Name: Akson Streç Büyüme: Nöronal Büyüme Mechanotransduction (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Öğrenin, biyoreaktör sistemi kullanarak sinir liflerini uzatma yöntemini. Bu teknik, günde 10 milimetreye kadar sürdürülebilir büyüme hızları sağlar ve sinir gelişimi ile yaralanma tedavileri için önemli bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, NSF KARİYER CBET-0747615 tarafından finanse edildi. Yazarların Dr teşekkür etmek istiyorum. , Rehberlik ve destek için Douglas H. Smith ve David F. Meaney.

1. Akson Streç Büyüme Biyoreaktör Sistemi Genel Bakış <ol><li> Nöronlar deneysel güçleri uygulamak için iki baskın yaklaşım kullanılmıştır. Ilk yaklaşım, kuvvetler tüm nöron (. Chetta, Kye ve ark 2010;. Lindqvist, Liu ve ark 2010 Lu, Franze et al 2006) uygulanır. İkinci yaklaşımda ise, kuvvetler akson büyüme konisi çekerek doğrudan uygulanır. Uzama için yürürlüğe eşikleri belirlemek için, cam iğneler kullanarak, bu ikinci yaklaşım, yeni bir akson (Lamoureux, Heidemann ve ark 2010; O'Toole, Lamoureux ve ark 2008. Bernal, Pullarkat ve ark 2007) model oluşturma kullanılır olmuştur retraksiyon (Dennerll, Lamoureux ve ark 1989; Zheng, Lamoureux ve ark 1991;. Lamoureux, Zheng ve ark 1992) ve akson terminalleri (Siechen, Yang ve ark 2009) nörotransmitter kümeleme analiz etmek. Bu yöntem benzersiz bir doku mühendisliği uzantısı büyük sinir üretmek için geliştirilen otomatik bir Axon Streç Büyüme (ASG) biyoreaktör sistemi (Iwata, Browne ve ark 2006; Pfister, Iwata ve ark 2006) kullanarak oluşturur. Son zamanlarda, biyoreaktör sistemi, gerçek zamanlı olarak mikroskobik ASG (Loverde, Ozoka ve ark 2011) çalışmak için bir minyatür versiyonu geliştirdi . Burada, detay 9 gün protokolü (Tablo 1) şu anda biyoreaktörler hazırlamak ve rutin ASG gerçekleştirmek için kullanabilirsiniz. </li><li> Genel Çalışma: ASG biyoreaktör sistemi biyoreaktör odasına uzanan güçleri ve 3) bir adım motoru uygulamak için otomatik bir doğrusal hareket tablosu nöronlar kültür ve gergin bağımsız şerit (uzunlamasına kuyuları), 2) ile üç ana bileşenden, 1) oluşur streç büyüme (Şekil 1) kontrol yazılımı ile denetleyici sürücü. </li><li> Kısaca, biyoreaktör prototip imalat dikey freze makinesi (Bridgeport, Elmira, NY) kullanarak bir makine atölyesi yapıldı. Biyouyumluluk için, sterilizasyon kolaylığı ve dayanıklılık, iç biyoreaktör bileşenleri, 3 / 8 "polyetheretherketone (PEEK) işlendi Şeffaf polikarbonat ışık mikroskobu ve kültürlerin görüş için izin kapakları için kullanılmıştır. Korozyona dayanıklı 316 paslanmaz çelik vidalar ve eksiksiz bir donanım montaj (McMaster-Carr, Elmhurst, IL). </li><li> Biyoreaktör odasının dış güçlerin manipülasyonuna (Şekil 2) için 3 şerit, şerit boyunca hücreleri manipüle ayarlanabilir çekme blok ve çıkıntılı çekme çubuklar oluşturan uzanan bir çerçeve oluşur . Nöronal kültürler çekme blok (Şekil 2 ve 3) tarafından desteklenen tek Aclar çekme kültür substratlar üzerine kaplanmıştır. Bir tek lamel sabit yüzey germe çerçevesi altında verdiği ve 3 şeritli yayılan. Önce germe, büyüme konisinin uzantısı üzerinden sabit bir yüzey üzerine kaplama nöronların aksonal süreçleri çekme substrat genişletmek gerekir. Akson nüfusu köprü substratlar sonradan çekme blok kontrol deplasman streç uğrayacaktır. </li><li> Otomatik doğrusal hareket tablosu bir delrin hizalama masaya monte edilmiş bir step motor (HT23-397, Uygulamalı Motion Ürünleri, Watsonville, CA) ve doğrusal hareket tablosu (MIPS-2-10-1.0mm, Servo Sistemler, Monteville, NJ) oluşur . . Biyoreaktör odası doğrusal hareket tabloya paralel bir tablo içinde oturtulur. Biyoreaktör odasına uzanan bir adaptör kullanılarak doğrusal hareket tablosu çekme çubuklar bağlanır. </li><li> Step motor sürücü denetleyicisi (Si 2035, Uygulamalı Hareket Ürünler) dahil Si Programlayıcı yazılımı kullanarak çekme substratların manipülasyon kontrol etmek için programlanmıştır. Aksonal streç kez yaşamak (. Pfister, Iwata ve ark 2006 Pfister, Iwata ve ark 2004) aralıklı küçük deplasman adımları bir dizi alarak kademeli bir biçimde uygulanır. Bu bilgisayar kontrollü bir sistem ASG için özelleştirilmiş profilleri programına yeteneği sağlar, ve hafta birkaç gün içinde sürekli deneyler için çok önemlidir. </li></ol> 2. Biyoreaktör Odası hazırlanması <ol><li> Nöron kültürü için tek çekme ve sabit kültür substratları hazırlayın: <ol><li> Çekme kültür substratları 8.5 kesilir Aclar film "x 11" yaprak (33C 2.0 milyon, Yapı Probe, West Chester, PA). Keskin bir bıçak kullanarak yaklaşık 0.5 x 2.5cm yüzeylerde kesme veya her iki tarafta en az 1-2mm boşluk izin şerit genişliği biraz daha kısa. </li><li> 1200 grit zımpara (McMaster Carr) kullanarak her iki taraftan çekme kültür yüzeylerin alt 1 / 3 üncü zımparalayın. Çekme yüzeylerde Zımpara lamel sabit yüzey üzerine çekme substratlar akson büyüme kolaylaştırır. </li><li> Aclar 5 x 7 cm parça Kes veya sabit substrat olarak hizmet (# 4865-1, Beyin Araştırma Laboratuvarları, Newton, MA) 1 numaralı cam lamel kullanın. </li><li> Temizlik incie kültürü seyreltilmiş Alconox çözümü ile yüzeyleri ve saflaştırılmış dH 2 O ile iyice durulayın </li><li> 30 dakika boyunca% 70 etanol daldırma kültür substratları sterilize edin. Substratları steril doku kültürü kaputu içinde kurumaya bırakın. </li></ol></li><li> Biyoreaktör odasına seyreltik Alconox ve otoklav ile sterilize otoklav bir konteyner içinde temizleyin. Otoklav hemen sonra, steril bir kaput transfer ve kurumaya bırakın. </li><li> : Steril davlumbaz, tutkal içinde devam eden kültür substratları Silikon RTV (Dow Corning # 732, McMaster Carr) ve steril pamuk kullanarak biyoreaktör bezlerden (McMaster Carr) uçlu <ol><li> Tam dik pozisyonda, kumlanmamış kısmını çekme blok bacaklar tutkal çekme kültür substratları çekme blok bacaklar. Zımparalanmış kültür yüzeyi ile temasından kaçının. </li><li> Tutkal biyoreaktör odasının altındaki sabit kültürü substrat. </li><li> Yapıştırılmış substratlar karşı kuru bir çubukla hafifçe basılarak fazla tutkal ve hava keseciklerinin çıkarın. </li><li> Biyoreaktör nöronlar için toksik Silikon RTV leaches asetik asit bu yana, kaput içinde nöronal kültürleri tanıtmak için önce 2 tam gün boyunca UV ışık altında kurumaya bırakılır. </li></ol></li><li> 2-3mm zımparalanmış çekme yüzeylerde ve sabit yüzey uçları arasında bir örtüşme ulaşmak için çekme blok bacaklar indirin. Crucial dikkat örtüşme boyutu çok büyükse, çekme substratların ipuçları sabit zemin kapalı saptırmak, ödenmiş olması gerekir; örtüşme (Şekil 3) yayılan akson sayısının azaltılması. </li><li> Biyoreaktör içinde retrakte çekme çubuklar, çekme blok başlangıç ​​pozisyonuna yerleştirin. Büyüme germek için önce çekme çubuklar hareket etmesini önlemek için immobilizasyon vidalarını sıkın. </li></ol> 3. Nöronal Kültürler <ol><li> 10 mcg / ml yüksek molekül ağırlıklı serum substrat arayüzü alanında her sokağın özgür medya poli-d-lisin (kedi # 354.210, BD, Bedford, MA) Havuzu 1mL. Oda sıcaklığında 1 saat süreyle rahatsız uymak çözüm izin ver. DH 2 O, son bir kültür ortamı ile durulayın takip hafifçe 3x durulayın. Pipetleme substrat arayüzü uzak, şerit arka yapılmalıdır. </li><li> E16 sıçan yavru bir Dorsal Kök Ganglia eksplantlar (DRG) yalıtın. Bir stereomikroskopta kullanarak, petri kaplarına kullanarak damla eksplantlar sulandırmak. Zımparalanmış çekme kültür substrat kenarına 100 mcL pipet ve plaka kullanılarak 3-4 eksplantlar toplayın. Bakım plakası küçük bir su birikintisi bir ortam kullanarak çekme substrat kenarında eksplantlar alınmalıdır. Kültür ortamı hat başına 1 ml eksplant hareketini sınırlayan birkaç saat için buharlaşmasını önlemek için yeterli. Medya formülasyon: B-27 + 0.5mm L-Glutamin (Invitrogen, Carlsbad, CA),% 1 FBS-HI (Hyclone, Waltham, MA), 2,5 g / L D-Glikoz (G-7528, Sigma, St ile Neurobasal Louis, MO), 20ng/mL NGF (13.290-010, Invitrogen) ve 20 mcM FDU + 20 mcM üridin mitoz inhibitörleri (F-0503, U-3003, Sigma). </li><li> Kapağı takın ve hücreleri uymak kadar 1 saat veya bir kuluçka biyoreaktör transfer. </li><li> Biyoreaktör eksplantlar dislodgment önlemek için uzak noktada kültür ortamı ile doldurun. Nöronlar sabit bir yüzey üzerine aksonal süreçleri uzatmak 5 gün en az biyoreaktör inkübe edin. </li></ol> 4. Akson Streç Büyüme <ol><li> Biyoreaktör steril bir kaput içinde son hazırlık prosedürleri uğrar: <ol><li> Odası ve kültür ortamı sınırı buharlaşma nemlendirmektir fosfat tamponlu salin ile biyoreaktör içinde rezervuarları doldurun. Bizim sistemde, oyulmuş muhafaza duvarları rezervuar olarak hizmet vermektedir. Alternatif olarak, küçük petri kapaklarının kültür şerit tepesinde çekme blok her iki tarafında yer alabilir. </li><li> Kültür ortamı değiştirin ve kapasite şerit doldurun. Pipetleme substrat arayüzü uzak, şerit arka yapılmalıdır. </li></ol></li><li> Seat biyoreaktör otomatik doğrusal hareket tablo içinde. Deney bir kuvöz içinde çalıştırmak için ise, otomatik doğrusal hareket tablosu olası korozyon nedeniyle nemlendirilmelidir olmamalıdır. </li><li> Çekme çubukların çekme çubuk adaptörü sabitleyin. </li><li> Çekme çubuk adaptörü ile uyum ve sahneye tutturmak için doğrusal hareket tablosu aşamasında jog Si Programcı yazılımı kullanarak. Kolaylık sağlamak için, belirli aralıklarla sahne işlemek için önceden Si Programcı dizileri hazırlamak. </li><li> Çekme blok serbest dolaşımına izin biyoreaktör odasına immobilizasyon vidayı gevşetin. </li><li> Streç kez yaşamak (Pfister, Iwata ve ark 2006) aralıklı küçük deplasman adımları bir dizi başlatarak, kademeli bir biçimde uygulanır . Paradigma, her 172 saniyede bir 2 mikron adımları alarak başlar.24 saat boyunca net 1mm streç. Bir gün sonra, streç oranı yerinden artan ya da azalan bekleme süresi (Tablo 2) şaha kalkmış olabilir. </li><li> ASG başlatılır sonra, medya değişiklikleri genellikle gerekli değildir. Ancak zaman içinde, kültür ortamı genellikle asidik döner ve sarımsı bir renk değişimi ile açıktır. Daha fazla deney gerekiyorsa, eski medya kayan aksonlar travma en aza indirmek için tamamen boşaltılır, ancak yerine sadece kısmen değişti asla. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Aksonal süreçleri, son derece hızlı ve sağlam streç büyüme tabi. Başlangıçta, bu süreç, küçük, seyrek değiştirmeler oluşur (≤ 1mm/day) yavaş uzanan bir dönemi ile başlar. Ilk 24 saat içinde germe, nöronal büyüme yollarının mechanotransduction oluşur, bu sayede nöronların akson silindir ek başlar. Sürekli ASG 24 saat içinde, aksonlar, daha fazla ve daha sık değiştirmeler artan bir tolerans göstermektedir. Genel olarak, aksonlar 1mm/day her 12-24 saat streç oranı (; Pfister, Bonislawski ve ark 2006;. Pfister, Iwata ve ark 2006 Pfister, Iwata ve ark 2004) bir artış dayanabilir. Ancak, çok yakında streç hızının artırılması seçin akson daha hızlı büyümesine neden olabilir ama aynı zamanda kopukluk neden patolojik oklüzyon yol açacaktır. Streç büyüyen aksonlar eğilimi fasiküller mimarisini andıran, demetleri oluşturmak için var. Mevcut protokolleri kullanarak, akson demetleri merkezi, streç yetiştirilen kısmı kültürünü yüzeye yapışıklıklar var. Streç büyüyen aksonlar Sadece başlangıçta yapıştırılır, proksimal ve distal segmentleri kültürünü yüzeye bağlı kalır. Buna göre, streç yetiştirilen aksonları orta kısmında serbestçe yüzen ve kullanımdan dolayı bozulma duyarlıdır. Çeşitli nedenlerle, bazı aksonlar uygulanan streç oranında büyümek değil. Örneğin, iki aksonal süreçleri ile DRG nöron, streç geçiren her ikisi de, yeterli protein çevirmek ve uygulanan gerilme oranı büyümeye mümkün olmayabilir. Uygulanan streç barındıramaz Aksonlar Poisson etkisi ince. Müteakip streç patolojik kopukluk önde gelen aksonlar, inhibe montaj tıkanıklığı neden olacaktır. Akson çoğunluğu, ancak, başarılı bir şekilde ASG geçmesi ve akson sadece küçük bir yüzdesi bu budama gibi sürecinden geçmeleri. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/2753/2753fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 Axon Stretch Büyüme Biyoreaktör Sistemi: (A) Biyoreaktör kültür odası ve Otomatik doğrusal hareket tablo, (B) Adım motor sürücü denetleyicisi ve Si Programlama yazılımı . <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/2753/2753fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 Biyoreaktör Kültür Odası. Bu karikatür kaldırıldı kapaklı üst biyoreaktör odasına gösteriyor. Çekme blok pozisyonu akson streç büyüme son dönem yansıtır. Streç yetiştirilen aksonlar kültür şerit içinde demetler halinde görülebilir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/2753/2753fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Kültür Yüzey Kaplama Arayüzü. Bu karikatür yan görünümden biyoreaktör her kulvarın içinde çekme mekanizmasının bileşenleri gösteriyor. Çekme ve sabit kültür yüzeylerin (Üst) Doğru örtüşmektedir. (Altta) çekme ve sabit yüzeyler aşırı üst üste çekme substrat ucu kıvrılmasına neden olur. Movie 1 Biyoreaktör Odası Kültür Substratlar Eklenti <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie1.mov">video izlemek için buraya tıklayın</a> Movie 2 Çekme Yüzeyler üzerine eksplantlar DRG Kaplama <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie2.mov">video izlemek için buraya tıklayın</a> Film 3 SiProgrammer Kullanımı <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie3.mov">video izlemek için buraya tıklayın</a> Film 4 Sabit Yüzey üzerine Büyüme Koni Uzatma <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie4.mov">video izlemek için buraya tıklayın</a> Film 5 Axon Streç Büyüme <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie5.mov">video izlemek için buraya tıklayın</a> <table border="1"><tbody><tr><td> Gün </td><td> Adım </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Sterilizasyon ve kuruma </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Yapıştırma &amp; Montaj </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Kaplamalar ve Nöronal Kültür Kaplama</td></tr><tr><td> 9 </td><td> Streç Büyüme Başlat </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Deney Programı. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Zaman [saat] </td><td> Streç Oranı [mm / gün] </td><td> Bekleme Süresi [s] </td><td> Toplam Uzunluk [mm] </td><td> Toplam Streç Time [gün] </td></tr><tr><td> Gösteriş </td><td> 24 </td><td> 1 </td><td> 172,8 </td><td> 0 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Germek </td><td> 24 </td><td> 1 </td><td> 172,8 </td><td> 1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Germek </td><td> 24 </td><td> 2 </td><td> 86,4 </td><td> 3 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Germek </td><td> 24 </td><td> 3 </td><td> 57,6 </td><td> 6 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Germek </td><td> 24 </td><td> 4 </td><td> 43,2 </td><td> 10 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Germek </td><td> 24 </td><td> 5 </td><td> 34,6 </td><td> 15 </td><td> 6 </td></tr></tbody></table> (Tablo 2). Streç Rate Programı. Tüm streç adımları deplasman 2 mikron (10 step motor adım = 2 mikron streç).

<ol><li>Bernal, R., Pullarkat, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of axons.</a> Phys Rev Lett. 99, 018301-018301 (2007).</li>
<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Dev Biol. 102, 379-389 (1984).</li>
<li>Chetta, J., Kye, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+dynamics+in+response+to+tensile+loading+of+mammalian+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal dynamics in response to tensile loading of mammalian axons.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 67, 650-665 (2010).</li>
<li>Dennerll, T. J., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytomechanics+of+axonal+elongation+and+retraction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cytomechanics of axonal elongation and retraction.</a> J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).</li>
<li>Fu, S. Y., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+and+molecular+basis+of+peripheral+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The cellular and molecular basis of peripheral nerve regeneration.</a> Mol Neurobiol. 14, 1-2 (1997).</li>
<li>Gray, C., Hukkanen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+neural+growth%3A+calcitonin+gene-related+peptide+and+substance+P-+containing+nerves+attain+exceptional+growth+rates+in+regenerating+deer+antler%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P- containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler.</a> Neuroscience. 50, 953-963 (1992).</li>
<li>Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tension+as+a+regulator+and+integrator+of+axonal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Tension as a regulator and integrator of axonal growth.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 17, 6-10 (1990).</li>
<li>Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tension+as+a+regulator+of+axonal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Mechanical tension as a regulator of axonal development.</a> Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytomechanics+of+axonal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Cytomechanics of axonal development.</a> Cell Biochem Biophys. 27, 135-155 (1995).</li>
<li>Iwata, A., Browne, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+survival+and+outgrowth+of+mechanically+engineered+nervous+tissue+constructs+implanted+into+spinal+cord+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Long-term survival and outgrowth of mechanically engineered nervous tissue constructs implanted into spinal cord lesions.</a> Tissue Eng. 12, 101-110 (2006).</li>
<li>Lamoureux, P., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+elongation+within+and+along+the+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Growth and elongation within and along the axon.</a> Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).</li>
<li>Lamoureux, P., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytomechanical+investigation+of+neurite+growth+on+different+culture+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A cytomechanical investigation of neurite growth on different culture surfaces.</a> J Cell Biol. 118, 655-661 (1992).</li>
<li>Lindqvist, N., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+glial+%28Muller%29+cells%3A+sensing+and+responding+to+tissue+stretch%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinal glial (Muller) cells: sensing and responding to tissue stretch.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1683-1690 (2010).</li>
<li>Loverde, J. R., Ozoka, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Axon+Stretch+Growth+in+Embryonic+and+Adult+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Axon Stretch Growth in Embryonic and Adult Neurons.</a> J. Neurotrauma. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Lu, Y. B., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+properties+of+individual+glial+cells+and+neurons+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17759-17764 (2006).</li>
<li>O'Toole, M., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physical+model+of+axonal+elongation%3A+force%2C+viscosity%2C+and+adhesions+govern+the+mode+of+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth.</a> Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).</li>
<li>Pfister, B. J., Bonislawski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch-grown+axons+retain+the+ability+to+transmit+active+electrical+signals%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Stretch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals.</a> FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).</li>
<li>Pfister, B. J., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+Engineering+Strategies+for+Peripheral+Nerve+Repair%3A+Surgical+Applications%2C+State+of+the+Art%2C+and+Future+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Biomedical Engineering Strategies for Peripheral Nerve Repair: Surgical Applications, State of the Art, and Future Challenges.</a> Crit Rev Biomed Eng. 39, 81-124 (2011).</li>
<li>Pfister, B. J., Iwata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+stretch+growth+of+integrated+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extreme stretch growth of integrated axons.</a> J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).</li>
<li>Pfister, B. J., Iwata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+transplantable+nervous+tissue+constructs+comprised+of+stretch-grown+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons.</a> J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).</li>
<li>Siechen, S., Yang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tension+contributes+to+clustering+of+neurotransmitter+vesicles+at+presynaptic+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mechanical tension contributes to clustering of neurotransmitter vesicles at presynaptic terminals.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12611-12616 (2009).</li>
<li>Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch+growth+of+integrated+axon+tracts%3A+extremes+and+exploitations%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Stretch growth of integrated axon tracts: extremes and exploitations.</a> Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).</li>
<li>Smith, D. H., Wolf, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+strategy+to+produce+sustained+growth+of+central+nervous+system+axons%3A+continuous+mechanical+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">A new strategy to produce sustained growth of central nervous system axons: continuous mechanical tension.</a> Tissue Eng. 7, 131-139 (2001).</li>
<li>Weiss, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+patterns%3A+The+mechanics+of+nerve+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Growth%2C+Third+Growth+Symposium%22%5BJournal%5D)">Nerve patterns: The mechanics of nerve growth.</a> Growth, Third Growth Symposium. 5, 163-203 (1941).</li>
<li>Zheng, J., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensile+regulation+of+axonal+elongation+and+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tensile regulation of axonal elongation and initiation.</a> J Neurosci. 11, 1117-1125 (1991).</li>
</ol>

Nöronal hücrelerin ex vivo mekanik uzama ABD Patent # 6264944 ve 7429267 altında patentli.

İki kritik adımlar biyoreaktörlerin hazırlanması sırasında dikkat edilmelidir. İlk olarak, substrat arayüzü optimal bir örtüşme aksonlar sabit bir yüzey üzerine çapraz sağlamak için gerekli. Aşırı kıvrılmış veya başka bir şekilde kusurlu Aclar (Şekil 3) kullanılmamalıdır. Örtüşme optimize etmek için, çekme substrat 2-3mm uzun temas üzerinden sabit zemin düzgün eşit zımparalanmış ve rehber olduğunu onaylayın. Üst üste çekme bacaklar yüksekliği dikkatlice ayarlayarak her deney öncesinde optimize edilmelidir. İkincisi, nöronların tutturulması için sağlarken, substrat boyalar aksonlar (Pfister, Iwata ve ark, 2004;. Loverde, Ozoka ve ark 2011 Heidemann ve Buxbaum 1990) biyoreaktör ve kontraktil gerginlik değiştirmesinden kaynaklanan önemli Sheering güçlerine dayanma. Substratlar lisin kaplama öncesinde ve sonrasında her iki steril su ile iyice durulanması gerekir. Kaplamalar taze çözülmüş alikotları uygulanan ve mümkün olduğu kadar eşit bir şekilde yayılmış olmalıdır. Yüzeylerde yapışma döneminde önemlisi, hareket ettirilebilir olmamalı veya başka bir şekilde rahatsız. Bir sonraki adımda, kaplama sırasında substratlar ile temasından kaçınmak ve şeritlerinin substrat arayüzü uzak uzak sonundan itibaren tüm çözümler pipetlemeyin. Her biyoreaktör bileşeni bağlantıları toleranslar bolluk şeklinde tezahür edebilir. Otomatik doğrusal hareket tablosu hareketi çekme blok hareketi olmadan oluşur ASG ilk dönemde, sistem bolluk açıktır. Slack Deneme başına değişir, ancak bizim deneyim genellikle &lt;1mm. Bu nedenle, bir &quot;ön-gerilim&quot; 1mm/day, gevşek eliminasyon fazı, bir gün, biyoreaktör parçalar çekme yüzeylerde hareketi sırasında meşgul ve başlamak ASG program önce gelir. Otomatik doğrusal hareket tablosu yerinden adım öncesi gerginlik aşamasından sonra çekme blok yerinden eşleşmiyorsa Sorun Giderme gerekebilir tamamlandı. , Çekme blok Asenkron, yanlış değiştirmeler &#39;stiction&#39; ya da statik sürtünme ve çekme donanım içinde adaptörün esneme ile ilişkilidir. Meydana gelen bu sorunları önlemek için, çekme blok hareketi pürüzsüz yakın zahmetsiz hareketi için, montajdan sonra, el ile kontrol edilmelidir. Bağlama oluşursa, çekme montaj deneye önce serbest olmalıdır. Adaptörün yeterli sertliği de çekme donanım stiction üstesinden gelmek değildir, doğru, eş zamanlı değiştirmeler sağlamak için gerekli.

<table border="1"><tbody><tr><td> Bileşen Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> PolyEtherEtherKetone (PEEK) </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 8504K69 </td><td> Özel biyoreaktör kamara yaptı </td></tr><tr><td> Polikarbonat </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 8574K28 </td><td> Özel biyoreaktör odasına kapak yaptı </td></tr><tr><td> Step motor </td><td> Uygulamalı Hareket Ürünleri, Watsonville, CA </td><td> HT23-397 </td><td></td></tr><tr><td> Doğrusal hareket tablosu </td><td> Servo Sistemler, Montville, NJ </td><td> MIPS-2-10-1.0mm </td><td></td></tr><tr><td> Step motor sürücü denetleyicisi </td><td> Uygulamalı Hareket Ürünleri, Watsonville, CA </td><td> Si2035 </td><td></td></tr><tr><td> Aclar </td><td> Yapısı Probe A.Ş., West Chester, PA </td><td> 1859 </td><td> Çekme kültür yüzeylerde </td></tr><tr><td> No. 1 lamel </td><td> Beyin Araştırma Laboratuvarları, Newton, MA </td><td> 4865-1 </td><td> Yerleşik kültür substrat </td></tr><tr><td> Silikon RTV </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 7587A37 </td><td></td></tr><tr><td> Pamuklu çubuklar </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 7074T62 </td><td></td></tr><tr><td> Poly-D-Lizin </td><td> BD, Bedford, MA </td><td> 354210 </td><td></td></tr></tbody></table>

akson streç büyüme: nöronal büyüme mechanotransduction

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

Presinaptik embriyonik gelişim sırasında, nöronal süreçler, büyüme koni aracılığıyla hedeflerine ulaşmak için kısa mesafelerde hareket. Zamanla, nöronal somata nedeniyle iskelet büyütme organizmanın büyüme (. Gri, Hukkanen ve ark 1992 Weiss 1941) akson terminallerinin ayrılır. Bu mechanotransduction indükler akson sürekli uzama uyum yeteneğine nöronal büyüme ikincil bir mod (Bray 1984; Heidemann ve Buxbaum 1994; Heidemann, Lamoureux ve ark 1995, Pfister, Iwata ve ark 2004). Akson Streç Büyüme (ASG) makul uzun sinirler ve yetişkin sinir sisteminin karakteristik beyaz cevher yollarında kısa embriyonik süreçlerin olgunlaşması merkezi bir faktördür. In vitro ASG çalışma için, biyoreaktörler nöronal kültürlerin kısa aksonal süreçler (Loverde, Ozoka ve ark 2011) gerilim uygulamak için tasarlanmış. Burada, ayrıntılı biyoreaktörler hazırlamak ve ASG yürütmek için kullandıkları yöntemleri. İlk olarak, biyoreaktör her uzanan şerit içinde, nöronlar, bir mikro-manipüle çekme substrat üzerine kaplanmıştır. Sonra, nöronlar sabit bir yüzey üzerine, büyüme konisinin uzantısı ile, onların aksonal süreçleri yeniden. Son olarak, streç büyüme, sabit bir yüzeye yapıştırılır akson terminalleri kaplama hücre gövdeleri uzaklıkta çekme yapılır; büyüme konisinin uzantısı sonra iskelet büyüme yansıtan. Önceki iş uzunlukları 10cm kadar ulaşan, embriyonik sıçan dorsal kök gangliyon nöronları ASG 10mm/day için eşi görülmemiş büyüme oranları kadar yetenekli olduğunu gösterdi, eş zamanlı olarak artan aksonal çaplarda (Smith, Wolf ve ark 2001, Pfister, Iwata ve ark 2004; Pfister, Bonislawski ve ark 2006, Pfister, Iwata ve ark 2006; Smith 2009). Bu rejeneratif büyüme konisinin uzantısı (mekanik uyaranların yokluğunda) büyüme oranları ile ortalama 1mm/day uzunlukları 3cm daha az sınırlı başarılı rejenerasyon (. Pfister, Gordon ve ark 2011 Fu ve Gordon 1997) dramatik bir zıtlık Buna göre, daha fazla çalışma ASG mekanik uyaranların yokluğunda rejenerasyon sınırı düzensiz büyüme mekanizmaları ortaya çıkarmak için yardımcı olabilir.

Akson streç büyüme yansıtan benzersiz bir doku mühendisliği yöntemiyle kültürünün çok sayıda sinir lifleri uzatmak için geliştirilmiştir; sinirleri büyütme vücudun büyüme ile birlikte uzatmak sayede sinir sistemi gelişimine bir form.

Akson Streç Büyüme: Nöronal Büyüme Mechanotransduction

Presinaptik embriyonik gelişim sırasında, nöronal uzantılar büyüme konisi aracılığıyla hedeflerine ulaşmak için kısa mesafeler kat eder. Zamanla, nöronal somalar...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bir nöronun aksonal uzantısına, büyümesini uyarmak ve sürdürmek için çekme kuvveti uygulamaktır. Bu işlem, nöronların bir reaktör tarafından kontrol edilen bilgisayar ortamında, mikro manipülasyonlu bir çekme substratı üzerine ekilmesiyle gerçekleştirilir. Ekimden sonra nöronlar, aksonların büyüme konisi uzanımı yoluyla sabit bir substrat üzerine yayıldığı bir hafta boyunca kültüre edilir.Ardından, plakaya ekilen hücre gövdelerinin, sabit substrata yapışmış akson terminallerinden uzağa çekilmesiyle akson germe büyütme işlemi gerçekleştirilir. Akson germe büyütme doku mühendisliği tekniği, günlük 10 milimetreye kadar sürdürülebilir büyüme hızlarına ulaşabilmekte ve mikroskobik analizlere göre genişlemiş akson demetlerinden oluşan uzun veziküler demetlerle sonuçlanmaktadır. Bu tekniğin büyüme akımı uzatması gibi diğer yöntemlere göre temel avantajı, akson germe büyütmenin akson yollarının istenilen herhangi bir uzunluğa daha kısa sürelerde büyümesine olanak tanımasıdır.Akson gerilme büyümesinin etkileri, sinir büyümesini uyaran biyomekanik sinyalleri yeniden oluşturmamıza olanak tanır. Bu sinyaller, onlardan yararlanmak ve hastalıklı veya hasarlı sinirleri tedavi etmek için yeni stratejiler geliştirmek amacıyla incelenebilir. Dolayısıyla Akson gerilme büyüme yöntemi, sinir sisteminin gelişimi ve korunmasına ilişkin temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Önemli olan, aksonların düşündüğümüzden daha hızlı hızlarda büyümesini sağlayan mekanizmaları keşfedebilmemizdir. Akson germe büyüme biyoreaktör sisteminin üç ana bileşeni vardır. Birincisi, nöronların kültüre edildiği ve gerildiği bir biyoreaktör haznesidir.İkinci olarak, germe kuvvetleri uygulayan otomatik bir lineer hareket tablası. Ve son olarak, germe büyümesini kontrol etmek için yazılıma sahip bir step motor sürücü kontrol ünitesi. Burada protokol, mikroskop altında çalışma kapasitesine sahip minyatürize edilmiş bir sistem kullanılarak gösterilmektedir.Biyoreaktör prototiplerinin üretimi, biyouyumlu olması ve sterilizasyon kültürünün kolaylığı nedeniyle dikey bir frezeleme makinesi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Hazne bileşenleri, korozyona dayanıklı Polieter eter keton'dan işlenmiş ve montajı tamamlamak için üç adet 16 paslanmaz çelik bağlantı elemanı kullanılmıştır. Biyoreaktör kültür haznesi; bir germe çerçevesi, ayarlanabilir bir çekme bloğu, dış manipülasyon için çekme çubukları ile tek kullanımlık çekme ve sabit kültür substratlarını içerir.Otomatik lineer hareket tablası, delrin bir tablanın üzerine monte edilmiş step motorlu bir lineer hareket tablasından oluşur. Step motorla arayüz oluşturan sürücü kontrolörünü programlamak ve izlemek için P si programmer adlı bir yazılım programı kullanılır. LAR filmi yaklaşık 0,5 x 2,5 santimetrelik ince şeritler halinde keserek sürükleme kültürü substratları hazırlayın.Çekme kültür substratlarının alt üçlük kısmını, aksonların çekme substratlardan sabit substrata büyümesini kolaylaştırmak için her iki tarafı 1.200 grit ince zımpara kağıdıyla hafifçe zımparalayın. Bir bölme sekmesi kullanmak, daha eşit zımparalama yapmaya yardımcı olur. Sabit substrat olarak kullanılmak üzere beş çarpı yedi santimetrelik bir LAR parçası kesin veya bir numara cam lameli kullanın.Kültür substratlarını ve biyoreaktör haznesini seyreltilmiş bir Alcan çözeltisi ile temizleyin ve deiyonize su ile iyice durulayın. Kültür substratlarını 30 dakika boyunca %70 etanol içinde bekleterek sterilize edin. Biyoreaktör haznesini otoklavlanabilir bir kap içerisinde otoklavla sterilize edin.Sterilizasyondan sonra, kültür substratlarını ve biyoreaktör haznesini bir doku kültürü kabinine aktarın ve havada kurumaya bırakın. Kültür substratlarının kurutulması için bir pipet ucu kutusu kullanılabilir. Çekme kültür substratlarını steril pamuklu çubuklar kullanarak yerleştirin.Çekme kültür substratlarını çekme bloğu ayaklarına yapıştırın. İnce bir silikon RTV tabakası ile substrat, zımparalanmamış kısma yapıştırılmalı ve zımparalanmış kültür yüzeyi ile temastan kaçınılmalıdır. Ardından, sabit kültür substratını biyoreaktör haznesinin tabanına yapıştırın.Kuru bir pamuklu çubuğu sabit alt tabakanın tabanına hafifçe bastırarak fazla yapıştırıcıyı ve hava kabarcıklarını giderin. Odacığın doku kültürü davlumbazı içinde tam iki gün boyunca kurumaya bırakın. İki gün sonra, standart çekme alt tabakalarının uçları ile sabit alt tabaka arasında iki ila üç milimetrelik bir örtüşme elde etmek için çekme bloğu ayaklarını ayarlayın.Üst üste binme miktarına kritik düzeyde dikkat edilmelidir. Eğer bu alan çok geniş olursa, çekici alt tabakaların uçları sabit alt tabakanın üzerinden sapacak ve üst üste binme alanını kateden akson sayısını azaltacaktır. Çekici bloğu, çekici çubuklar biyoreaktörün içinde geri çekilmiş haldeyken başlangıç konumuna yerleştirin.Çekme çubuklarının hareketini önlemek için sabitleme vidalarını sıkın. Germe büyümesine başlamadan önce, bir doku kültürü kabininde çalışarak her bir şeridin substrat arayüzüne serumsuz ortamda hazırlanmış bir mililitre yüksek molekül ağırlıklı poli-D-lizini çekin. Çözeltinin oda sıcaklığında bir saat boyunca beklemesine izin verin; bir saat sonra üç kez deiyonize su ile durulayın ve ardından kültür ortamı ile son bir durulama yapın. E 16 sıçan yavrularından alınan dorsal kök ganglion eksplantlarını zımparalanmış çekme kültürü substratlarının üzerine yerleştirin.Bir stereo mikroskop kullanarak önce explanı petri kapları içinde damla damla seyreltin ve ardından 100 µL pipet ucuyla üç ila dört yumurta bitkisi toplayın. Yumurta bitkilerini, taşıyıcı substratın kenarında, bir mL'ye kadar kültür ortamından oluşan küçük bir sıvı birikintisinin içine yerleştirin. Ortam, yumurta bitkilerinin hareketini kısıtlarken birkaç saat boyunca buharlaşmayı önlemek için yeterlidir.Biyoreaktörün kapağını kapatın ve patlıcanların yapışması için bir saat boyunca bir inkübatöre aktarın. Bir saat sonra, patlıcanların yerinden oynamasını önlemek için biyoreaktörü, patlıcanlara en uzak noktadan kültür medyası ile doldurun. DRG nöronlarının sabit substrat üzerine aksonal uzantılar geliştirmesini sağlamak için biyoreaktörü beş gün boyunca inkübe edin.Doku kültürü kabini içerisinde, hazneyi nemlendirmek ve medyumun sınırlı düzeyde buharlaşmasını önlemek için biyoreaktör rezervuarlarını fosfat tamponlu salin ile doldurun. Biyoreaktör kanallarını tam kapasite dolacak şekilde doldurarak son bir medyum değişimi gerçekleştirin. Biyoreaktörü, nemlendirilmemiş bir inkübatör içindeki otomatik lineer hareketli tablaya yerleştirin.Çekme çubuğu adaptörünü çekme çubuklarına sabitleyin. Cy programlayıcı yazılımını kullanarak, lineer hareket tablasındaki sahneyi çekme çubuğu adaptörüyle hizalamak için hareket ettirin ve kolaylık sağlamak amacıyla sahneye sabitleyin.Sahneyi belirli artışlarla hareket ettirebilmek için programcı dizilerini önceden hazırlayın. Axon Stretch büyüme programını başlatmadan önce, biyoreaktör haznesindeki sabitleme vidalarını gevşetin. Germeler, dinlenme süreleriyle ayrılmış bir dizi küçük yer değiştirme adımı alınarak basamaklı bir şekilde uygulanır.Bu paradigma, ön gerilimi takip eden ilk 24 saat boyunca net bir milimetre uzama sağlayacak şekilde, her 172 saniyede bir iki mikronluk adım atılarak başlar. Bir gün sonra, yer değiştirme adım boyutu artırılarak veya dinlenme süresi azaltılarak uzama hızı hızlandırılabilir. Akson uzama büyüme sürecinin temsili sonuçları burada gösterilmiştir.Ekili implantlar içindeki ilk hücreler, çekme substratı üzerine göç eder. Sonraki beş gün boyunca, büyüme konileri durağan substrat üzerine aksonal uzantılar geliştirir. Büyüme konileri durağan substrat üzerinde en az bir milimetre uzadığında, akson germe büyümesi başlatılır.Çekme substratı, AED büyüme konilerinden uzaklaştırılır. Bir dizi adım boyunca, gerilen açıklık axonlarının elastikiyeti hemen belirginleşir. Tipik olarak, axonlar başlangıçta incelir ancak birkaç saat içinde, çaplarını geri kazandıkları ve korudukları bir büyüme evresine girerler. 24 saatlik sürekli gerilme büyümesinin ardından, axonlar gerilmeye karşı artan bir tolerans gösterirler ve gerilme hızındaki artışları sürdürebilirler.Aksonlar daha da uzayıp FAS dolaşıma girdiğinde, gerilmeye karşı artan bir tolerans gösterirler. Burada, biyoreaktöre elle kasıtlı olarak çarpıldığında, gerilme ile büyütülmüş aksonların yüzdüğü belirgin şekilde görülmektedir. Bazı durumlarda, yetersiz adezyon nedeniyle aksonlar sabit substrattan ayrılabilir.Bu, en yaygın hata türüdür ve büyük olasılıkla başlangıç adım boyutunun çok büyük olması veya sabit substratın yetersiz kaplanması durumunda meydana gelir. Burada, adım boyutunun çok büyük olması nedeniyle, germe büyümesinin başlatılmasıyla birlikte aksonların bir kısmı sabit substrattan ayrılır. Bu prosedürü uygularken, substrat ara yüzeyini hazırlarken acele etmemek önemlidir.Parmak ucu ve substrat, sabit substratı iki ila üç milimetre boyunca örtmelidir ve germe büyümesi gerçekleşirken DRG, arayüze mümkün olduğunca yakın şekilde ekilmelidir. Canlı floresan problar kullanarak veya gen ekspresyonunu incelemek amacıyla hücreler gerilirken onları lizleyerek akson büyümesini incelemek için eşsiz bir fırsatınız olacak. Bu videoyu izledikten sonra, akson büyümesini teşvik etmek için uygulanan gerilimin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olacaksınız.Bu tekniği kullanarak, aksonların tahmin ettiğimizden daha hızlı büyüme ve başka hiçbir yolla sağlanamayacak bağlantılar kurma konusunda şaşırtıcı bir kapasiteye sahip olduğunu keşfediyoruz.

axon-stretch-growth-the-mechanotransduction-of-neuronal-growth

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

2000-1000 microdyne aralığında nöronların kuvvet uygulanması ve doğrudan ölçümler kalibre cam iğneler kullanılarak yüksek hassasiyet ile elde edilir. Bu metodoloji aksonal başlatılması, aksonal gerginlik, aksonal uzama hızı, ve kuvvet vektörleri aksonal geliştirme de dahil olmak üzere çeşitli yönleri, kontrol etmek ve ölçmek için kullanılabilir.

Nöronlar Aksonal Geliştirme Kontrol Mekanik Manipülasyon

Canlı Gram-negatif ve Gram-pozitif bakterilerin jelatin kaplı mika üzerinde hareketsiz ve Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) kullanarak sıvı görüntülü olabilir.

Atomik Kuvvet Mikroskopi Görüntüleme Bakteriyel İmmobilizasyon

Bu makalede kompleks anizotropik çift eksenli mekanik deformasyona karşı tek bir hücre yanıtları araştırmak ve biyolojik dokuların mekanik özelliklerini ölçmek için kullanılabilen yeni bir germe platformu sunmak.

Hücre ve Doku mechanobiology Applications A Novel Germe Platformu

Canlı hücrelerdeki mekanik zorlanmaya gerçek zamanlı tepkilerin ölçülmesine izin vermek için özel bir motor tahrikli mekanik aktüatör kullanılarak yeni bir görüntüleme protokolü geliştirilmiştir. Mekanobiyoloji ile ilgili olarak, sistem konfokal veya atomik kuvvet mikroskobu ile neredeyse gerçek zamanlı görüntülemeye izin verirken %20'ye kadar suşlar uygulayabilir.

Mekanik Stretch sırasında Canlı Hücre Görüntüleme

Bu protokol, sıçanlardan izole edilen dorsal kök ganglion (DRG) nöronlarının izolasyonunu ve akson hizalamasını geliştirmek için statik önceden gerilmiş bir hücre kültürü sistemi üzerinde DRG nöronlarının kültürünü ve ardından miyelinasyonu teşvik etmek için Schwann Hücrelerinin (SC'ler) ko-kültürünü tanımlar.

Bir Yaklaşım sırt kök ganglion nöronlar hizalama ve myelinizasyondur Artırma

Bu prosedür, nevrit uzamasını yönlendiren mikropipetlere sabitlenmiş poli-D-lizin kaplı boncuklar kullanarak mikroakışkan odacıklar içerisinde düzenlenen nöritlerin hızla nasıl başlatılacağını, genişletileceğini ve bağlanacağını açıklamaktadır.

Yeniden Yönlendiren Sinir Devreleri: Hızlı Neurit Uzatımı ve Fonksiyonel Sinir Bağlantısı İçin Yeni Bir Yöntem

Daha önce tasarlanmış bir cihazı kullanarak bağlı hücrelere mekanik gerilme uygulamak için, bu yazıda bir yeniden tasarlanan substratum geometrisi ve 100 x yağ daldırma amacı ile gergin hücrelerin yüksek çözünürlüklü tek hücreli görüntüleme için özelleştirilmiş bir cihaz açıklanmaktadır.

Tek eksenli çekme gerinim altında canlı hücrelerde nükleer dinamiklerin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi

Bu protokol, in situ akson büyümesi ve büyüme konisi dinamiklerini incelemek için basit ve sağlam bir yöntem göstermektedir. Fizyolojik olarak ilgili akut beyin dilimlerinin ex vivo olarak nasıl hazırlanacağını açıklar ve kullanıcı dostu bir analiz boru hattı sağlar.

Yerinde Akut Ex Vivo Embriyonik Beyin Dilimi Kültürlerinde Akson Büyümesi ve Büyüme Koni Dinamiğinin Görselleştirilmesi

İlerlemek için, büyüme konileri dış ortama karşı çekiş kuvvetleri uygulamalıdır. Çekiş kuvvetlerinin üretimi akin dinamiklerine ve debriyaj kavramasına bağlıdır. Bu çalışmada büyüme konisi ilerlemesi için akin dinamiklerini, debriyaj kavramasını ve çekiş kuvvetlerini analiz etme yöntemleri açıklanmaktadır.

Büyüme Konisi İlerlemesi için Actin Dynamics, Debriyaj Kavrama ve Çekiş Kuvveti Analizleri

Burada, pnömatik olarak çalıştırılan ve yüksek çözünürlüklü mikroskopi ile uyumlu çok yönlü bir eşbiaksiyel germe cihazı sunuyoruz.

Yüksek Büyütmeli Canlı Hücre Konfokal Floresan Mikroskobu için Equibiaxial Germe Cihazı

Burada, hücrelere izotropik ve tek eksenli dalga formları uygulayan, aynı zamanda ayarlanabilir sertliğe ve özelleştirilebilir protein matrislerine sahip substratlar üzerinde kültürü destekleyen yeni bir cihaz sunuyoruz. Bu basit ve ekonomik platform, araştırmacıların mekanik ipuçlarının hem temel çalışmalarda hem de hastalıkla ilgili bağlamlarda hücresel fonksiyonu nasıl düzenlediğini araştırmalarını sağlar.

In Vitro Hücresel Esneme ve Görüntüleme İçin Yeni Bir Platform

Öğrenin, biyoreaktör sistemi kullanarak sinir liflerini uzatma yöntemini. Bu teknik, günde 10 milimetreye kadar sürdürülebilir büyüme hızları sağlar ve sinir gelişimi ile yaralanma tedavileri için önemli bilgiler sunar.

Akson Streç Büyüme: Nöronal Büyüme Mechanotransduction

Daha fazla video keşfet