td> Ac-R [Aib] FF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K-Aib-4 </td><td> Ac-R [β3F] FF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K-Aib-5 </td><td> [Aib] RFF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K-Aib-6 </td><td> [Aib-Aib Aib-Aib] RFF [Aib] WGA </td></tr></tbody></table> (Tablo 2). Kinin, amino izobütirik asit (Aib) içeren kene rekombinant kinin reseptör analogları (K ) test. AC: asetil; α Me: α metil-fenilalanin; β3F: β3-fenilalanin; a: amid.

<ol><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+5%27-noncoding+sequences+from+699+vertebrate+messenger+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs.</a> Nucleic Acids Research. 15, 8125-8148 (1987).</li>
<li>Nachman, R., Pietrantonio, P. V. Interaction of mimetic analogs of insect kinin neuropeptides with arthropod receptors. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNachman%2C+R+%22Neuropeptide+systems+as+Targets+for+Parasite+and+Pest+Control%22">Neuropeptide systems as Targets for Parasite and Pest Control</a>. Geary, T. , Landes Bioscience. Madamme Curie Library. (2010).</li>
<li>Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V., Coast, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+development+of+novel+pest+management+agents+based+upon+insect+kinin+neuropeptide+analogs%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Towards the development of novel pest management agents based upon insect kinin neuropeptide analogs.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. , 1163-11251 (2009).</li>
<li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Isaac, R. E., Coast, G. M., Zubrzak, P., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biostable+agonists+that+match+and%2For+exceed+the+activity+of+insect+kinins+on+recombinant+arthropod+GPCRs%5BTitle%5D)+AND+%22General+and+Comparative+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Biostable agonists that match and/or exceed the activity of insect kinins on recombinant arthropod GPCRs.</a> General and Comparative Endocrinology. 162, 122-128 (2009).</li>
<li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Kaczmarek, K., Zabrocki, J., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+insect+kinin+analogs+with+cis-peptide+bond%2C+type+VI-turn+motifs+identifies+optimal+stereochemistry+for+interaction+with+a+recombinant+arthropod+kinin+receptor+from+the+southern+cattle+tick+Boophilus+microplus%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Comparison of insect kinin analogs with cis-peptide bond, type VI-turn motifs identifies optimal stereochemistry for interaction with a recombinant arthropod kinin receptor from the southern cattle tick Boophilus microplus.</a> Peptides. 29, 295-301 Forthcoming.</li>
<li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Zubrzak, P., Williams, H., Reyes-Rangel, G., Juaristi, E., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+selective+and+non-selective%2C+biostable+beta-amino+acid+agonists+of+recombinant+insect+kinin+receptors+from+the+southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+and+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Identification of selective and non-selective, biostable beta-amino acid agonists of recombinant insect kinin receptors from the southern cattle tick Boophilus microplus and mosquito Aedes aegypti.</a> Peptides. 29, 302-309 Forthcoming.</li>
<li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Zubrzak, P., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+structure-activity+analysis+of+insect+kinin+core+analogs+on+recombinant+kinin+receptors+drom+southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+%28Acari%3A+Ixodidae%29+and+mosquito+Aedes+aegypti+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Insect+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Comparative structure-activity analysis of insect kinin core analogs on recombinant kinin receptors drom southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) and mosquito Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 62, 128-140 (2006).</li>
<li>Pietrantonio, P. V., Jagge, C., Taneja-Bageshwar, S., Nachman, R. J., Barhoumi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mosquito+Aedes+aegypti+%28L.%29+leucokinin+receptor+is+a+multiligand+receptor+for+the+three+Aedes+kinins%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is a multiligand receptor for the three Aedes kinins.</a> Insect Molecular Biology. 14, 55-67 (2005).</li>
<li>Holmes, S. P., Barhoumi, R., Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+a+G+protein-coupled+receptor+from+the+Southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+%28Acari%3A+Ixodidae%29+identifies+it+as+the+first+arthropod+myokinin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of a G protein-coupled receptor from the Southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) identifies it as the first arthropod myokinin receptor.</a> Insect Molecular Biology. 12, 27-38 (2003).</li>
<li>Staubli, F., Jorgensen, T. J. D., Cazzamali, G., Williamson, M., Lenz, C., Sondergaard, L., Roepstorff, P., Grimmelikhuijzen, C. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identification+of+the+insect+adipokinetic+hormone+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Molecular identification of the insect adipokinetic hormone receptors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 99, 3446-3451 (2002).</li>
<li>Stables, J., Green, A., Marshall, F., Fraser, N., Knight, E., Sautel, M., Milligan, G., Lee, M., Rees, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioluminescent+assay+for+agonist+activity+at+potentially+any+G-protein+coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A bioluminescent assay for agonist activity at potentially any G-protein coupled receptor.</a> Analytical Biochemistry. 252, 115-126 (1997).</li>
</ol>

Biz bu protokolü kullanarak, Arachnida (keneler, kene ve örümceklere), kene kinin reseptör keşfedilen ilk nöropeptid reseptör fonksiyonel karakterizasyonu yapabilecektir. Bu yöntem, üç temel uygulamalar vardır. İlk olarak, teknik ligand aktivite ölçümleri ile reseptör deorphanization için uygulanabilir. İkincisi, tahlil ligand-reseptör yapı-aktivite ilişkileri (SAR) çözebilirsiniz. Üçüncü olarak, ilaç keşfi yöntemleri kullanılabilir. Ayrıca, bu protokol, hemen hemen her GPCR agonistleri veya antagonistleri faaliyet çalışma kullanılabilir. Biz küçük kütüphanelerin tarama için bu protokolü adapte başlıyor. Kullanılan hücre hattı, her yerde G proteini G 16 ifade etmez . Biz bunu gerek yoktu, çünkü Gq protein ve hücre içi kalsiyum kaskad ile eklembacaklıların kinin reseptörleri, sinyal ve burada gösterildiği gibi memeli hücrelerinde bu sinyalizasyon özellikleri korumak.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td><td></td></tr><tr><td> CHO-K1 hücreleri </td><td> ATCC </td><td> CCL-61 </td><td> Manassas, VA, Amerika Birleşik Devletleri </td></tr><tr><td> F12K orta </td><td> Invitrogen </td><td> 21127 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0643 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsin-EDTA (10x) </td><td> Invitrogen </td><td> 15400 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiyotik-antimikotik </td><td> Invitrogen </td><td> 15240 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM İndirgenmiş Serum Orta </td><td> Invitrogen </td><td> 31985 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectin Reaktif </td><td> Invitrogen </td><td> 18292-011 </td><td></td></tr><tr><td> GENETICIN </td><td> Invitrogen </td><td> 10131035 </td><td></td></tr><tr><td> MC1061/P3 Ultracomp </td><td> Invitrogen </td><td> C663-03 </td><td></td></tr><tr><td> QIAprep dönmeye miniprep kiti </td><td> Qiagen Inc. </td><td> 19064 </td><td></td></tr><tr><td> FuGENE 6 Transfeksiyon reaktif </td><td> Roche </td><td> 11 814 443 001 </td><td></td></tr><tr><td> 96-well beyaz ince alt microtitere plaka </td><td> Costar </td><td> 3610 </td><td></td></tr><tr><td> kalsiyum ücretsiz DMEM medya </td><td> Invitrogen </td><td> 21068 </td><td></td></tr><tr><td> Coelenterazine </td><td> Invitrogen </td><td> C-2944 </td><td></td></tr><tr><td> Parlak Hattı hemasitometre </td><td> Hausser Bilimsel </td><td></td><td> Horsham </td></tr><tr><td> Novostar </td><td> BMG Labtechnologies </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Prism yazılımının 4.0 </td><td> GraphPad Software Inc. </td><td></td><td> San Diego, CA, USA </td></tr><tr><td> T-25 ve T-75 şişeler </td><td> BD Falcon </td><td> 353.014 ve 353.135 </td><td></td></tr></tbody></table>

sivrisinek fonksiyonel analiz için kalsiyum biyoparlaklık testi ( aedes aegypti) ve tick ( rhipicephalus microplus) g protein-çiftli reseptörler

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

Arthropod hormon reseptörleri birçok temel fizyolojik ve davranışsal süreçleri düzenleyen roman pestisitler için potansiyel hedefler. Bunların büyük çoğunluğu G-protein reseptörler (GPCRs) süperailesinin aittir. Biz kene ve sivrisinek eklembacaklı kinin reseptörleri karakterize odaklanmıştır. Eklembacaklılar kininler myotropic, idrar söktürücü ve nörotransmiter fonksiyon ile çok fonksiyonlu nöropeptitlerin. Burada, iki heterolog kinin böcek kininler yapı-aktivite ilişkileri sistematik analizi için bir yöntem reseptör ifade sistemleri açıklanmıştır. Biz, idrar söktürücü, myotropic ve / veya kene ve sivrisinek sindirim süreçleri bozmaya potansiyeline sahip biostable kinin analogları gelişimi ile ilgili önemli bilgiler sağlar. Güney sığır kene, Boophilus Microplus (Canestrini) ve sivrisinek Aedes aegypti (Linnaeus), kinin reseptörleri stably memeli hücre hattı CHO-K1 ifade edildi. Bu reseptörlerin fonksiyonel analizleri, hücre içi biyoparlaklık peptid başvurusu üzerine bu rekombinant hücrelerin sitoplazmik kalsiyum seviyelerini belirlemek için önlemler kalsiyum biyoparlaklık plaka assay kullanılarak tamamlandı. Bu yöntem aequorin protein, Işıklı denizanası izole bir photoprotein yararlanır. Biz geçici stably kinin reseptörleri ifade hücre hatları plazmid aequorin (mtAEQ/pcDNA1) transfekte. Bu hücreler daha sonra hücre içi aequorin ile kompleksleri kofaktör coelenterazine ile tedavi edildi. Bu bağ, kalsiyum varlığında kalsiyum konsantrasyonu göstergesidir lüminesans seviyeleri yayan kırar. Kinin reseptör hücre içi kalsiyum salınımı yoluyla sinyalleri olarak, sinyal yoğunluğu peptid potens ile ilgili. Bu protokol, daha önce açıklanan birkaç değişiklik ile protokolleri bir sentezidir. GPCRs kararlı ifade, fonksiyonel plaka testlerinin (Staubly ve ark, 2002 ve Ahırlar ve ark, 1997 ile bir memeli hücre hattı için adım adım talimatlar .) Bu metodoloji kullanarak, sivrisinek ve kene kinin reseptörleri ifade istikrarlı hücre hatları kurmayı başardık, üç sivrisinek kininler potens karşılaştırmak, ligand-reseptör etkileşimi için kritik amino asit pozisyonları belirlemek ve bir peptit üretilen yarı-tarama gerçekleştirmek kütüphanesi. Böcek kininler endojen peptidazlar hızlı enzimatik bozulmaya karşı duyarlı olduğundan, ciddi haşere kontrolü ya da endokrinolojik çalışmalar için bir araç olarak kullanımı sınırlıdır. Bu nedenle, biz de kendi gücü ve biostability geliştirmek için amino izobütirik asit (Aib) içeren kinin analogları test. Bu peptidaz dayanıklı analog biostable böcek kinin analogları gelişiminde önemli bir kurşun temsil eder ve nöropeptid tabanlı eklembacaklıların kontrol stratejilerinin geliştirilmesine yardımcı olabilir.

Bu protokol klonal hücre hattı seçimi ve onların cognate GPCRs sentezlenmiş eklembacaklı nöropeptidlerin yapı-aktivite ilişkileri analiz etmek için bir kalsiyum biyoparlaklık tahlil için yönergeler sağlar. Bu testte, sentetik analog tasarım ve peptid / kurşun ilaç keşfi için reseptör deorphanization ve yapı-aktivite ilişkileri çalışmaları için kullanılabilir.

Sivrisinek Fonksiyonel Analiz için Kalsiyum Biyoparlaklık Testi ( Aedes aegypti) Ve Tick ( Rhipicephalus Microplus) G Protein-çiftli Reseptörler

Eklem bacaklı hormon reseptörleri, birçok temel fizyolojik ve davranışsal süreci düzenledikleri için yeni pestisitler için potansiyel hedeflerdir. ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, sentezlenen eklembacaklı nöropeptidlerinin ilgili gpcr üzerindeki yapı-aktivite ilişkilerini analiz etmektir. Bu işlem, öncelikle istenen G PCR R ekspresyon vektörü ile Çin hamster yumurtalık (CHO), K one boş hücrelerinin transfekte edilmesiyle tek bir hücreden türetilmiş stabil transformasyonlu hücre hatları elde edilerek gerçekleştirilir; ikinci adımda, stabil hücre hattı, kalsiyum biyolüminesans plaka analizinde hücre içi biyolüminesansı ölçmek için reporter Gina Quaran taşıyan quaran plazmidi ile transfekte edilir. Ardından, bu rekombinant hücrelere peptit ligand uygulaması sonrası sitoplazmik kalsiyum seviyelerini belirlemek amacıyla kalsiyum biyolüminesans plaka analizi gerçekleştirilir.Plaka analizindeki raporlayıcı bir korrin tarafından tespit edilen uyarılmış hücre içi kalsiyum salınımına dayanarak, rekombinant hücrelere yapısal olarak farklı peptidlerin veya farklı peptid konsantrasyonlarının uygulanması üzerine biyolüminesans birimlerinde farklılıklar olduğunu gösteren sonuçlar elde edilir. Rekombinant GPCR'lar eksprese eden stabil olarak transforme edilmiş klonal hücre hatlarını kullanmanın, trendler ve ekspresyon protokollerine kıyasla temel avantajı, reseptör ekspresyon seviyelerinin daha üniform olması, böylece tutarlılık ve sonuçlar sağlanmasıdır. Ayrıca, akvaryum proteininin mitokondriye hedeflenmesi, biyolüminesans yoluyla hassas kalsiyum ölçümlerine olanak tanır; bugünkü deneyi laboratuvarımdan iki lisansüstü öğrenci olan Lie ve Simon Kersch ile bir doktora sonrası araştırmacı gerçekleştirecektir.Stabil hücre hatları oluşturmak için, öncelikle Chinese hamster ovary, K one boş hücrelerini 37 °C'de, %5 karbon dioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde büyüterek başlayın. Hücreler sağlıklı bir şekilde büyüdükten sonra, boş hücreleri 1x antibiyotik antimikotik içeren büyüme ortamında muhafaza edin. Chinese hamster ovary K one hücrelerini T 25 doku kültürü flasklarına aktarın ve hücreler yaklaşık %30 konfluans düzeyine ulaşana kadar antibiyotiksiz büyüme ortamında gece boyunca büyümeye bırakın.Transfeksiyondan önce, yazılı protokolde açıklandığı şekilde ilgilenilen GPCR'yi içeren bir DNA ekspresyon vektörü hazırlayın. DNA'yı 100 µL Optum düşük serumlu ortam ile birleştirin.Altı µL lipofeksiyon reaktifini 100 µL serumsuz F 12 K besiyerine ekleyip karıştırın ve oda sıcaklığında 30 ila 45 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, DNA ve lipofeksiyon çözeltilerini damla damla ekleyerek nazikçe karıştırın. Karışımı 15 mL'lik bir tüp içerisinde oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika bekletin.Transfeksiyon karışımını, damla damla yöntemle 1.8 milliliters taze F 12 K besiyerine nazikçe karıştırın. Ardından hücreleri PBS ile yıkayın ve bu yeni transfeksiyon solüsyonunu hücrelere ekleyin. 18 saatlik inkübasyonun ardından.Besiyerini, antibiyotik içermeyen %10 FBS eklenmiş F 12 K besiyeri ile değiştirin ve ertesi güne kadar gece boyunca inkübe edin. Yazılı prosedürde açıklandığı gibi, hücreleri antibiyotik içermeyen %10 FBS eklenmiş F 12 K besiyeri kullanarak iki adet T 25 flask'a bölün. 18 saat daha inkübe edin.Besiyerini seçici besiyeri ile değiştirin. Ardından, hücreleri seçici besiyeri kullanarak üç ila dört hafta boyunca kültüre edin. Bu işlem, plazmidi genomik DNA'larına stabil bir şekilde entegre etmiş hücrelerin seçilmesini sağlayacaktır.Hücreleri bakım besiyeri kullanarak sürdürmeye devam edin; beklenmedik bir kontaminasyon durumunda kayıpları önlemek için hücre hatlarını periyodik olarak dondurun. Klonal hücre hatlarını seçmek için, önce yazılı protokolde açıklandığı gibi hücreleri tripsinize edin ve bakım besiyeri ile santrifüjleyin. Ardından hücreleri beş mililitre bakım besiyeri içinde yeniden süspande edin.Hücre süspansiyonundan 0,5 milliliters alın ve 10 kat dilüsyon yapmak için 4,5 milliliters taze bakım besiyeri ekleyin; ardından tek hücre seçimi yapmak için 10 kat dilüsyonun 100 microliters kısmını bir 96 kuyucuklu plakanın 12 kuyucuğuna aktarın. Teorik olarak 100 microliters başına tek bir hücre içeren nihai bir süspansiyon elde edene kadar, bu hücrelerin 10 katlık seri dilüsyonlarını yaklaşık 19 kez yapmaya devam edin ve her seri dilüsyonun 100 microliters kısmını bir 96 kuyucuklu plakanın 12 kuyucuğuna aktarın. 18 saatlik inkübasyonun ardından, 96 kuyucuklu plakaları ters ışık veya floresan mikroskobu altında inceleyin ve yalnızca tek bir hücre veya belirgin şekilde tek bir hücreden bölünmüş iki hücre içerdiği görülen kuyucukları işaretleyin.Besiyerini her üç günde bir değiştirerek plakları her gün gözlemleyin. Hücrelerin yaklaşık %80 konfluens düzeyine ulaşana kadar bir hafta boyunca büyümesine izin verin. Ardından, işaretli kuyucukları 200 µL PBS ve tripsin ile durulayın.Üzerlerine 100 µL PBS tripsin EDTA çözeltisi ekleyin. PBS TRİPSİN EDTA çözeltisini uzaklaştırın. 100 µL bakım ortamı ekleyin ve işaretlenmiş her kuyudaki hücreleri, bir mililitre bakım ortamı içeren altı kuyucuklu bir plakanın tek bir kuyusuna aktarın.Hücreleri altı kuyucuklu plakada üç gün boyunca büyüttükten sonra, hücreleri ayrı T 25 flasklara aktarın. Hücrelerin tutarlılığı bozulursa geri çağrılabilmeleri için hücre hattını periyodik olarak dondurun. En yüksek yanıta sahip olan hücre hattını belirlemek için, aktarılan hücreleri reseptör, peptid, ligand veya diğer pozitif kontrol agonist gibi aktif bir ligand kullanarak kalsiyum biyolüminesans testi ile analiz edin.Kalsiyum biyolüminesans analizi bu videonun ilerleyen bölümlerinde ayrıntılı olarak gösterilecektir. Deneye geçmeden önce tek hücre seçimini ikinci kez gerçekleştirin. Analizler için klonal hücre hatları seçildiğinde ve kültürde tutulduğunda, pasaj numaralarının takibi kritik öneme sahiptir çünkü yüksek pasaj sayılı hücreler T 25 flask içinde performans göstermeyi bırakabilir.İstenen reseptörü eksprese eden brüt hücre hatlarını bakım ortamında yaklaşık %90 konfluense kadar büyütün. Hücreleri trypsine tabi tutup santrifüjledikten sonra onları bakım ortamında resüspanse edin, hücreleri bakım ortamı ile yaklaşık 10 kat seyreltin ve bir hemositometre ile hücre sayısını belirleyin. Ardından hücre sayısını mililitre başına yaklaşık 2 x 10⁵ hücreye ayarlayın; altı kuyucuklu bir plakadaki her bir kuyucuğa iki mililitre hücre ekleyin ve plakayı 24 saat boyunca inkübe edin; bu sürenin sonunda, kalsiyum biyolüminesans plaka testi başlamadan önce hücreler yaklaşık %60 konfluense ulaşmış olmalıdır.Ekspresyon vektör konstrüktünde ilgilenilen raporlayıcı geni hazırlayın. Burada, mitokondrilerde eksprese edilen bir kuorum raporlayıcısı kullanılmıştır. Ardından, yazılı protokolde açıklandığı şekilde hücreleri bu raporlayıcı plazmidin bir mikrogramı ile transfekte edin.Hücreleri altı kuyucuklu bir plakada 24 saat inkübe ettikten sonra tripsinize edin, santrifüjleyin ve yeniden süspande edin; hücre sayısını mililitrede 400.000 hücre olacak şekilde ayarlayın ve beyaz, ince tabanlı 96 kuyucuklu bir mikro titer plakasının her bir kuyucuğuna 100 µL aktarın; yaklaşık %80 konfluens sağlanana kadar 24 saat daha inkübe edin. Bu, biyolüminesans analizi için optimal hücre konsantrasyonudur. Sonraki adımlar karanlıkta gerçekleştirilmelidir ancak burada aydınlıkta gösterilmiştir.Gösterim amaçlı olarak, kaynak başına 90 µL için beş µM CHO terezin içeren yeterli miktarda kalsiyumsuz DME medyumu hazırlayın. Plakadaki eski medyumu uzaklaştırın ve her kuyuya 90 µL ekleyin. Plakaları karanlıkta, 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında üç saat boyunca inkübe edin; bu sürenin sonunda hücreler test edilmeye hazır olacaktır.Bu demonstrasyon, biyolüminesans modundaki bir Nova star plaka okuyucu kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Temizleme işlemine başlamak için, makine pompaları karanlık ortamdayken plaka tutucuya yerleştirilmelidir. Peptitleri 1,5 mililitrelik bir EOR tüpünde çözünür hale getirin.Kuyu başına 10 x peptidden 10 µL için yeterli kalsiyumsuz DME ve medya kullanın. Kullanımdan önce peptid çözeltisinin aspirasyon derinliğini ve konum belirlemesini ayarlayın. Hücreleri 10 µL peptid ile uyarın ve ışık emisyonunu kaydetmeye hemen başlayın.Bu gösterimde cihaz, her bir kuyucuk için toplam 50 saniye boyunca, her iki saniyede bir 465 nanometre dalga boyundaki ışık emisyonunu kaydedecek şekilde ayarlanmıştır. Çalışma tamamlandıktan sonra makine pompalarını yıkayın. İşlemi her bir peptit örneği için tekrarlayın, verileri kaydedin ve analiz sonrası makine pompalarını tekrar yıkayın.Her kuyucuktan elde edilen ışık emisyon verileri, yazılım programı aracılığıyla otomatik olarak bir Microsoft Excel veri sayfasına aktarılır. Verileri Excel'den Prism Yazılımı 4.0'a yapıştırın. X ekseninde çeşitli peptit konsantrasyonlarının ve biolüminesans birimlerinin yer aldığı bir grafik oluşturun.Y ekseninde, her bir peptit için konsantrasyon yanıt eğrileri ve bunlara karşılık gelen EC 50 değerlerini elde etmek amacıyla doğrusal olmayan regresyon eğri uyum analizini seçin. Veri analizi için her deney üç kez tekrarlanmalıdır. Çin hamster yumurtalığı (CHO), K1 hücrelerinde eksprese edildiğinde, Aedes aegypti sivrisineğinden gelen kinin reseptörü çoklu ligand reseptörü gibi davranmış ve 1 nM kadar düşük konsantrasyonlara fonksiyonel yanıt vermiştir.Kalsiyum biyolüminesans plaka testi kullanılarak tek tek test edilen üç endojen Rhipicephalus microplus kinini için; Rhipicephalus microplus kinin 3 için yaklaşık 16 nanomolar, Rhipicephalus microplus kinin 2 için 26 nanomolar ve Rhipicephalus microplus kinin 1 için 49 nanomolar şeklinde istatistiksel olarak farklı EC 50 değerleri belirlenmiş olup, bu durum en güçlü olan Rhipicephalus microplus kinin 3 ve en az güçlü olan Rhipicephalus microplus kinin 1 şeklinde bir etkinlik sıralamasıyla sonuçlanmıştır. Burada, altı alfa-aminoizobütirik asit kinin analoğunun, kene kinin reseptörü eksprese eden Çin hamster yumurtalığı (CHO) K1 hücre hattı üzerindeki aktivite karşılaştırması kalsiyum biyolüminesans plaka testi ile sunulmuştur.Y ekseni, her bir analog için gözlemlenen biyolüminesans konsantrasyonunun, test edilen tüm konsantrasyonlarda gözlemlenen maksimum yanıta oranı olarak ifade edilen yüzde maksimum biyolüminesans birimlerini temsil etmektedir; KININE HEXA peptid F-F-F-S-W-G amit, reseptör aktivitesi için pozitif kontroldür. Tekli değişim kinine analoğu olan double F amino izobütirik asit WG amit, pozitif kontrol HEXA peptid KININE analoğundan daha aktifti; iki aminobütirik asit değişimi içeren KININE analoğu, aminobütirik asit FF aminobütirik asit WG amit ise test edilen çift değişim analogları arasında en güçlü olanıydı. Bu videoyu izledikten sonra, A-G-P-C-R'yi nasıl ifade edeceğiniz ve kalsiyum biyolüminesans testi ile ligandların reseptörler üzerindeki yapı-aktivite ilişkilerini analiz etmek için nasıl klonal hücre hatları elde edeceğiniz konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

a-calcium-bioluminescence-assay-for-functional-analysis-mosquito

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Alphavirus uyum sistemlerini kullanarak in vitro ve erişkin sivrisinek floresan gazetecilere ifade etmek için yöntemler açıklanmıştır. Bu teknik, yerine ya da ek olarak bir muhabir ilgi herhangi bir protein ifade etmek için adapte olabilir.

Alphavirus uyum Sistemi: Sivrisinek Vektörler Enfeksiyon görselleştirme için Araçlar

Kaynak: Lark, A. R., et. al., Biyolüminesan Kalsiyum İndikatörü GFP-aequorin'e Dayalı İn Vivo Fonksiyonel Beyin Görüntüleme Yaklaşımı. J. Vis. Uzm.  (2016)Bu video, Green kullanarak kalsiyum dinamiğinin gerçek zamanlı görüntülemesini göstermektedir. Drosophila'nın derin beyin yapılarında floresan protein-aequorin biyolüminesansı.

Drosophila Beyin Yapılarında Kalsiyum Geçişlerini İncelemek için Biyolüminesans Görüntüleme

Burada açıklanan flüoresan bazlı kalsiyum mobilizasyon tahlil yetim G-protein bağlı reseptörler (GPCR'ler) fonksiyonel olarak aktive edici ligandın (ler) in belirlenmesi için, bir orta-throughput ters farmakoloji tarama sistemidir.

Bir floresan bazlı Kalsiyum Mobilizasyon Deneyi G proteini ile birleştirilmiş alıcıların karakterizasyonu

Burada bir biyolüminesens muhabir kullanarak yaklaşım -imaging bir roman Ca 2 + sunuyoruz. Bu yaklaşım, Ca2 + bağlanan ve hafif uyarılması için ihtiyacı ortadan kaldırarak, ışık yayan bir kaynaşık konstrukt GFP Aequorini kullanır. Anlamlı bu yöntem derin beyin yapıları ve yüksek temporal çözünürlük uzun sürekli görüntüleme, erişime izin verir.

Bioluminescent Kalsiyum Göstergesi GFP-aequorin dayanarak Vivo Fonksiyonel Beyin Görüntüleme Yaklaşım

Açıklanan hücresel tahlil CXC Kemokin reseptör 4 (CXCR4) tanımlanması için tasarlanmıştır-inhibe veya teşvik, rekabetçi veya allosterically, CXCR4 etkinleştirme tarafından başlatılan intrasellüler Ca2 + serbest etkileşen aracıları.

Bir Kinetik Floresans tabanlı Ca2 + seferberlik tahlil G Protein birleştiğinde reseptör agonistleri, antagonistleri ve Allosteric modülatörler tanımlamak için

Bu iletişim kuralı biz standart ve birkaç yıl boyunca belirli miktarda nükleik asitler, sivrisinekler ve evi sinekler hemolymph doğrudan teslim etmek için kullanılan bir mikroenjeksiyon metodoloji açıklar. Bu iletişim kuralı en az enjeksiyon mortalite sonuçları ve ilişkili doz ölçümleri verimlilik sağlar.

Tekrarlanabilir dsRNA mikroenjeksiyon ve Oviposition Bioassay sivrisinekler ve evi sinekler

Açıklanan, yumurtaları saymak ve 24 kuyu doku kültürü plakası kullanarak bireysel sivrisineklerin kuluçka oranlarını belirlemek için zaman ve yerden tasarruf sağlayan bir yöntemdir, bu da doğurganlık ve doğurganlık testlerinin ölçeğini ve hızını önemli ölçüde artırabilir.

24 Kuyu Doku Kültürü Plakası (EAgaL Plakaları) kullanılarak Aedes aegypti için Geliştirilmiş Doğurganlık ve Doğurganlık Tahlilleri

Bu çalışmada, rekombinant G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler) üzerindeki küçük molekül kütüphanelerini taramak için 384 kuyucuklu plakalar için yüksek verimli, hücre içi kalsiyum floresan testi açıklanmaktadır. Hedef, sığır ateşi kenesinden kinin reseptörü, Rhipicephalus microplus, CHO-K1 hücrelerinde eksprese edilir. Bu tahlil, aynı hücreleri tek bir "çift eklemeli" tahlilde kullanarak agonistleri ve antagonistleri tanımlar.

Rekombinant G Proteinine Bağlı Reseptörlerin Yüksek Verimli Taraması için "Çift İlaveli" Bir Kalsiyum Floresan Testi

Culex tarsalis sivrisineklerinin insan elleri üzerindeki sondalama ve yutma davranışlarını AC-DC elektropenetrografi kullanarak incelemek için prosedürler açıklanmıştır.

Culex tarsalis sivrisineklerinin insan ellerinde sondalama ve yutma davranışlarının incelenmesi için AC-DC elektropenetrografi

A açıklanmıştır sivrisinek hemocytes toplamak ve leke henüz doğru yöntem basitleştirilmiş. Bizim metodumuz Aedes sivrisinek hemocytes temiz hazırlıkları izole etmek için yüksek enjeksiyon teknikleri doğruluk ile perfüzyon sadeliği birleştirir. Bu yöntem çalışmaları gerektiren türleri hemocytes bilgi ve bolluk kolaylaştırır.

Yellow Fever Sivrisinek Hemocytes Toplama ve Boyama için Protokol Aedes aegypti</em

Öğrenin kalsiyum biyoparlaklık testi ile Aedes aegypti ve Rhipicephalus microplus GPCR'lerinin fonksiyonel analizini. Bu yöntem, neuropeptid-reseptör etkileşimlerini ve ilaç keşfini destekler.

Sivrisinek Fonksiyonel Analiz için Kalsiyum Biyoparlaklık Testi ( Aedes aegypti) Ve Tick ( Rhipicephalus Microplus) G Protein-çiftli Reseptörler (Video) | JoVE Journal

Sivrisinek Fonksiyonel Analiz için Kalsiyum Biyoparlaklık Testi ( Aedes aegypti) Ve Tick ( Rhipicephalus Microplus) G Protein-çiftli Reseptörler

Daha fazla video keşfet