Name: Kategori Algılama Bir Bakteriyel Patojenler Bioluminescent Muhabir Faj (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Öğrenin Yersinia pestis'i biyolüminesan muhabir faj kullanarak hızlıca tespit etme yöntemini. Bu teknik, genetik mühendisliği ile patojen tanımlamada dakikalar içinde sonuç verir ve biyogüvenlikte kritik öneme sahiptir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Small Business Innovation Araştırma Programı (NIAID, 1R43AI082698-01) ve Gıda ve Tarım USDA Ulusal Enstitüsü (NIFA, 2009-33610-20028) tarafından desteklenmiştir.

1.. Y. pestis plaka aşılama <ol><li> Streak Y. pestis A1122 Luria-Bertani üzerine stok kültürleri (LB) agar (BeiResources # NR15) (Miller). Steril tekniği kullanın ve tüm Y. gerçekleştirmek sınıf II tipi bir biyogüvenlik kabini. Y. pestis manipülasyonlar pestis A1122 bir Biyogüvenlik Seviyesi (BGS) 2 hariç etken suşun seçin. Bu her ikisi de 75 kb çifti düşük kalsiyum plazmid yanıt (LCR) virülans ve virülans için gerekli olan pgm lokus yoksundur. Y. büyütün 28 pestis ° C, statik sıcaklık, hava inkübatör kontrol 48 saat. Y. 'nin büyüme hızı pestis 1.25 saat 9 nesil zaman yavaştır. </li></ol> 2.. Y. pestis sıvı medya aşılama <ol><li> Bir tek Y. transfer LB et suyu, kısır bir metal aşılama döngü kullanarak 2 ml içeren steril bir 17 x 100 mm kültür tüpünün içine pestis koloni . Boyutu tekdüze bir koloni seçin, diğer kolonilerin göstergesidir ve plaka kolonilerin geri kalanından açıkça ayrılır. Vortex kısaca tüp ve 28 kültür büyümeye ° C sallayarak inkübatör (225 rpm) yaklaşık 20 saat. </li></ol> 3.. Y. pestis akıbet, muhabir faj Ayrıca, ve bioluminescent algılama <ol><li> Gecede Y. sulandırınız pestis kültür 50 ml şahin tüp taze LB suyu (örneğin, 9.5 mL orta içine hücre 500 mcL) 1:20 ve 28 ° C (225 rpm) sallayarak ile büyüyecek. 0.2 600 nm (600) bir optik yoğunluk (yaklaşık 5 saat) ulaşılana kadar büyütün. Aktif büyüyen hücreleri bioluminescent yanıt ana bakterilerin canlılığı ve fitness ilişkilidir uyum sağlamak faj yeteneği beri tespiti için tercih edilir. Bununla birlikte, algılama sistemi, büyüme döngüsünün 7 tüm aşamalarında hasat hücreleri ile uyumlu olacak şekilde gösterilmiştir . </li><li> N% 2 dekana çözüm hazırlayarak bioluminescent reaksiyon için gerekli substrat oluşturun. LB et suyu 9.8 mL n-dekana 200 mcL karıştırın. 5 saniye süreyle kuvvetlice Vortex Başbakan, 2 mL% 2 n-dekana çözüm ile mikroplaka luminometre enjektör. Luminometre ve sonra her mikroplak dekana çözüm 67 mcL autoinject hemen 10 sn için örnek okumak için önceden ayarlanmış </li><li> 3 kültür tüp içine 1 mL alikotları LB suyu koyun. Her bir tüp muhabiri faj stok solüsyonu (5 x 10 9 plak oluşturan birim stok [PFU] / ml) 20 mcL ekleyin; faj ve medya tek başına örnekleri negatif kontrol olarak hizmet vermektedir. Y. 'nin yokluğunda pestis hücreleri, muhabir faj ek bir bioluminescent cevabı ortaya olmamalıdır. </li><li> Y. 1 mL alikotları Uygulama 6 kültür tüp içine pestis kültür (3.1 adım). Kültürleri (testi kültürler) 3 muhabir faj stokunun 20 mcL ekleyin. Kalan 3 kültür, hücreleri tek başına 'negatif kontrol (arka plan autobioluminescence) olarak hizmet vermektedir. Kısaca vorteks kültürlerin karıştırın ve her bir örnek hasat 200 mcL (0 zaman okumak için) ve beyaz 96-iyi bir mikrotiter plate içine dağıtmak. Kalan kültür 28 ° C'de sallayarak (225 rpm). </li><li> Mikroplak luminometre kullanarak biyoparlaklık (bağıl ışık birimleri, RLU) için 0 örnekleri ölçün. </li><li> Hasat 200 10 saniye sonra her bir örnek mcL, 20, 30, 40, 50, ve 60 dakika sonrası muhabiri faj Ayrıca, biyoparlaklık için örnek ölçmek. Eğer Y. pestis hücreleri mevcuttur, muhabir faj, özellikle hücre bağlamak DNA'sı enjekte ve luxAB muhabiri genleri (Şekil 1) yazıya çevirmek için ev sahipliği yapan, transkripsiyonel ve translasyonel makine kullanım olacak . </li><li> Sinyal gücü ve sinyal tepki süresi, hücre sayısı ile mevcut orantılıdır. 20 dakika içinde hücreler (10 5 -10 8 CFU / mL), kontrollere göre önemli bir artış RLU yüksek konsantrasyonlarda belirgin olmalıdır. Alt hücreye konsantrasyonlarda (10 2 -10 4 CFU / ml), RLU önemli bir artış, 40-60 dakika içinde belirgin olmalıdır . </li><li> Alternatif olarak, Y. için gerek kalmadan algılama sürecini hızlandırmak için pestis akıbet taze yetişen bir tabak, bir koloni doğrudan muhabiri faj barındıran LB suyu 200 mcL ile 1.5 ml Eppendorf tüp (vorteks) karışık olabilir. Mikrotiter plate bir kuyunun içine hücre / faj karışımı koyun. Mikrotiter plate 28 ° C'de inkübe edin ve 60 dk sonra (sadece tek bir zaman noktasında) biyoparlaklık için örnek okuyun. </li></ol> 4. Temsilcisi sonuçları: Bir temsilci, muhabir faj ders deney Y. algılama aracılı pestis, Şekil 2'de gösterilmiştir . 1 negatif kontroller) faj tek başına (hücreleri), ya da yalnız 2) hücreleri (yok faj), 60 dakika inc boyunca yaklaşık 20 RLU biyoparlaklık başlangıç ​​düzeyleriubation (taban seviyelere luminometre özgüdür). Buna karşın, test örnekleri (muhabiri faj ve hücreleri) biyoparlaklık bir artış faj eklenmesinden sonra 15 dakika açıktır. Sinyal gücü, 60 dakika boyunca sürekli artmalıdır. Inkübatörü, uzun süre süreler (80 dk), ana hücreler aracılı lizis faj nedeniyle zirve sinyali azalacak bir sinyal neden olur. ° C olsa Y. için optimum sıcaklık 37 inkübasyon sıcaklıkları benzer sonuçlar elde pestis büyüme 28 ° C 9. <img src="/files/ftp_upload/2740/2740fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Y. Faj aracılı bioluminescent algılama pestis. süresi 0, 28 ° C'de inkübe muhabiri faj ve hücreler, karışık, ve bioluminesans (RLU) zaman içinde takip edildi. RLU önemli bir artış (* Öğrenciler t-testi, p &lt;0.05), 15 dakika içinde açıktır.

<ol><li>Darling, R. G., Catlett, C. L., Huebner, K. D., Jarrett, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Threats+in+bioterrorism.+I%3A+CDC+category+A+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Med+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Threats in bioterrorism. I: CDC category A agents.</a> Emerg Med Clin North Am. 20, 273-309 (2002).</li>
<li>Chu, M. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChu%2C+MC+%22Laboratory+manual+of+plague+diagnostic+tests.%22">Laboratory manual of plague diagnostic tests.</a>. , Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta. (2000).</li>
<li>, (1999).</li>
<li>Inglesby, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anthrax+as+a+biological+weapon%2C+2002%3A+updated+recommendations+for+management%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Anthrax as a biological weapon, 2002: updated recommendations for management.</a> JAMA. 287, 2236-2252 (2002).</li>
<li>Schuch, R., Fischetti, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+genomic+analysis+of+the+Wbeta+and+gamma+phages+infecting+Bacillus+anthracis%3A+implications+for+evolution+of+environmental+fitness+and+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Detailed genomic analysis of the Wbeta and gamma phages infecting Bacillus anthracis: implications for evolution of environmental fitness and antibiotic resistance.</a> J Bacteriol. 188, 3037-3051 (2006).</li>
<li>Garcia, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+sequence+of+Yersinia+pestis+bacteriophage+phiA1122+reveals+an+intimate+history+with+the+coliphage+T3+and+T7+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The genome sequence of Yersinia pestis bacteriophage phiA1122 reveals an intimate history with the coliphage T3 and T7 genomes.</a> J Bacteriol. 185, 5248-5262 (2003).</li>
<li>Schofield, D. A., Molineux, I. J., Westwater, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+bioluminescent+phage+for+detection+of+Yersinia+pestis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Diagnostic bioluminescent phage for detection of Yersinia pestis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 47, 3887-3894 (2009).</li>
<li>Schofield, D. A., Westwater, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage-mediated+bioluminescent+detection+of+Bacillus+anthracis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Phage-mediated bioluminescent detection of Bacillus anthracis.</a> Journal of Applied Microbiology. 107, 468-478 (2009).</li>
<li>Chu, M. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChu%2C+MC+%22CDC%3A+Basic+laboratory+protocols+for+the+presumptive+identification+of+Yersinia+pestis%22">CDC: Basic laboratory protocols for the presumptive identification of Yersinia pestis</a>. , Centers for Disease Control and Prevention. 1-19 (2001).</li>
<li>Gunnison, J. B., Larson, A., Lazarus, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+differentiation+between+Pasteurella+pestis+and+Pasteurella+pseudotuberculosis+by+action+of+bacteriophage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Rapid differentiation between Pasteurella pestis and Pasteurella pseudotuberculosis by action of bacteriophage.</a> J Infect Dis. 88, 254-255 (1951).</li>
<li>Lazarus, A. S., Gunnison, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Action+of+Pasteurella+pestis+Bacteriophage+on+Strains+of+Pasteurella%2C+Salmonella%2C+and+Shigella%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Action of Pasteurella pestis Bacteriophage on Strains of Pasteurella, Salmonella, and Shigella.</a> J Bacteriol. 53, 705-714 (1947).</li>
<li>Sergueev, K. V., He, Y., Borschel, R. H., Nikolich, M. P., Filippov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+sensitive+detection+of+Yersinia+pestis+using+amplification+of+plague+diagnostic+bacteriophages+monitored+by+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid and sensitive detection of Yersinia pestis using amplification of plague diagnostic bacteriophages monitored by real-time PCR.</a> PLoS One. 5, e11337-e11337 (2010).</li>
</ol>

Bu yöntem, hızla Y. tespit muhabiri faj yeteneği gösterir muhabir faj beri pestis kültürlü Y. bioluminescent sinyal yanıt transduce pestis faj eklenmesinden sonra 20 dakika içinde hücreler. Muhabir faj da doğrudan Y. algılama yeteneğine sahiptir izolasyon ve sonraki ekimi 7 önkoşul olmadan klinik matrisler pestis. Genellikle 48 saat tamamlanması için gereken standart faj lizis deneyleri ile karşılaştırıldığında, önemli ölçüde bu algılama zamanını azaltır. ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th></tr><tr><td> Difco LB agar, Miller </td><td> VWR </td><td> 90003-346 </td></tr><tr><td> Difco LB suyu, Miller </td><td> VWR </td><td> 90003-350 </td></tr><tr><td> 17 x 100 mm kültür tüpleri </td><td> ABD Bilimsel </td><td> 1485-0810 </td></tr><tr><td> n-dekana </td><td> Sigma </td><td> D7384 </td></tr><tr><td> Veritas mikroplaka luminometre </td><td> Tuna Biosystems </td><td> 9100-001 </td></tr><tr><td> Microlite mikrotiter 96-plaka </td><td> VWR </td><td> 62402-984 </td></tr></tbody></table>

kategori algılama bir bakteriyel patojenler &#39;bioluminescent&#39; muhabir faj

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis ve Bacillus anthracis sırasıyla 1, veba ve şarbon etken bakteriyel patojenler Kategori. Her iki hastalık 'doğal olarak ortaya çıkan, nispeten nadir olmasına rağmen, bioweapon olarak bu patojenlerin kullanarak terörist grupların olasılığı gerçek. Hastalığın doğasında Bulaşıcılık, hızlı klinik seyri ve yüksek ölüm oranı nedeniyle bir salgın hızlı bir şekilde tespit edilmesi kritik öneme sahiptir. Bu nedenle hızlı algılama ve teşhis sağlayacak metodolojileri, halk sağlığı önlemlerinin ve kriz yönetimi aktivasyonu derhal uygulanmasını sağlamak için gerekli. Rekombinant muhabiri faj Y. 'nin tespiti için hızlı ve spesifik bir yaklaşım sağlayabilir pestis ve B. anthracis Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri, şu anda bu bakteriyel patojenler 2-4 teyit tanımlanması için klasik faj lizis testleri kullanabilirsiniz. Bu deneyleri, doğal olarak bakteriyel bilgisayarlar için özel ve litik faj meydana gelen yararlanmak. Özel faj varlığında ekili bakterinin gecede büyüme sonra, plaklar oluşumunu (bakteriyel lizis) bakteri hedef olumlu bir tanımlama sağlar. Bu testlerin güçlü olmasına rağmen, üç eksiklikleri zarar: 1) laboratuvar bazlı, 2) şüpheli numune bakteri izolasyonu ve kültivasyonu gerektirir, ve 3) tamamlamak için 24-36 saat alır. Bu sorunları ele almak için, rekombinant "ışık etiketli" muhabiri faj genetik Vibrio harveyi luxAB genler Y. genom içine entegre ederek, mühendislik pestis ve B. anthracis özel faj 5-8. LuxAB muhabiri faj hızla kendi özel hedef tespit edebiliyoruz (dakika içinde) ve hassas alıcı hücrelere bioluminescent fenotip görüşmekte. Önemlisi, algılama ekili alıcı hücreleri ile veya sahte-enfekte klinik örneklerden 7 ya da elde edildi. Gösteri amaçlı, burada bilinen bir Y. faj aracılı tespiti için bir yöntem tarif pestis CDC veba teşhis faj ΦA1122 6,7 (Şekil 1) inşa luxAB muhabiri faj kullanılarak izole. Küçük değişiklikler (örneğin büyüme sıcaklık ve ortam değişikliği), B. tespiti için benzer bir yöntem kullanılıyor olabilir anthracis B. kullanarak izole anthracis muhabiri faj Wβ: luxAB 8. Yöntemi ekili Y. biolumescent fenotip faj aracılı transdüksiyon açıklar sonradan mikroplak luminometre kullanarak ölçülür pestis hücreleri. Bu yöntemin geleneksel faj lizis deneyleri üzerinde önemli avantajları, kolay kullanımı, hızlı sonuçlar ve 96-iyi mikrotiter plate formatı aynı anda birden fazla örneklerini test etmek için yeteneği. <img src="/files/ftp_upload/2740/2740fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Algılama şematik faj örneği ile karıştırılır, faj hücre, luxAB ifade edilir ve hücre bioluminesces bozar. Örnek işlem gerekli değildir; faj ve hücreler karıştırılır ve daha sonra ışık ölçülür.

Öncelikli bakteriyel patojenlerin tespiti için basit bir yöntem, genetiği muhabiri faj kullanmaktır. Kendi özel konak türe özgü Bu muhabir faj, konak hücreleri için bioluminescent sinyal yanıt hızla uyum sağlama yeteneğine sahiptir. Burada, biz tespiti için muhabir faj kullanımını tanımlamak<em&gt; Yersinia pestis</em&gt;.

Kategori Algılama Bir Bakteriyel Patojenler &#39;Bioluminescent&#39; Muhabir Faj

Yersinia pestis ve Bacillus anthracis, sırasıyla veba ve şarbonun etkenleri olan Kategori A bakteriyel patojenlerdir 1. ...

Yesinia Pestis ve Bacillus Anthrax, sırasıyla veba ve şarbon hastalıklarına neden olan kategori A bakteriyel patojenlerdir. Her iki hastalığın doğal görülme sıklığı günümüzde nispeten nadir olsa da, terörist grupların bu patojenleri biyolojik silah olarak kullanma olasılığı gerçektir. Bu video, yersinia pestis'i tespit etme ve tanımlama yöntemini göstermektedir.İlk olarak, mikroorganizma agri plaklarında ve sıvı besiyerinde büyütülür. Ardından, kültüre y pesti'ye özgü bir raporlayıcı pH eklenir. Raporlayıcı pH, genomunda bakteriyel lusiferazı kodlayan luxe AB genlerini taşır.Eğer Y. pestis hücreleri mevcutsa, rapor fajı hücreye spesifik olarak bağlanacak, luxe AB genlerini taşıyan rekombinant DNA'sını enjekte edecek ve luxe AB rapor genlerini transkribe ve transle etmek için konakçının transkripsiyonel ve translasyonel mekanizmasını kullanacaktır. Numunelerin biyolüminesan bir fenotip kazandığını gösteren sonuçlar elde edilir; bu durum, bilinmeyen mikroorganizmanın Y. pestis olarak pozitif şekilde tanımlandığını gösterir. Bu tekniğin, geleneksel faj lizis testi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, Y. pestis'in saptanması ve tanımlanması için gereken sürenin günler yerine dakikalar olmasıdır. Bu yöntem, izole kültürler kullanılarak veya doğrudan karmaşık klinik veya çevresel numunelerden Y. pestis varlığının hızlı bir şekilde saptanmasına ve tanımlanmasına yardımcı olabilir.Bu tekniğin etkileri veba tanısına kadar uzanmaktadır; çünkü hastalık, semptomların ortaya çıkışından sonraki ilk 24 saat içinde tedavi edilmediğinde genellikle ölümcüldür. Bu nedenle, Yesenia pestis'in zamanında tanımlanması olumlu bir prognoz için esastır. Neredeyse tüm bakteri türleri için fajlar mevcut olduğundan, bu metodoloji tıbbi, çevresel veya tarımsal açıdan Y pestis kadar önemli olan herhangi bir türe potansiyel olarak uyarlanabilir.A 1122, biyogüvenlik seviyesi iki kapsamındaki hariç tutulmuş seçilmiş bir ajan suşudur. Virülans için gerekli olan hem 75 Kilobaz Perlo kalsiyum yanıtı veya LCR virülans plazmidi hem de PGM lokusundan yoksundur. Bu prosedüre, steril teknik kullanarak sınıf iki tip a biyogüvenlik kabini altında Y. pestis A 1122'yi ekerek başlayın.Stok kültürleri burada gösterildiği gibi LB agara ekleyin. Plakaları, 28 °C'ye ayarlı, statik, sıcaklık kontrollü bir hava inkübatörüne ters çevirerek yerleştirin ve 48 saat bekletin. Y pestis'in büyüme hızı yavaştır ve iki gün sonraki jenerasyon süresi 1.25 saattir.Tek bir y pestis kolonisini almak için steril metal bir ekim özesi kullanın. Boyutu tekdüze olan, diğer kolonileri temsil eden ve plaka üzerindeki diğer kolonilerden net bir şekilde ayrılmış bir koloni seçin. Koloniyi, iki mililitre LB broth içeren steril 17 x 100 milimetre'lik bir kültür tüpüne aktarın.Tüpün kapağını kapatıp kısa süre vortexleyin, ardından yaklaşık 20 saat boyunca 28 °C'de, 225 RPM hızındaki çalkalamalı inkübatöre yerleştirin. Bu analiz için, tespit amacıyla aktif olarak büyüyen hücreler tercih edilir. Fajın transduksiyon yeteneği nedeniyle, biyolüminesans yanıtı konakçı bakterilerin canlılığı ve kondisyonu ile ilişkilidir.Buna rağmen, tespit sisteminin büyüme döngüsünün tüm aşamalarında toplanan hücrelerle uyumlu olduğu gösterilmiştir. 20 saatlik büyümenin ardından, 10 mililitre lb broth'e 500 mikrolitre hücre ekleyerek Y pestis kültürünü 50 mililitrelik konik bir tüpte yirmide bire seyreltin. Kültürü 28 derece santigrat sıcaklıktaki çalkalamalı inkübatöre geri yerleştirin.Kültürün, 600 nanometrede 0,2 optik yoğunluğa ulaşana kadar büyümesine izin verin. Biyolüminesans reaksiyon substratının üretilmesi için bu işlem yaklaşık beş saat sürmelidir. 200 mikrolitre N decanal ile 9,8 mililitre LB besiyerini birleştirerek %2'lik bir N decanal çözeltisi hazırlayın.Beş saniye boyunca kuvvetlice vorteksleyin. Ardından, Mikroplaka Lüminometre enjektörünü hazırlamak için; enjektör borusunun bir ucunu %2'lik end decal çözeltisi içeren 13 mililitrelik bir tüpe, diğer ucunu ise bir atık konteynerine yerleştirin.Ekipman yazılımını kullanarak, makineye enjektör hattını iki mililitre decanal çözeltisi ile doldurması talimatını verin. İşlem tamamlandığında hat substrat ile dolmuş olmalıdır; enjektör hattının ucunu, kuyucuklara enjeksiyon yapmaya hazır olacak şekilde tekrar ayarlanan konumuna yerleştirin. Ardından, lüminometreye her bir mikroplakaya 67 mikrolitre deel çözeltisi otomatik olarak enjekte etmesi talimatını verin.Ardından, yayılan biyolüminesans seviyesini hemen 10 saniye boyunca ölçün. Sonrasında, her örneği hazırlamak için her koşul adına üç adet kültür tüpünü triplike olarak etiketleyin. Burada, bir test örneğine ek olarak sadece faz kontrolleri ve sadece hücre kontrolleri hazırlanacaktır.Sadece faji içeren kontrol örneklerini hazırlamak için dokuz tüp gerekmektedir; üç kültür tüpüne bir mililitrelik LB besiyeri alikotları dağıtın. Her tüpe, mililitre başına beş çarpı 10 üzeri 9 plak oluşturan birim veya PFU içeren raporlayıcı faj stok çözeltisinden 20 mikrolitre ekleyin.Y pesti hücrelerinin yokluğunda, rapor faji ilavesi biyolüminesans yanıtı oluşturmamalıdır. Ardından, test örneklerini hazırlamak için, Y pesti kültüründen bir mililitrelik alikotları üç kültür tüpüne dağıtın. Üç kültürün her birine 20 mikrolitre rapor faji stok çözeltisi ekleyin.Hücreleri tek başına hazırlamak için kültürleri kısa süreli vorteksleyerek karıştırın. Arka plan oto-biyolüminesansını belirlemek için kullanılan negatif kontroller için, Y pestis kültüründen üç ek kültür tüpüne bir mililitrelik alikotlar dağıtın. Örnekler hazırlandığında, sıfırıncı zaman okuması için her bir kültürden 200 µL'yi beyaz bir 96 kuyucuklu mikrotitrasyon plağının kuyucuklarına aktarın.Her bir kültürün geri kalanını, bir mikroplaka lüminometre kullanarak 28 °C'deki çalkalayıcıya yerleştirin. Süreyi ölçün. Biyolüminesans veya bağıl ışık birimleri için örnekleri sıfırlayın.Her bir kültürden 200 µL alarak ve Microplate Luminometre ile 20, 30, 40 ve 60. dakikalarda okumalar yaparak biyolüminesans ölçümlerini gerçekleştirin. y pestis çoğalmasına gerek kalmadan tespit sürecini hızlandırmak için raporlayıcı faj eklendikten sonra, taze büyütülmüş bir plakadan bir koloniyi, raporlayıcı faj içeren 200 µL lb bulunan bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Örneği vorteksleyerek karıştırın, ardından hücre-faj karışımını bir mikrotitre plakası kuyucuğuna aktarın.Mikrotitrasyon plağını 28 °C'de 60 dakika boyunca inkübe edin. Ardından örneğin biyolüminesans değerini okuyun. Bu videoda gösterilen analiz, giriş bölümünde açıklandığı üzere Y. pesti hücrelerinin varlığını tespit eder.Y. pestis mevcut olduğunda, raporlayıcı faj hücre üzerindeki spesifik bir reseptöre bağlanır, DNA'sını enjekte eder ve luxe raporlayıcı genlerini transkribe ve transle etmek için konakçının transkripsiyonel ve translasyonel mekanizmasını kullanır. Sinyal gücü ve sinyal yanıt süresi, mililitre başına 10⁵ ile 10⁸ CFU arasındaki yüksek hücre konsantrasyonlarında mevcut olan hücre sayısıyla orantılıdır.Düşük hücre konsantrasyonlarında, mililitrede 10² ile 10⁴ CFU arasında, 20 dakika içinde kontrollere kıyasla RLU'da belirgin bir artış görülmelidir. RLU'daki belirgin artış 40 ila 60 dakika içinde fark edilmelidir. Y. pestis'in reporter ve faj aracılı tespitine dair temsili bir zaman seyri deneyi burada sıfırıncı dakikada gösterilmiştir.Reporter fajlar ve hücreler karıştırılarak 28 °C'de inkübe edilmiş ve biyolüminesans RLU değerleri zamanla izlenmiştir. RLU'daki artış 12 dakika içinde belirginleşmiş olup, P < 0.05 P değeri ile anlamlı bulunmuştur; sadece faj veya sadece hücrelerden oluşan negatif kontroller, 60 dakikalık inkübasyon boyunca yaklaşık 20 RLU düzeyinde bazal biyolüminesans seviyeleri sağlamıştır. Bazal seviyelerin lüminometreye özgü olduğunun belirtilmesi önemlidir.Buna karşılık, test örnekleri raporlayıcı phant hücreleri için biyolüminesens artışı, faji eklemeden 12 dakika sonra belirginleşmektedir. Sinyal gücü 50 dakika boyunca düzenli olarak artmalıdır; burada gösterilmese de, 80 dakikayı aşan inkübasyon süreleri, faj aracılı konak hücre lizisi nedeniyle pik sinyalden itibaren azalan bir sinyalle sonuçlanacaktır. Y. pestis büyümesi için optimum sıcaklık 28 °C olmasına rağmen, 37 °C inkübasyon sıcaklıklarında da benzer sonuçlar elde edilmektedir.Bu videoyu izledikten sonra, tespit için rekombinant raporlama yönteminin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Yersinia pestis tanımlama işlemi bir kez kavrandıktan sonra, başlangıç inokülümü olarak S Altın Kolonileri kullanılarak bu teknik 30 dakika içinde gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü uygularken ve laboratuvarda faj kullanırken, bakteriyel stok kültürlerinizi faj ile kontamine etmenin çok kolay olduğunu ve kontaminasyon olasılığını azaltmak için dikkatli olmanız gerektiğini unutmamak önemlidir.Tek kullanımlık plastik ekipmanlar ve uygun uçlar kullanın ve eldivenlerinizi düzenli olarak değiştirin. Raporun bir Blum yanıtı uyandırma yeteneği, hücrenin kondisyonu ile ilişkilidir. Bu nedenle, Yesenia Pesta tanımlamasının ardından, rapor izolatın antibiyotik duyarlılığını belirlemek için kullanılabilir.Örneğin, antibiyotiğin inhibitör konsantrasyonu ile inkübe edilen Yesenia pesta hücreleri, biyolüminesans sinyali üretme yeteneğini ya tamamen kaybedecek ya da bu yeteneği ciddi şekilde kısıtlanacaktır. Buna karşılık, antibiyotiğe dirençli olan Yesenia pesta hücreleri, antibiyotiğin varlığından etkilenmeyecek ve inhibe edilmemiş hücrelere benzer bir biyolüminesans yanıtı verebilecektir. Böylece, patojenin antibiyotiklere karşı duyarlılık profili hızla belirlenebilir.Gösterim amaçlı olarak, atenüe edilmiş bir Yesenia pesta suşu kullandık. Bu deneyde, Yesenia pests bir kategori olan bakteriyel bir patojendir. Yesenia Pestis barındırdığı düşünülen örneklerle bu teknik uygulanırken, uygun biyogüvenlik ve biyotehlike önlemleri takip edilmelidir.

bioluminescent-reporter-phage-for-detection-category-bacterial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Yaşayan hayvanların bakteriyel enfeksiyonlar biyoparlaklık görüntüleme yöntemleri açıklanmıştır. Patojenler, canlı hayvanlarda enfeksiyon optik tüm vücut görüntüleme sağlayan lusiferaz ifade etmek için modifiye edilmiştir. Hayvan modelleri lusiferaz ifade patojenler ile enfekte olan ve hastalık ortaya çıkan ders biyoparlaklık görüntüleme ile gerçek zamanlı olarak görüntülenebilmekte.

Farelerde Görüntü Bakteriyel Enfeksiyonlar Lusiferaz Kullanımı

Biz son zamanlarda basit bir bakteriyel tespiti için floresan assay "mix-ve-okuma" kurmak için uygulanabilir Flourogenik DNAzyme probları üretmek için yeni bir yaklaşım bildirdin. Bu özel DNA sondaları böylece floresans sinyali kuşağa bakteriyel algılama çevirme belirli bakteri tarafından üretilen ham hücre dışı karışımı (CEM) varlığında, bir kromofor-değiştirilmiş-DNA RNA kimerik substratın bölünme katalize. Bu yazıda, "RFD-EC1" ifade belirli bir DNAzyme prob modeli bakterinin tespiti için...

Flourogenik DNAzymes kullanarak Bakterilerin Tespiti

Bioluminescent Bakteriyel Görüntüleme<em&gt; In Vivo</em

Kaynak: de Vries, C. R. ve ark., Kronik Pseudomonas aeruginosa Yara Enfeksiyonunun Gecikmiş Aşılama Modeli. J. Vis. Exp. (2020).Bu video, canlı bir fare modelinde bakteriyel enfeksiyon ilerlemesini izlemek için biyolüminesans görüntüleme tekniğini gösteriyor. LuxABCDE raporlayıcı sistemiyle tasarlanmış patojenik bakteriler, enfeksiyon bölgesinde ışık yayarak metabolik olarak aktif bakterilerin görselleştirilmesini sağlar. Araştırmacılar, fareyi zamanla görüntülemekle, enfeksiyon dinamiklerini...

Farelerde Bakteriyel Enfeksiyonların Biyolüminesans Görüntülemesi

Bu video, Mycobacterium tuberculosis enfeksiyonunun in vivo tespiti için raportör enzim floresan (REF) görüntülemeyi göstermektedir. Enfekte farelere intraperitoneal olarak REF görüntüleme için bir substrat enjekte edilir. Bakteriyel β-laktamaz enzimi tarafından hidrolize edildikten sonra, substrat floresan yayar ve bunun tespiti enfeksiyonun değerlendirilmesine yardımcı olur.

Bakteriyel Enfeksiyonun İn Vivo Takibi için Raportör Enzim Floresan Görüntüleme

Bakteriler kendi mikrobiyal komşularının fizyolojisini etkileme potansiyeline sahip salgılanan bileşikler üretirler. Burada katı ortam üzerinde Bacillus subtilis flüoresan raportör transkripsiyon suşlar ile toprak mikrop karıştırılarak gibi kimyasal olarak aracılık edilen türler arası etkileşimlerin saptanmasına imkan veren bir kokültürü ekran tarif eder.

Kimyasal Dolayımlı Türler arası etkileşimleri tespit etmek Coculture kullanma

Ilgili ilkeleri ölçme ve floroforlar ve antikor hedefli koşulları çok sayıda uyumluluğunu göstererek Lüminesans (YAKIT) dan Sınırsız Uyarma tarafından Floresans temel ve uygulanabilirliğini genişletilmesi.

BRET Ötesinde Bir Adım: Sınırsız Uyarma tarafından Flüoresan Lüminesans dan (YAKIT)

Bir fare modeli enterohemorrhagic bioluminescence etiketli bakteri kullanarak E. coli (EHEC) kolonizasyon için detaylı bir protokol sunulmuştur. Kollarındaki bu bakteriler tarafından bir non-invaziv görüntüleme sistemi içinde canlı hayvan vivo içinde tespiti geçerli anlayışımız EHEC kolonizasyon ilerletebilirsiniz.

Non-invaziv Vivo içinde Bioluminescence sistemi tarafından fare konak Enterohemorrhagic Escherichia Coli kolonizasyon algılama

Kollarındaki bakteri gibi çekirdek algılama mekanizmaları, çeşitli aracılığıyla ışık üretim düzenler. Bu roman yöntemi bioluminescence in situ incelenmesi ve hücre yoğunluğu için ışık emisyon korelasyon sağlar. Bir yapay kollarındaki Escherichia coli sistemi sağlar lux operons, Lux proteinler ve onların Interplay karakterizasyonu.

Situ Ölçüm ve korelasyon hücre yoğunluğu ve kollarındaki bakterilerin ışık emisyon

Burada açıklanan bakteri gen ekspresyonu hayvan dokularında hücresel düzeyde analiz etmek için bir yöntemdir. Bu yöntem ve doku ortamındaki bakteriyel bir nüfus enfeksiyon sırasında içinde meydana gelen fenotipik çeşitlilik eğitimi için bir kaynak sağlar.

Bakteriyel gen düzenlemesi enfekte dokularda çalışmaya bir floresan tabanlı yöntemi

Burada, enfeksiyon sırasında patojenik bakterilerin organ çapında tespit edilmesini ve floresan raportör aktivitelerinin miktarını belirlemeyi sağlayan bir prosedürü açıklıyoruz.

Mikrobiyal enfeksiyonların yüksek çözünürlüklü üç boyutlu tüm organ tomografisi

Öğrenin Yersinia pestis'i biyolüminesan muhabir faj kullanarak hızlıca tespit etme yöntemini. Bu teknik, genetik mühendisliği ile patojen tanımlamada dakikalar içinde sonuç verir ve biyogüvenlikte kritik öneme sahiptir.

Kategori Algılama Bir Bakteriyel Patojenler 'Bioluminescent' Muhabir Faj

Daha fazla video keşfet