Fare Omurilik İki foton Mikroskop kullanarak in vivo Görüntüleme

Bu prosedürün amacı, iki foton mikroskobu kullanarak fare omuriliğinde stabil in vivo görüntüleme yapmaktır. Bu, ilk önce hayvanın sabit ama sakin bir solunum ritmi elde eden bir anestezik karışımla uyuşturulmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, omurgayı istenen seviyede ortaya çıkarmak ve daha sonra in vivo olarak görüntülenebilmesi için alttaki omuriliği ortaya çıkarmak için bir laminektomi yapmaktır.

Üçüncü adım, hayvanı omurga stabilizasyon cihazına yerleştirmektir. Son adım, açıkta kalan omurilik segmentinin izolasyonudur. İn vivo görüntülemeye hazırlık olarak, sonuçta, iki foton mikroskobu kullanılarak hızlandırılmış in vivo görüntüleme yoluyla hücrelerin dinamik davranışlarını ve canlı omurilikteki diğer hücre tipleri veya yapıları ile etkileşimlerini detaylandıran sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin, omuriliği in vivo olarak görüntülemeye yönelik önceki girişimlere göre en büyük avantajı, son işlem gerektirmeyen ve hemen değerlendirilebilen ve daha fazla analiz için kullanılabilen yol in vivo görüntüleme verileri üretmesidir. Bu tekniğin etkileri, omurilik yaralanması veya hastalığını takiben tedaviye kadar uzanır, çünkü örneğin, omurilik yaralanmasının yanı sıra, örneğin bir yaralanmadan sonra aksonal dejenerasyon veya rejenerasyonun ilerlemesini gerçek zamanlı olarak incelememize izin verir. Bu teknik, hastalık patolojisinin omurilikte belirgin olduğu multipl skleroz veya amyotrofik lateral skleroz gibi hayvan hastalık modellerinde enflamatuar veya nörodejeneratif süreçlerin ilerlemesini incelemek için kullanılabilir.

Hayvanı tartarak işleme başlayın. Daha sonra, anestezik karışımı intraperitoneal enjekte ederek hayvanı uyuşturun. Deney boyunca hayvanın derin anestezisini sağlamak için düzenli ayak parmağını kıstırma işlemi yapın ve orijinal anestezik dozunun yarısıyla, saatte bir veya gerektiğinde takviye edin.

Daha sonra kornea dehidrasyonunu ve hasarını önlemek için suni gözyaşı merhemini gözlerin üzerine uygulayın. Hayvanın sırtındaki tüyleri bir düzeltme cihazıyla kesin ve kalan tüyleri keskin bir bıçakla tıraş edin. Traş edilen bölgeyi dezenfekte ettikten sonra, hayvanı mikroskop altına yerleştirin ve istenen omurga seviyesinin yaklaşık 1,5 santimetre üzerinde küçük bir uzunlamasına kesi yaparak işleme başlayın.

Deri altı bağ dokusunu dikkatlice geri çekerek sırt kas sistemini ortaya çıkarın. Daha sonra paravertebral kasları omurgadan istenen seviyede dikkatlice ayırın. Her dikenli sürecin her iki tarafından kasları ayırmak için mümkün olduğunca az kesi yapın.

Daha sonra, ayrılan kasları laminat yüzeyinden uzaklaştırın. Gerekirse herhangi bir küçük kanamayı kontrol etmek için küçük bir damar koterizatörü kullanın. Alttaki laminatı yeterince açığa çıkarana kadar kasları kazımaya devam edin ve çıkarmak istediğiniz kişiyi net bir şekilde belirleyebilirsiniz.

Omurganın her iki yanındaki omurga kelepçeleri için giriş yerlerini hazırlamak için, paravertebral kaslar arasına bir çift kavisli makasın uçlarını yerleştirin ve kelepçelerin yerleştirileceği dört cep oluşturmak için kas dokusunu dikkatlice değiştirin. Omuriliğe dokunmadan lamina altına kavisli künt uçlu makasın güvenli bir şekilde yerleştirilmesini sağlamak için omurgayı düz diş ucu forseps ile kaldırın. Ardından, kemiği bir taraftan yavaşça keserek laminektomiyi gerçekleştirin ve ardından diğer tarafta, küçük kanamayı sınırlamak için bir pamuklu çubuk kullanın veya insizyonun yanına önceden kesilmiş küçük bir jel köpük emilebilir jelatin sünger parçası yerleştirin.

Bundan sonra, dokuyu yıkamak için önceden ısıtılmış steril yapay beyin omurilik sıvısını kullanın. Bir omurga stabilizasyon cihazı, Nagate STSA kompleks omurilik kelepçelerinin ana bileşenleri ve Nagate MA altı N kafa tutma adaptörü ile özel olarak tasarlanmıştır. İki naga parçasını aynı hizada tutmak için paslanmaz çelik bir taban plakası yapıldı, böylece omurgası ve kuyruğu kenetlenirken hayvanın kafası desteklenir.

Hayvanı stabilize etmek için tüm cihazın mikroskop merceğinin altına, alçaltılmış bir mikroskop aşamasına sığması gerektiğini unutmayın. İlk olarak, omurga stabilizasyon cihazının taban plakasındaki bir yükseltme yastığına yerleştirin. Kafayı baş tutma adaptörüne sabitledikten sonra, SDSA cihazının omurga kelepçesini, laminektomiyi çevreleyen önceden hazırlanmış ceplere hayvanın ön arka ekseni boyunca yerleştirin.

Suya daldırma merceğini açıkta kalan omurilik üzerine indirmek için yeterli alan sağlamak için iki kelepçeyi hayvanın ROS kordal eksenine göre yaklaşık 45 derecelik bir açıyla yerleştirin. Daha sonra üçüncü kelepçeyi kuyruğun tabanına yerleştirin, böylece görüntüleme deneyinde yükseltme pedinin çıkarılmasından sonra hayvanın vücudu askıya alınabilir. Daha sonra, A BOS'ta omuriliğin bakımını kolaylaştırmak için açıkta kalan omuriliğin etrafına küçük bir jel conta kuyusu oluşturun.

Ardından, In vivo görüntülemeye başlamaya hazır olduğunuzda yükseltme pedini çıkarın, stabilizasyon cihazını önceden ısıtılmış mikroskop odasına getirin ve alçaltılmış mikroskop aşamasına yerleştirin. Laminektomiyi lens ile hizaladığınızdan emin olun. Suya daldırma lensini dikkatlice A BOS solüsyonuna indirin ve omurga kelepçelerine veya jel contaya temas etmediğinden emin olun.

İlgi alanını belirlemek için epi floresan kullanın ve daha sonra ona odaklanın. Lazer tarama moduna geçin ve görüntü dokusunda bulunan florlar için uygun iki foton lazer uyarımı, dalga boyu, dikroik ve bant geçiren filtreleri kullanarak in vivo görüntüleme gerçekleştirin. Görüntüleme deneylerinin sonunda, hayvanı omurga stabilizasyon cihazından çıkarın.

Jel contayı laminektomi etrafındaki alandan dikkatlice silin ve temizleyin. Laminektomi üzerine sırt kaslarını iyice dikin. Daha sonra deri kesisini dikin ve burada Zack görüntülerinin bir izdüşümü olarak gösterilen Betadine ile sürün, çünkü bunlar in vivo olarak gerekliydi ve daha sonra görüntü hizalaması olmadan Z ekseni boyunca yansıtıldı.

Görüntü, omurilikteki kan damarları ile kırmızı renkte, yeşil renkte oldukça yoğun GFP pozitif mikroglial hücreleri göstermektedir. Burada, bir kan damarının duvarına bağlı tek bir mikroglial hücrenin, damarın etrafına ve bazıları omurilik parankimine doğru uzanan bazı süreçlerini ayrıntılı olarak gösteren yüksek büyütmeli bir görüntüsü verilmiştir: Burada, aynı YFPH çizgili farenin omuriliğinde iki farklı seansta yeniden konumlandırıldıkları ve reim olarak yeniden görüntülendikleri gibi, aynı YFP etiketli aksonal segmentlerin tekrarlayan in vivo görüntülemesine bir örnek verilmiştir beş gün arayla. Bu, art arda iki gün boyunca omurilikte in vivo olarak görüntülenen aynı vasküler yapıları ve mikroglial hücreleri gösteren tekrarlayan görüntülemenin başka bir örneğidir.

İşte omurilikten in vivo olarak elde edilen temsili bir hızlandırılmış dizi. Bu dizi, yeşil renkteki mikroglial hücrelerin daha ince süreçlerinin dinamik davranışını ve bunların damar sistemi ile etkileşimlerini kırmızı renkle ayrıntılı olarak göstermektedir. Zamanla, ham görüntüler yalnızca arka plan gürültüsü, parlaklık ve kontrast için düzeltildi ve zaman atlamalı film, görüntü hizalaması olmadan görüntü yığınlarını sırayla reddederek oluşturuldu.

Bireysel düzlemlerin Aussie seçiminin ortalaması alındığında, kan damarları, mikroglia görüntüleriyle benzer bir Z düzlemi aralığından geçer. Görüntü hacminin derinliği 38 mikrondur. Bu, görüntüleme yönteminin kararlılığını tek bir Z düzlemi seviyesinde gösteren hızlandırılmış bir dizidir.

KXA karışımı ile uyuşturulan ve spinal stabilizasyon cihazına yerleştirilen bir CX üç, CR bir GFP heterozigot farenin omuriliğinde aynı tek Z düzleminin hızlı bir şekilde elde edilmesi, ardışık kareler arasında minimum görüntü yer değiştirmesi gösterir. Özellikle, bu dizinin hızı saniyede bir kare idi, bu da farenin nefes alma hızından daha hızlıydı. Küçük kalıntı yer değiştirme muhtemelen hayvanın kalp atışından kaynaklanmaktadır.

Bu prosedürü denerken, kesi sayısını minimumda tutmayı unutmamak ve herhangi bir küçük kanamayı meydana gelir gelmez sınırlamaya çalışmak önemlidir. Şimdi bu videoyu izledikten sonra, iki fotoğraf mikroskobu kullanarak fare güç kablosunda kararlı in vivo görüntülemenin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.