Kategori Algılama Bir Bakteriyel Patojenler 'Bioluminescent' Muhabir Faj

Yesinia Pestis ve Bacillus Anthrax, sırasıyla veba ve şarbon hastalıklarına neden olan kategori A bakteriyel patojenlerdir. Her iki hastalığın doğal görülme sıklığı günümüzde nispeten nadir olsa da, terörist grupların bu patojenleri biyolojik silah olarak kullanma olasılığı gerçektir. Bu video, yersinia pestis'i tespit etme ve tanımlama yöntemini göstermektedir.

İlk olarak, mikroorganizma agri plaklarında ve sıvı besiyerinde büyütülür. Ardından, kültüre y pesti'ye özgü bir raporlayıcı pH eklenir. Raporlayıcı pH, genomunda bakteriyel lusiferazı kodlayan luxe AB genlerini taşır.

Eğer Y. pestis hücreleri mevcutsa, rapor fajı hücreye spesifik olarak bağlanacak, luxe AB genlerini taşıyan rekombinant DNA'sını enjekte edecek ve luxe AB rapor genlerini transkribe ve transle etmek için konakçının transkripsiyonel ve translasyonel mekanizmasını kullanacaktır. Numunelerin biyolüminesan bir fenotip kazandığını gösteren sonuçlar elde edilir; bu durum, bilinmeyen mikroorganizmanın Y. pestis olarak pozitif şekilde tanımlandığını gösterir. Bu tekniğin, geleneksel faj lizis testi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, Y. pestis'in saptanması ve tanımlanması için gereken sürenin günler yerine dakikalar olmasıdır. Bu yöntem, izole kültürler kullanılarak veya doğrudan karmaşık klinik veya çevresel numunelerden Y. pestis varlığının hızlı bir şekilde saptanmasına ve tanımlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin etkileri veba tanısına kadar uzanmaktadır; çünkü hastalık, semptomların ortaya çıkışından sonraki ilk 24 saat içinde tedavi edilmediğinde genellikle ölümcüldür. Bu nedenle, Yesenia pestis'in zamanında tanımlanması olumlu bir prognoz için esastır. Neredeyse tüm bakteri türleri için fajlar mevcut olduğundan, bu metodoloji tıbbi, çevresel veya tarımsal açıdan Y pestis kadar önemli olan herhangi bir türe potansiyel olarak uyarlanabilir.

A 1122, biyogüvenlik seviyesi iki kapsamındaki hariç tutulmuş seçilmiş bir ajan suşudur. Virülans için gerekli olan hem 75 Kilobaz Perlo kalsiyum yanıtı veya LCR virülans plazmidi hem de PGM lokusundan yoksundur. Bu prosedüre, steril teknik kullanarak sınıf iki tip a biyogüvenlik kabini altında Y. pestis A 1122'yi ekerek başlayın.

Stok kültürleri burada gösterildiği gibi LB agara ekleyin. Plakaları, 28 °C'ye ayarlı, statik, sıcaklık kontrollü bir hava inkübatörüne ters çevirerek yerleştirin ve 48 saat bekletin. Y pestis'in büyüme hızı yavaştır ve iki gün sonraki jenerasyon süresi 1.25 saattir.

Tek bir y pestis kolonisini almak için steril metal bir ekim özesi kullanın. Boyutu tekdüze olan, diğer kolonileri temsil eden ve plaka üzerindeki diğer kolonilerden net bir şekilde ayrılmış bir koloni seçin. Koloniyi, iki mililitre LB broth içeren steril 17 x 100 milimetre'lik bir kültür tüpüne aktarın.

Tüpün kapağını kapatıp kısa süre vortexleyin, ardından yaklaşık 20 saat boyunca 28 °C'de, 225 RPM hızındaki çalkalamalı inkübatöre yerleştirin. Bu analiz için, tespit amacıyla aktif olarak büyüyen hücreler tercih edilir. Fajın transduksiyon yeteneği nedeniyle, biyolüminesans yanıtı konakçı bakterilerin canlılığı ve kondisyonu ile ilişkilidir.

Buna rağmen, tespit sisteminin büyüme döngüsünün tüm aşamalarında toplanan hücrelerle uyumlu olduğu gösterilmiştir. 20 saatlik büyümenin ardından, 10 mililitre lb broth'e 500 mikrolitre hücre ekleyerek Y pestis kültürünü 50 mililitrelik konik bir tüpte yirmide bire seyreltin. Kültürü 28 derece santigrat sıcaklıktaki çalkalamalı inkübatöre geri yerleştirin.

Kültürün, 600 nanometrede 0,2 optik yoğunluğa ulaşana kadar büyümesine izin verin. Biyolüminesans reaksiyon substratının üretilmesi için bu işlem yaklaşık beş saat sürmelidir. 200 mikrolitre N decanal ile 9,8 mililitre LB besiyerini birleştirerek %2'lik bir N decanal çözeltisi hazırlayın.

Beş saniye boyunca kuvvetlice vorteksleyin. Ardından, Mikroplaka Lüminometre enjektörünü hazırlamak için; enjektör borusunun bir ucunu %2'lik end decal çözeltisi içeren 13 mililitrelik bir tüpe, diğer ucunu ise bir atık konteynerine yerleştirin.

Ekipman yazılımını kullanarak, makineye enjektör hattını iki mililitre decanal çözeltisi ile doldurması talimatını verin. İşlem tamamlandığında hat substrat ile dolmuş olmalıdır; enjektör hattının ucunu, kuyucuklara enjeksiyon yapmaya hazır olacak şekilde tekrar ayarlanan konumuna yerleştirin. Ardından, lüminometreye her bir mikroplakaya 67 mikrolitre deel çözeltisi otomatik olarak enjekte etmesi talimatını verin.

Ardından, yayılan biyolüminesans seviyesini hemen 10 saniye boyunca ölçün. Sonrasında, her örneği hazırlamak için her koşul adına üç adet kültür tüpünü triplike olarak etiketleyin. Burada, bir test örneğine ek olarak sadece faz kontrolleri ve sadece hücre kontrolleri hazırlanacaktır.

Sadece faji içeren kontrol örneklerini hazırlamak için dokuz tüp gerekmektedir; üç kültür tüpüne bir mililitrelik LB besiyeri alikotları dağıtın. Her tüpe, mililitre başına beş çarpı 10 üzeri 9 plak oluşturan birim veya PFU içeren raporlayıcı faj stok çözeltisinden 20 mikrolitre ekleyin.

Y pesti hücrelerinin yokluğunda, rapor faji ilavesi biyolüminesans yanıtı oluşturmamalıdır. Ardından, test örneklerini hazırlamak için, Y pesti kültüründen bir mililitrelik alikotları üç kültür tüpüne dağıtın. Üç kültürün her birine 20 mikrolitre rapor faji stok çözeltisi ekleyin.

Hücreleri tek başına hazırlamak için kültürleri kısa süreli vorteksleyerek karıştırın. Arka plan oto-biyolüminesansını belirlemek için kullanılan negatif kontroller için, Y pestis kültüründen üç ek kültür tüpüne bir mililitrelik alikotlar dağıtın. Örnekler hazırlandığında, sıfırıncı zaman okuması için her bir kültürden 200 µL'yi beyaz bir 96 kuyucuklu mikrotitrasyon plağının kuyucuklarına aktarın.

Her bir kültürün geri kalanını, bir mikroplaka lüminometre kullanarak 28 °C'deki çalkalayıcıya yerleştirin. Süreyi ölçün. Biyolüminesans veya bağıl ışık birimleri için örnekleri sıfırlayın.

Her bir kültürden 200 µL alarak ve Microplate Luminometre ile 20, 30, 40 ve 60. dakikalarda okumalar yaparak biyolüminesans ölçümlerini gerçekleştirin. y pestis çoğalmasına gerek kalmadan tespit sürecini hızlandırmak için raporlayıcı faj eklendikten sonra, taze büyütülmüş bir plakadan bir koloniyi, raporlayıcı faj içeren 200 µL lb bulunan bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Örneği vorteksleyerek karıştırın, ardından hücre-faj karışımını bir mikrotitre plakası kuyucuğuna aktarın.

Mikrotitrasyon plağını 28 °C'de 60 dakika boyunca inkübe edin. Ardından örneğin biyolüminesans değerini okuyun. Bu videoda gösterilen analiz, giriş bölümünde açıklandığı üzere Y. pesti hücrelerinin varlığını tespit eder.

Y. pestis mevcut olduğunda, raporlayıcı faj hücre üzerindeki spesifik bir reseptöre bağlanır, DNA'sını enjekte eder ve luxe raporlayıcı genlerini transkribe ve transle etmek için konakçının transkripsiyonel ve translasyonel mekanizmasını kullanır. Sinyal gücü ve sinyal yanıt süresi, mililitre başına 10⁵ ile 10⁸ CFU arasındaki yüksek hücre konsantrasyonlarında mevcut olan hücre sayısıyla orantılıdır.

Düşük hücre konsantrasyonlarında, mililitrede 10² ile 10⁴ CFU arasında, 20 dakika içinde kontrollere kıyasla RLU'da belirgin bir artış görülmelidir. RLU'daki belirgin artış 40 ila 60 dakika içinde fark edilmelidir. Y. pestis'in reporter ve faj aracılı tespitine dair temsili bir zaman seyri deneyi burada sıfırıncı dakikada gösterilmiştir.

Reporter fajlar ve hücreler karıştırılarak 28 °C'de inkübe edilmiş ve biyolüminesans RLU değerleri zamanla izlenmiştir. RLU'daki artış 12 dakika içinde belirginleşmiş olup, P < 0.05 P değeri ile anlamlı bulunmuştur; sadece faj veya sadece hücrelerden oluşan negatif kontroller, 60 dakikalık inkübasyon boyunca yaklaşık 20 RLU düzeyinde bazal biyolüminesans seviyeleri sağlamıştır. Bazal seviyelerin lüminometreye özgü olduğunun belirtilmesi önemlidir.

Buna karşılık, test örnekleri raporlayıcı phant hücreleri için biyolüminesens artışı, faji eklemeden 12 dakika sonra belirginleşmektedir. Sinyal gücü 50 dakika boyunca düzenli olarak artmalıdır; burada gösterilmese de, 80 dakikayı aşan inkübasyon süreleri, faj aracılı konak hücre lizisi nedeniyle pik sinyalden itibaren azalan bir sinyalle sonuçlanacaktır. Y. pestis büyümesi için optimum sıcaklık 28 °C olmasına rağmen, 37 °C inkübasyon sıcaklıklarında da benzer sonuçlar elde edilmektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, tespit için rekombinant raporlama yönteminin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Yersinia pestis tanımlama işlemi bir kez kavrandıktan sonra, başlangıç inokülümü olarak S Altın Kolonileri kullanılarak bu teknik 30 dakika içinde gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü uygularken ve laboratuvarda faj kullanırken, bakteriyel stok kültürlerinizi faj ile kontamine etmenin çok kolay olduğunu ve kontaminasyon olasılığını azaltmak için dikkatli olmanız gerektiğini unutmamak önemlidir.

Tek kullanımlık plastik ekipmanlar ve uygun uçlar kullanın ve eldivenlerinizi düzenli olarak değiştirin. Raporun bir Blum yanıtı uyandırma yeteneği, hücrenin kondisyonu ile ilişkilidir. Bu nedenle, Yesenia Pesta tanımlamasının ardından, rapor izolatın antibiyotik duyarlılığını belirlemek için kullanılabilir.

Örneğin, antibiyotiğin inhibitör konsantrasyonu ile inkübe edilen Yesenia pesta hücreleri, biyolüminesans sinyali üretme yeteneğini ya tamamen kaybedecek ya da bu yeteneği ciddi şekilde kısıtlanacaktır. Buna karşılık, antibiyotiğe dirençli olan Yesenia pesta hücreleri, antibiyotiğin varlığından etkilenmeyecek ve inhibe edilmemiş hücrelere benzer bir biyolüminesans yanıtı verebilecektir. Böylece, patojenin antibiyotiklere karşı duyarlılık profili hızla belirlenebilir.

Gösterim amaçlı olarak, atenüe edilmiş bir Yesenia pesta suşu kullandık. Bu deneyde, Yesenia pests bir kategori olan bakteriyel bir patojendir. Yesenia Pestis barındırdığı düşünülen örneklerle bu teknik uygulanırken, uygun biyogüvenlik ve biyotehlike önlemleri takip edilmelidir.