Name: Beyin-infiltre lökositler izolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: Öğrenin, TMEV ile enfekte farelerden beyin lökositlerini izole etme yöntemini. Sürekli Percoll ve kesikli Ficoll gradyan santrifüjasyonu kullanarak beyne sızan bağışıklık hücrelerini saflaştırın ve akış sitometri ile fenotipleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Mayo Clinic (CLH) erken bir kariyer geliştirme ödülü, NINDS (CLH) hibe NS64571 tarafından desteklenen ve Donald ve Frances Herdrich (CLH) cömert bir hediye. Biz yardım için Mayo Clinic Sitometrisi Core teşekkür etmek istiyorum.

1. İntrakranial virüs enjeksiyonu: Aşağıdaki teknik değiştirilmiş ve laboratuar ve meslektaşları tarafından yaygın olarak kullanılmıştır. Kısaca, intrakranial enjeksiyon Theiler fare ensefalomiyelit virüsü (TMEV) veya sahte-enfeksiyon Daniel suşu (1, 10) beyin infiltre lökositler (BILs) ortaya çıkarmak için genç farelerde (yaş tercihen 5-6 hafta) yapılır. Daniel zorlanma, fasulye zorlanma ve GDVII suşu arasında farklılık olacağını lütfen unutmayınız. BILs hasat amaçla, fareler TMEV, 2x10 5 PFU almak ve 24 saat için bulaşmış. <ol><li> Otomatik olarak 1 ml Hamilton şırınga, bir iğne (27 gauge ¼ Kendall) takın ve virüsü 10 ul teslim ayarlayabilirsiniz. </li><li> 10 mcL DMEM içinde TMEV hava kabarcıkları dikkat şırıngaya çekin. Uygun olduğunda, sahte enfekte olmuş fareler virüs DMEM 10 ul alırsınız. </li><li> Enjeksiyondan hemen önce, izofluran yaklaşık 1 ml altında pamuk substrat ile bir tel ızgara içeren bir fanus içine dökün. </li><li> Toe-tutam duyarsız ve uçucu anestezik immobilize çan kavanoz tel ızgara üzerine koyun fareler direclty hafif anestezi olana kadar, yaklaşık 10-15 saniye. Fare rahatsız edici ve kostik madde gibi, izofluran ile doğrudan temas etmemelidir. </li><li> Fareler anestezi altında iken, tıraş ve mürekkep kullanılarak kafatası frontal korteks bölgede hızlı bir şekilde uygun koordinatları enjeksiyon için hazırlar. Enjeksiyon için genel konumu bregma için ön 1 mm ve 1 mm sagital sütür (Şekil 1) sağ tarafta lateral. Stereotaktik enjeksiyon bazı deneysel durumlar için uygun olsa da, biz, mürekkep ya da tıraş olmadan ücretsiz el enjeksiyon deneylerin çoğunluğu için uygun olduğunu buldular. Her iki eksen boyunca iğne ucu ile kürk Kesme enjeksiyon için uygun. </li><li> Bir enjeksiyon yapmak için, şark yaklaşık 3 mm derinliğe kadar kafatası ve kemik aracılığı ile basın iğne dik. </li><li> Hamilton şırınga düğmesine basarak ve çekilmeden önce beyin girmek için virüs için 2 saniye bekledikten beyin içine Express virüs. </li><li> Dikkatlice iğneyi çıkarın ve temiz, kuru bir kafes içinde fare. Fare anesteziden hızlı bir şekilde uyanırsınız ve birkaç dakika içinde normal işlevini devam ettirmek. Hayvan ötenazi olarak enjeksiyon yerinde aşırı kanama, anormal belirtileri sergileyen fareler uygun önem vermek uygun olabilir. Uygun hayvan Sağlığı ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu kurallar National Institutes 6 ve bağlılığı ele takip edilmelidir. </li></ol> 2. Beyin-infiltre lökosit hücre hazırlama: <ol><li> , 10 ml RPMI 1640, 9 ml Percoll ve 1 ml 10X PBS ve tüpler beyin kaldırma işlemi sırasında, bankta RT oturup, 30 ml kapasiteli tutabilir yuvarlak alt Oak Ridge santrifüj tüplerine hazırlayın. </li><li> Oda sıcaklığında (RT) Ficoll-Paque Plus getirin. </li><li> Değiştirilmiş izofluran doz aşımı 5 hayvan Euthanize ve hızlı bir şekilde buz üzerinde 5 ml RPMI içeren 15 ml konik bir tüp, paslanmaz çelik bir doku spatula ve yer kullanarak beyin kaldırmak. Bazı durumlarda, PBS-perfüzyon BILs hazırlanması periferik kan hücreleri dolaşan kaldırmak için uygun olabilir. Fare, tam ve doğru olarak anestezi öncesinde PBS-perfüzyon olmalıdır. </li><li> Beyin ve 7 ml cam Pyrex marka Tenbroeck doku değirmeni RPMI çözüm aktarın ve hafifçe 10-15 vuruş ile homojenize. </li><li> Homojenizatör ve iki kez pipetlemeyin yukarı ve aşağı doğru pipetleyin ek bir 5 ml RPMI. Transferi beyin Homojenat (yaklaşık 10 ml), önceden hazırlanmış yuvarlak alt tüp ve invert 2-3 kez hafifçe karıştırın. </li><li> Beckman Allegra X-22R klinik santrifüj F0360 sabit açılı rotor RT 30 dakika 7800g ave beyin Homojenat Spin. </li><li> Santrifüj sonra, degrade üst yüzen miyelin enkaz kaldırmak. Kırmızı kan hücresi pelet (Şekil 2) yukarıda yüzer lökosit tabakası toplayın. </li><li> 50 ml konik içine lökosit tabakası, 40 mikron hücre süzgecinden süzün. RMPI ile 50 ml hacmi çözüm getirin. </li><li> Spin tüpler RT az 5 dakika 1500 rpm (600g ave) bir klinik santrifüj içeren seyreltilmiş hücre süspansiyonu. </li><li> Süpernatantı aspire ve hücre pelletini toplamak. 1 ml FACS Tampon pelet (% 1 sığır serum albumin,% 0.02 sodyum kalsiyum azid ve magnezyum PBS) süspanse edin ve 5 ml yuvarlak alt FACS tüpler hücre süspansiyonu aktarmak. </li><li> 1 ml Ficoll-Paque Plus ile dikkatlice altında yatan süspansiyon. </li><li> 2500 rpm (1400 verdi) hiçbir fren RT 25 dakika klinik santrifüj tüp dönerler. </li><li> 1 ml pipet ve yeni 5 ml FACS tüp transfer arabirimi (Şekil 2) beyaz, kabarık katmanı kaldırın. Yıkama c4 ml FACS tamponu ile arşın. </li><li> Pelet hücrelerin klinik santrifüj RT az 5 dakika 1500 rpm (600g ave) tüp dönerler. </li><li> Süpernatant aspire ve hücre pelletini toplamak. Lökosit pelletini tekrar uygun tampon ve yeni bir FACS tüp içinde buz üzerinde tutmak. </li><li> Tripan mavi dışlama hücre canlılığını değerlendirmek ve flow sitometri ile analiz, hücre güvenin. Genel olarak, araştırmacılar yaklaşık 5 x 10 5 hücre / hayvan satın almak için bekleyebilirsiniz. </li></ol> 3. Akış sitometrik işaretleyicidir <ol><li> Lökosit sayımı ve izole sonra, klinik bir santrifüj 1500 rpm (600 verdi), 3 dakika boyunca hücrelerinin dönerler . </li><li> Aşağıdaki içeren tampon engelleme pelletini tekrar: 2.4G2 hibridoma (Fc blok; anti-CD16/32) supernatant FACS tampon, 10:05:01 'lik bir oran fetal sığır serumu ve 4 30 dakika boyunca inkübe ° C . </li><li> Hazırlayın ve 4 1:200 ve inkübe bir konsantrasyon az 30 dakika süreyle bloke hücreleri ° C karanlıkta konjuge ekstrasellüler antijenlere karşı antikorlar ekleyin. Leke ve 200 ul hücreler, bir 96-iyi V-alt plaka kuluçkaya yatmaktadır. Uygun kontroller gerekli lekesiz hücreleri ve florokrom tazminat örnekleri, içerir. </li><li> 96-kuyucuğu rotor uygun bir klinik santrifüj 1500 rpm (600 verdi) 3 dakika RT boyanan hücrelerin dönerler. </li><li> Süpernatantı aspire ve hücreleri hafifçe aşağı yukarı 3 kez pipetleme ve 200 ul FACS tampon ile yıkayın. </li><li> Yukarıdaki yıkama tekniği iki kez tekrarlayın. </li><li> Yıkandıktan sonra,% 2 paraformaldehid FACS tüplerine transfer hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. Fixation Biyogüvenlik Seviye 2 reaktiflerin enfekte hücreleri akım sitometri analizi için gereklidir. </li><li> Değiştirilmiş bir akım sitometri yöntemi 8 BD FACS Calibur sabit hücreler çalıştırın ve çevrimdışı FlowJo, WinMDI veya diğer mevcut flow sitometri analiz yazılımı kullanarak dosyaları analiz. </li><li> Örnek başına 50-100,000 olayların analizi genellikle yeterli işaretleyicidir için gereklidir. </li></ol> Bu deneyde kullanılan doğrudan konjuge antikorları: CD45 klon 30-F11 ile tespit edildi. Ly6C / G klon Gr1, RB6-8C5 ile tespit edildi. CD11b klonu M1/70 ile tespit edildi. F4/80 klonu BM8 ile tespit edildi. 4. Temsilcisi Sonuçlar: Biz 24 saat sonrası enfeksiyon (Şekil 3) fare BILs için hücre fenotipleme sonuçları göstermektedir. Lökositler, bağışıklık hücreleri algılamak için PerCP-konjuge anti-fare CD45 ile boyandı, PE-konjuge anti-fare Ly6C / G hücreleri algılamak için inflamatuar monositler, APC-konjuge anti-fare CD11b ve APC-konjuge anti-fare F4/80 tespit etmek için monosit soy. BD FACS Calibur enstrüman analizi yapıldı. <img src="/files/ftp_upload/2747/2747fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Enjeksiyon yerinde Anatomik lokalizasyon. Enjeksiyon yerinde bregma için ön 1 mm ve sağ tarafta sagital sütür 1 mm lateralinde yer alır. <img src="/files/ftp_upload/2747/2747fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Lökositler ve BILs degrade ayrılması İllüstrasyon lökositler başlangıçta doğrudan miyelin enkaz katmanı altında ve Percoll degrade RBC pelet üzerinde toplanır. Ficoll degrade arayüzünde beyaz, kabarık bir katman (BILs) toplanır. <img src="/files/ftp_upload/2747/2747fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. 24 saat sonrası enfeksiyon Fare lökositlerin beyin infilatrating lökositlerin immünfenotip beyin doku intrakranial enfeksiyon sonrası 24 saat hayvanlar hazırlanan homojenatlarında ayırıcı yoğunluğu santrifüj tarafından izole edilmiştir. Hücreler fare CD45 karşı floresan-konjuge antikor ile boyandı, Ly6C / G, CD11b ve F4/80. İlk yolluk forward scatter (FSC), hücre boyutu bir göstergesi (C) karşı CD45, bağışıklık hücreleri için bir belirteç, komplo yapıldı. CD45 hi (A, D), CD45 lo (B, E), ve CD45 negatif (F, G) popülasyonları ardından monosit ve makrofaj belirteçlerinin Ly6C / G, F4/80 (A, B, göreceli ekspresyon düzeyleri incelendi F) ve CD11b (D, E, G). Ly6C / G + F4/80 + CD11b + inflamatuar monositler çevreden bu hücrelerin infiltrasyonu ile tutarlı CD45 yüksek nüfus (A, D), neredeyse sadece bulundu. Buna karşılık, Ly6C/G-F4/80 lo CD11b + makrofajlar CD45 lo (B, E) ve CD45 negatif (G), yerleşik fenotip ile tutarlı nüfus, neredeyse sadece bulundu . Sayısız deneylerde, CD45 hi bulaşmamış veya sahte-enfeksiyon beyin hücreleri veya Ly6C / G + F4/80 + CD11b + inflamatuar monositler asla riayet varTed fareler (veriler gösterilmemiştir).

<ol><li>Buenz, E. J., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picornaviruses+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Picornaviruses and cell death.</a> Trends Microbiol. 14, 28-36 (2006).</li>
<li>Buenz, E. J., Limberg, P. J., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+3-parameter+flow+cytometry-based+cell+death+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A high-throughput 3-parameter flow cytometry-based cell death assay.</a> Cytometry A. 71, 170-173 (2007).</li>
<li>Deb, C., Lafrance-Corey, R. G., Zoecklein, L., Papke, L., Rodriguez, M., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demyelinated+axons+and+motor+function+are+protected+by+genetic+deletion+of+perforin+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropath.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Demyelinated axons and motor function are protected by genetic deletion of perforin in a mouse model of multiple sclerosis.</a> J. Neuropath. Exp. Neurol. 68, 1037-1048 (2009).</li>
<li>Deb, C., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKG2D+contributes+to+efficient+clearance+of+picornavirus+from+the+acutely+infected+murine+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">NKG2D contributes to efficient clearance of picornavirus from the acutely infected murine brain.</a> J. Neurovirol. 14, 261-266 (2008).</li>
<li>Donovan, J., &amp, P. B. rown, , P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Euthanasia%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Euthanasia.</a> Current Protocols in Neuroscience. , A.4H.1-A.4H.4 (2005).</li>
<li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Handling+%26+restraint%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Handling & restraint.</a> Current Protocols in Immunology. 73, 1.3.1-1.3.6 (2006).</li>
<li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parenteral+injections%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Parenteral injections.</a> Current Protocols in Neuroscience. , A.4F.1-A.4F.9 (2005).</li>
<li>Holmes, K. L., Otten, G., Yokoyama, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+analysis+using+Becton+Dickinson+FACS+Calibur%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry analysis using Becton Dickinson FACS Calibur.</a> Current Protocols in Immunology. , 5.4.1-5.4.22 (2002).</li>
<li>Howe, C. L., Ure, D., Adelson, J. D., LaFrance-Corey, R., Johnson, A., Rodriguez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T+cells+directed+against+a+viral+peptide+contribute+to+loss+of+motor+function+by+disrupting+axonal+transport+in+a+viral+model+of+fulminant+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">CD8+ T cells directed against a viral peptide contribute to loss of motor function by disrupting axonal transport in a viral model of fulminant demyelination.</a> J Neuroimmunol. 188, 13-21 (2007).</li>
<li>Lipton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theiler%27s+virus+infection+in+mice%3A+An+unusual+biphasic+disease+process+leading+to+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Theiler's virus infection in mice: An unusual biphasic disease process leading to demyelination.</a> Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).</li>
</ol>

Biz rutin beyin infiltre hücre hazırlama kalitesini belirlemek için flow sitometri ve bağışıklık hücrelerini 2, 9 farklı nüfusu ayırt etmek. Akut zaman noktalarında, BILs yöntemi CD45hi CD45lo nüfus makrofajların yanı sıra yüksek oranda nüfus içinde yüksek oranda inflamatuar monositlerin verir. Bu, beynin içinde bir tekrarlanabilir immün yanıt sağlam yöntemi ile karakterize edilebilir olduğunu gösterir. Bu tekniği fare beyin bağışıklık hücreleri iyi karakterize nüfus gerektiren de...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> TMEV </td><td> Howe Lab. </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Daniel&#39;in en gerginlik </td><td> Invitrogen </td><td> 21063-029 </td><td></td></tr><tr><td> izofluran </td><td> Novaplus </td><td> NDC 0409-3292-49 </td><td></td></tr><tr><td> yuvarlak alt Oak Ridge santrifüj tüplerine </td><td> Nalgene </td><td> 3118-0030 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-02 </td><td></td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> Roche </td><td> 11666789001 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll-Paque Plus </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1440-02 </td><td></td></tr><tr><td> Tripan Mavi 0.4% (w / v) </td><td> Mediatech </td><td> 25-900-CI </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml konik tüpler </td><td> BD Falcon </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 7 ml&#39;lik cam Pyrex marka Tenbroeck doku değirmeni </td><td> Balıkçı </td><td> 08-414-10B </td><td></td></tr><tr><td> 40 mikron hücre süzgecinden </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml konik </td><td> BD Falcon </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> sığır serum albumini </td><td> Sigma </td><td> A9647 </td><td></td></tr><tr><td> sodyum azid </td><td> Sigma </td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> CMF-PBS </td><td> Mediatech </td><td> 21-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> FACS borular </td><td> BD Falcon </td><td> 352054 </td><td></td></tr><tr><td> fetal sığır serumu </td><td> Sigma </td><td> F4135 </td><td></td></tr><tr><td> 2.4G2 hibridoma </td><td> ATCC </td><td> HB-197 </td><td></td></tr><tr><td> Costar V-alt plaka </td><td> Corning </td><td> 3894 </td><td></td></tr><tr><td> Allegra X-22R santrifüj veya eşdeğeri </td><td> Beckman </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> 96-plaka kova ve rotor </td><td> Beckman </td><td> S2096 </td><td></td></tr><tr><td> Sabit açılı rotor </td><td> Beckman </td><td> F0360 </td><td></td></tr><tr><td> paraformaldehid </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> BD FACS Calibur </td><td> BD Biosciences </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> FlowJo 7.5 </td><td> Tree Star, Inc. </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> CD45 </td><td> BD Biosciences </td><td> 557235 </td><td> klon: 30-F11 </td></tr><tr><td> Gr1 (Ly6C / G) </td><td> BD Biosciences </td><td> 553128 </td><td> klon: RB6-8C5 </td></tr><tr><td> CD11b </td><td> ebiosciences </td><td> 17-0112-83 </td><td> klon: M1/70 </td></tr><tr><td> F4/80 </td><td> ebiosciences </td><td> 17-4801-82 </td><td> klon: BM8 </td></tr></tbody></table>

beyin-infiltre lökositler izolasyonu

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

Biz farelerin beyin infiltre lökositler (BILs) hazırlamak için bir metodu tanımlar. Biz tüm beyin hücrelerinin infiltre bir lökosit zenginleştirilmiş nüfus nasıl arındırmak için hızlı bir intrakraniyal enjeksiyon tekniği ile Theiler fare ensefalomiyelit virüsü (TMEV) ile enfekte fareler nasıl gösterilmektedir. Kısaca, fare, kapalı bir odasında izofluran ile anestezi ve serbest el frontal korteksin içine Hamilton şırınga ile enjekte edilir. Fare sonra bir Tenbroeck doku değirmeni ile RPMI ayıklanır ve homojenize izofluran doz aşımı ve bütün beyinleri tarafından enfeksiyondan sonra değişik zamanlarda öldürüldü. Beyin homojenatlarında miyelin ve diğer hücre enkaz kaldırmak için sürekli% 30 Percoll degrade ile santrifüj edilir. Hücre süspansiyonu daha sonra 40 mikron gergin, yıkanmış ve süreksiz Ficoll-Paque Plus degrade santrifüj lökosit seçin ve arındırmak için. Lökosit sonra yıkanır ve flow sitometri ile işaretleyicidir için uygun tamponlar yeniden süspanse. Flow sitometri, enfeksiyonun erken aşamalarında C57BL / 6 farelerde doğuştan gelen bağışıklık hücreleri bir nüfusa ortaya koymaktadır. 24 saat enfeksiyonu, bağışıklık hücrelerinin birden fazla altkümelerini Gr1 +, CD11b + ve F4/80 + hücreler zenginleştirilmiş bir nüfusa sahip, BILs mevcut . Bu nedenle, bu yöntem, beyinde akut enfeksiyon bağışıklık yanıtı karakterize yararlıdır.

Fare beyni infiltre lökositler elde etmek için hızlı bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, sürekli Percoll degrade ve süreksiz Ficoll degrade lökosit zenginleştirilmiş katmanı seçin ve arındırmak için kullanır. İzole lökositler akım sitometrik ölçümleri ile karakterize olabilir.

Beyin-infiltre lökositler izolasyonu

Farelerden beyne infiltre olan lökositlerin (BIL'ler) hazırlanması için bir yöntem tanımlıyoruz. Farelerin Theiler fare ... ile nasıl enfekte edileceğini gösteriyoruz.

Bu prosedürün genel amacı, akut olarak thyer mirroring encephalomyelitis virüsü veya TMEV ile enfekte edilmiş farelerin beyinlerinden lökosit açısından zenginleştirilmiş bir doğal bağışıklık hücresi popülasyonu elde etmektir. Bu işlem, öncelikle farelere intrakraniyal olarak TMEV enfeksiyonu uygulanarak gerçekleştirilir. Ardından, enfeksiyondan 24 saat sonra beyin hasat edilir ve nazikçe homojenize edilir.Prosedürün üçüncü adımı, lökositce zenginleştirilmiş hücre tabakasını seçici olarak saflaştırmak için sürekli bir perca ve kesikli bir fol gradyanı kullanmaktır. Nihayetinde, beynin akut enfeksiyonuna karşı gelişen bağışıklık yanıtında rol oynayan beyne sızan lökosit popülasyonunun fenotipi, akış sitometrik analizi ile karakterize edilebilir. Merhaba, ben Dr. Charles Howe.Bugün göstereceğimiz yöntem, nöroimmünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Örneğin, akut enfeksiyon sırasında beyne sızan bağışıklık hücreleri nelerdir? Yöntemi bugün Reagan, la Francele gösterecek.Laboratuvarımdaki kıdemli araştırma teknoloğu Corey, beyne sızan lökositleri ortaya çıkarmak için şu adımları izler. Otomatik bir mililitrelik Hamilton şırıngasına 27 gauge bir iğne takın ve şırıngayı 10 µL'ye ayarlayın. Hava kabarcıklarına dikkat ederek, 2 × 10⁵ PFU TMEV Daniel suşu ile enfekte edilmiş 10 µL DMEM veya 10 µL sham enfekte DMEM'i şırıngaya çekin.Beş ila altı haftalık bir fareyi anestezi altına alın ve anestezi altındayken ayak parmağı sıkıştırma yöntemiyle sedasyonu doğrulayın. Kafatası üzerindeki frontal korteks bölgesinde uygun koordinatların hızla belirlenmesiyle fareyi enjeksiyona hazırlayın; enjeksiyonu gerçekleştirmek için iğne ucunu her iki AE'ye uygun şekilde yönlendirin, iğneyi kafatasına dik açıyla yerleştirin ve kemik örtüsünden yaklaşık 3 mm derinliğe kadar bastırın. Viral enfekte DMEM veya şam enfekte DMEM'i beyne aktarmak için Hamilton şırıngasının butonunu aşağı bastırın ve ortamın beyne girmesi için geri çekmeden önce iki saniye bekleyin.İğneyi dikkatlice çıkarın ve fareyi temiz, kuru bir kafese yerleştirin. Fareler anesteziden hızla uyanacak ve intrakraniyal viral veya sham enfeksiyonundan 24 saat sonra, bir dakika içinde normal fonksiyonlarına döneceklerdir. Beyin infiltre lökositlerinin izolasyonundan önce, yuvarlak tabanlı bir Oakridge santrifüj tüpünü 10 mililitre RPMI 1640, 9 mililitre percoll ve 1 mililitre 10X PBS ile doldurun ve tüpü oda sıcaklığında saklayın.FI call pack plus'ı oda sıcaklığına getirin ve 15 mililitrelik konik bir tüpü beş mililitre RPMI ile doldurup aynı anda bu tüpü BUZ üzerine yerleştirin. Hayvanı modifiye izofloran doz aşımıyla sakrifiye ettikten sonra beyni hızla çıkarın ve beş mililitre RPMI içeren 15 mililitrelik konik tüpe yerleştirin. Ardından beyni ve RPMI çözeltisini yedi mililitrelik cam Pyrex marka, 10 brook doku parçalayıcıya aktarın ve beyni 10 ila 15 darbeyle nazikçe homojenize edin.Ardından, homojenizatöre beş mililitre daha RPMI ekleyin ve çözeltiyi pipetle iki kez aşağı yukarı çekerek karıştırın. Yaklaşık 10 mililitre beyin homojenatını daha önce hazırlanmış yuvarlak tabanlı tırtıklı santrifüj tüpüne aktarın ve karıştırmak için tüpü iki ila üç kez yavaşça tersyüz edin. Şimdi, beyin homojenatını sabit açılı rotorlu bir santrifüj cihazında oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 7.800 G'de döndürün.Santrifüjden sonra, gradyanın üst kısmına çıkan miyelin kalıntılarını uzaklaştırın. Lökosit tabakası, eritrosit peletinin üzerinde yüzecektir. Lökosit tabakasını 40 µm'lik bir hücre süzgeci aracılığıyla 50 mL'lik konik bir tüpe süzün.Çözeltiyi 50 mililitre hacme tamamlayın. Seyreltilmiş hücre süspansiyonunu içeren tüpü, klinik bir santrifüjde 600 Gs'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Oda sıcaklığında, süpernatanı aspire edin ve hücre peletini toplayın.Pelleti bir mililitre FACS tamponunda yeniden süspande edin ve hücre süspansiyonunu beş mililitrelik yuvarlak tabanlı bir FACS tüpüne ekleyin. Süspansiyonların altına dikkatlice bir mililitre oda sıcaklığında FiCell Pack+ ekleyin; FACS tüplerini klinik santrifüjde 800 ×g'de 25 dakika boyunca santrifüjleyin.Oda sıcaklığında, bekleme yapmadan, arayüzdeki beyaz tüylü tabakayı bir mililitrelik pipet ile alın ve tabakayı yeni bir beş mililitrelik fax tüpüne aktarın. Hücreleri dört mililitre fax tamponu ile yıkayın. Şimdi hücreleri çöktürmek için tüpü klinik santrifüjde tekrar döndürün.Ardından süpernatantı aspire edin ve hücre pelletini toplayın. Lökosit pelletini bloklama tamponunda yeniden süspande edin ve buz üzerinde tutun. Daha sonra hücreleri sayın.Beyne sızan lökositler izole edilip sayıldıktan sonra, akış sitometrik immünofenotipleme hazırlığı için hücreleri V tabanlı bir plakaya yerleştirin. Ardından hücreleri klinik bir santrifüjde döndürün.Pelleti 200 µL bloklama tamponunda yeniden süspande edin ve hücreleri buz üzerinde 30 dakika inkübe edin. Ardından, 1/200 konsantrasyonda antikor ekleyin ve hücreleri bu kez karanlıkta, buz üzerinde 30 dakika daha inkübe edin. Son olarak, boyanmış hücreleri klinik santrifüjde döndürün ve süpernatantı aspire edin.Pellete 200 µL fax tamponu ekleyin ve pipetle üç kez nazikçe aşağı yukarı karıştırın. Ardından hücreleri santrifüjle aynı şekilde iki kez daha yıkayın; son yıkamadan sonra hücreleri %2'lik paraformaldehit ile nihai konsantrasyonda yeniden süspanse edin ve boyanmış hücreleri fax tüplerine aktarın. Son olarak, fikse edilmiş hücreleri akış sitometrisi için gönderin ve dosyaları bir fax analiz programı kullanarak çevrimdışı analiz edin.Fare lökositleri, intrakraniyal enfeksiyondan 24 saat sonra hayvanlardan hazırlanan doku homojenatının diferansiyel yoğunluk santrifüjasyonu ile beyinden izole edildi. Bu iki nokta grafiğinde görüldüğü üzere, LY6CG pozitif, F4/80 pozitif, CD11b pozitif inflamatuar monositler, bu hücrelerin periferden infiltrasyonuna paralel olarak neredeyse tamamen CD45 yüksek popülasyonda tespit edildi. Buna karşılık, LY6CG negatif, F4/80 düşük, CD11b pozitif makrofajlar, resident bir fenotiple uyumlu olarak neredeyse tamamen soldaki iki paneldeki CD45 düşük ve en sağdaki paneldeki CD45 negatif popülasyonlarda bulundu.Bu videoyu izledikten sonra, akut enfeksiyon geçirmiş hayvanların beyinlerinden lökositlerin nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmanız gerekir.

isolation-of-brain-infiltrating-leukocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video sıçanlarda deneysel otoimmün ensefalomyelit ile merkezi sinir sistemi mononükleer hücreleri izole etmek için nasıl göstermektedir.

EAE Ratlarda Merkez Sinir Sistemi Mononükleer Hücreleri İzolasyon

Mevcut makalede, verimli, etkin bir şekilde akışını sitometrik analizler için kullanılabilir beyin ve omurilik dokularında mononükleer hücreleri izole etmek için hızlı bir protokol tanımlamaktadır.

Beyin ve Omurilik Mononükleer Hücreleri İzolasyon Percoll Degradeler

Bu videoda, yoğunluk gradyanlı santrifüjleme kullanarak bir farenin beyninden mononükleer hücrelerin izolasyonunu gerçekleştiriyoruz. İzole edilmiş mononükleer hücre süspansiyonu, daha fazla aşağı akış analizi için kullanılabilir.

Fare Beyninden Mononükleer Hücre İzolasyonu: Beyinde Yerleşik Mononükleer Hücreleri İzole Etmek İçin Bir Yoğunluk Gradyanlı Santrifüj Tekniği

Video, tümöre sızan periferik kan mononükleer hücrelerinin mekanik ayrışma ve enzimatik sindirim kullanılarak bir fare beyninden izolasyonunu göstermektedir. Bunu, daha fazla analiz için bağışıklık hücrelerini toplamak için yoğunluk gradyan santrifüjlemesi takip eder.

Murin Beyninden Tümör İçeren Bağışıklık Hücrelerinin İzole Edilmesi

Beyin kan damarlarının gelen yapışık inflamatuar lökositlerin izolasyonu için bir...

Den Beyin sekestre Lökositler İzolasyonu ve Analizi<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-enfekte Fare

Inme sonrası beyin miyeloid hücreler karakterizasyonu optik parçalama yöntemi kullanılarak stereolojinin tarafından gerçekleştirilen, ya da beynin bir akım sitometri ile süspansiyonları lökosit olabilir. Her ikisi de iskemik beyin bulundu ana miyeloid hücre alt doğru fenotipik ayrımı gerçekleştirmek için yararlı teknikler vardır.

Geçici veya kalıcı Serebral İskemi Modelinde lökosit alt popülasyonlarının Stereolojik ve Sitometrisi Karakterizasyonu

İnflamasyon, iskemik inme patogenezinde merkezi bir rol oynar. Artan kanıtlar, erken beyin hasarını şiddetlendiren iki ucu keskin bir kılıç gibi davrandığını, ancak aynı zamanda daha sonraki onarıma da katkıda bulunduğunu göstermektedir. Bu protokol, immün hücrelerin iskemik beyinden izolasyonunu ve müteakip akış sitometrik fenotiplemesini tanımlar.

İskemik Fare Beyin gelen Bağışıklık Hücreleri İzolasyon ve Akım Sitometrisi Analizi

Erken beyin tümörü mikro giren bağışıklık hücrelerinin sayısının ve aktivasyon durumu ile ilgili zamana bağlı nicel verileri verir glioma-infiltre periferik kan mononükleer hücrelerinin izolasyonu ve akım sitometri analizi için bir basit bir yöntem burada sunulmuştur.

İzolasyon ve Glioma-sızmakta periferik kan mononükleer hücrelerinin Akışı Sitometrik Analizi

Bu makale, beyin, omurilik ve meninksler dahil olmak üzere merkezi sinir sistemi içindeki yerleşik ve periferik olarak türetilmiş bağışıklık hücrelerini incelemek için optimize edilmiş iki protokol sunmaktadır. Bu protokollerin her biri, kararlı durum ve enflamatuar koşullar altında bu bölmeleri işgal eden hücrelerin işlevini ve bileşimini belirlemeye yardımcı olur.

İmmün hücrelerin Aşağı Akış Analizi için Merkezi Sinir Sistemi Dokularının ve İlişkili Meninkslerin İzole Edilmesi

Bu çalışmada akım sitometrisi ve izole perfüze edilmiş farelerin beyin koroid pleksusları üzerinde iki farklı geçit stratejisi kullanılmaktadır; Bu protokol, bu beyin yapısını dolduran ana bağışıklık hücresi alt kümelerini tanımlar.

Mikro Disseke Fare Koroid Pleksuslarından İmmün Hücrelerin İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Beyin bozukluklarına karşı bağışıklık tepkisini araştırmak için yaygın bir yaklaşım, bağışıklık hücrelerindeki değişiklikleri analiz etmektir. Burada, murin beyin dokusu ve kafatası kemik iliğinden bağışıklık hücrelerini izole etmek için iki basit ve etkili protokol sağlanmıştır.

Fare Beyninden ve Kafatasından İmmün Hücrelerin İzole Edilmesi

Öğrenin, TMEV ile enfekte farelerden beyin lökositlerini izole etme yöntemini. Sürekli Percoll ve kesikli Ficoll gradyan santrifüjasyonu kullanarak beyne sızan bağışıklık hücrelerini saflaştırın ve akış sitometri ile fenotipleyin.

Beyin-infiltre lökositler izolasyonu

Daha fazla video keşfet