Name: Fare Omurilik İki foton Mikroskop kullanarak in vivo Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Öğrenin fare omuriliğinde iki foton mikroskopi kullanarak stabil in vivo görüntüleme yöntemini. Solunum kaynaklı hareket artefaktlarını minimize ederek yüksek çözünürlüklü hücresel dinamikleri uzunlamasına inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Multipl Skleroz tarafından desteklenen Toplum hibe uyarlanmış ve / veya Davalos ve ark. J Neurosci Yöntemleri yeniden basıldı KA Şekiller ve filmler için DD ve NIH / NINDS hibe NS051470 NS052189 ve NS066361 RG4595A1 / T. Mar 30 2008, Elsevier gelen izni ile 169 (1) :1-7 2008 Telif Hakkı,.

1. Bina spinal stabilizasyon cihazı <ol><li> Narishige STS-Compact Omurilik Kelepçeleri ve Narishige MA-6N kafa tutma adaptörü sipariş edin. </li><li> Özel tasarım ve spinal kolon ve kuyruk kenetli iken hayvan kafası desteklenen böylece paslanmaz çelik taban plakası iki Narishige parçaları hizada tutun. Tüm cihaz genellikle indirdi mikroskop sahnede mikroskop mercek altında uygun gerektiğini aklınızdan çıkarmayın. </li></ol> 2. Hayvan cerrahisi <ol><li> Pre-ısı mikroskop bir hava ısıtma cihazı ile oda ve 37 bakımını ° C </li><li> Hayvan tartılır ve 100 mg ketamin, 15 mg ksilizin ve steril koşullar altında% 0.9 NaCl çözeltisi seyreltilir kg vücut ağırlığı başına 2.5 mg acepromazine, anestezik karışımı yapmak. </li><li> Anestezik karışımı (KXA) intraperitoneal olarak enjekte edilerek hayvan anestezisi. Düzenli ayak pinching boyunca derin anestezi sağlamak için yapılmalıdırdeney. Saatlik ya da gerektiği gibi orijinal yarım doz ile tamamlayın. </li><li> Cerrahi işlem yaparken termal destek sağlamak amacıyla küçük bir hayvan ısıtma yastığı kullanın. </li><li> Korneal dehidratasyon ve zarar görmesini önlemek için yapay gözyaşı merhemi gözleri üzerine uygulayın. </li><li> Kırparak bir cihaz ile ve daha sonra keskin bir bıçak ile kesi etrafındaki alanı tamamen saç kaldırmak için öncelikle hayvanın arka Tıraş. </li><li> Tıraş edilen kıllar çıkarın ve alkol ped ile traş cilt yüzeyi dezenfekte edin. </li><li> İstenen spinal seviye (torakal vertebra burada görüldüğü gibi) cilt üzerinde küçük bir (~ 1.5 cm) uzunlamasına insizyon yapın. </li><li> Dikkatli bir şekilde geri çekilmeden derialtı bağ dokusu tarafından arka kas Açığa. </li><li> Dikkatlice istenilen düzeyde paravertebral kaslar omurga ayırın. Her spinöz sürecinin her iki tarafın kasları ayırmak ve sonra bir müstakil kasları kazımak mümkün olan en az kesiler gerçekleştirinlaminer yüzeyinden yolu. </li><li> Laminektomi hemen rostral ve kaudal silinecektir lamina seçin ve omurganın her iki tarafta spinal kelepçeler için giriş siteler hazırlamak. Dikkatle kelepçeler eklenecektir dört cepleri yapmak kas dokusunun yerini. </li><li> Lamina altında kavisli ucu künt makas omurilik dokunmadan güvenli girilmesine olanak ucu düz dişli forseps ile omuriliğe kaldırın. Yavaş yavaş, sonra bir tarafta diğer tarafta kemik kesme ve laminektomi gerçekleştirin. </li><li> Bir pamuklu bir bez kullanın ya da ufak bir kanama sınırlamak için kesiler yanında hazır kesilmiş küçük gelfoam emilebilir jelatin sünger parçaları yerleştirin. Gerekirse daha fazla kanama kontrolü için küçük bir gemi cauterizer kullanın. Doku yıkama önceden ısıtılmış steril yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) kullanın. </li></ol> 3. In vivo görüntüleme için omuriliğe ve hazırlık Stabilizasyonu <ol><li> Plac e spinal stabilizasyon cihazın taban plakası üzerinde bir yükseklik pad üzerinde hayvan ve kafa kafa tutan adaptörü güvenli. </li><li> STS-bir cihaz, laminektomi (Şekil 1) yan önceden hazırlanmış ceplerinde hayvan ön-arka eksen boyunca spinal kelepçeler yerleştirin . Iki kelepçeler ~ 45 bir açıyla yerleştirilmiş olmalıdır ° maruz spinal kord (Şekil 1) üzerinde bir suya daldırma lens düşürmek için yeterli alana izin hayvan postero-kaudal eksenine göre. </li><li> STS-bir cihaz hayvanın vücut görüntüleme deneyleri (Şekil 1) süresi için yükseklik pad çıkarılmasından sonra havada asılı böylece kuyruk dibinde üçüncü kelepçe yerleştirin. </li><li> ACSF spinal kord bakım ve in vivo görüntüleme için bu çözüm mikroskop objektif daldırma kolaylaştırmak için Gelseal (Amersham Biosciences Corp) maruz omurilik etrafındaki küçük bir kuyu oluşturun. </li></ol>jove_title "&gt; 4 fare omurilik in vivo görüntüleme iki foton mikroskobu ile <ol><li> Önceden ısıtılmış odasının içine mikroskop kapsayan spinal stabilizasyon cihaz hayvan aktarın ve alçaltılmış bir mikroskop sahnede düz mercek altında (Şekil 1) laminektomi yerleştirerek sabitleyin. </li><li> ACSF çözüm, spinal kelepçeler veya Gelseal temas edip etmediğini emin olmak için dikkatli bir şekilde bir su-immersion lens indirin. </li><li> Ilgi alanlarını belirlemek ve bunun üzerine odaklanmak Epifloresans kullanın. Lazer tarama modunu açın ve in vivo görüntüleme fluorophores için filtreler görüntülü doku mevcut uygun iki foton lazer dalgaboyu, dichroics ve bandpass kullanarak gerçekleştirmek. </li></ol> 5. Tekrarlanan görüntüleme ve ameliyat sonrası bakım <ol><li> Görüntüleme deneyler sonunda, spinal stabilizasyon cihazdan fare kaldırmak ve Gelseal laminektomi etrafındaki alanı dikkatlice silin.Alan iyi temizleyin. </li><li> Geri Yükleme ve laminektomi üzerinde sırt kasları sütür. </li><li> Restore cilt üzerinde laminektomi ve sütür, betadin çubukla. </li><li> Bir besin ve hidrasyon ek olarak 1 ml Laktatlı Ringers çözüm (Baxter Healthcare), subkutan yanı sıra analjezik tedavisi (0,1 mg / kg buprenorfin) sağlayın. </li><li> Antiseptik tedavi intraperitoneal (fare başına düşen 0.03 ml,% 2.27 enrofloxacin enjektabl antibakteriyel solüsyon) yönetin. </li><li> Anesteziden tam iyileşme kadar bir ısıtma pedi üzerinde hayvan ve daha sonra tek tek bu ev. </li><li> Ameliyat sonrası 2-3 gün için cerrahi ve analjezik tedavinin her 8-12 saat sonra ilk 3-5 gün için günlük antiseptik yönetim tekrarlayın. Normal davranış ve tam bir iyileşme sağlamak için günlük hayvan izleyin. </li><li> Aynı laminektomi ile yeniden görüntüleme, sütüre cilt ve kasların yeniden ve bölüm 2 açıklanan adımları yineleyin - 4. </li><li> Önceki teknolojik sıçramalarda yeniden bulmakPLC `e sürekli olarak kan damarsal daha önce 10 açıklandığı gibi bir harita kullanarak alanı görüntülenmiş. </li></ol> 6. Temsilcisi sonuçları Bütün hayvan prosedürleri Kaliforniya, San Francisco Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından belirlenen kurallar çerçevesinde ve Federal düzenlemelere göre. Spinal stabilizasyon aygıtı ve bir fare, bir mikroskop objektif altında cihaz üzerinde konumlandırma gösteren şematik bir resmi Şekil 1'de gösterilmiştir. Hayvanın gövdesinin altındaki solunum hareketleri için yeterli oda izin verme omurilik in vivo görüntüleme istikrarlı sağlar. Onu Cx3cr1 GFP / + transgenik fareler 18 spinal kord in vivo olarak görüntülenmiş oldu gibi Şekil 2 mikroglia ve damarsal arasında yakın bir ilişki gösterir , mikroglia endojen GFP ile etiketlenmiş. Şekil 3 yakalanma gösterir örneklerspinal aksonlar floresan protein (YFP-H hat 3) ve mikroglia (Cx3cr1 GFP / + fareler) ifade farelerde aynı omurilik alanları yapıldı gibi in vivo görüntüleme. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/2760/2760fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1: İki foton mikroskopi kullanılarak in vivo görüntüleme için fare omurganın Sabitleme (A) ısmarlama çelik taban plakası STS-Narishige kompakt omurilik kelepçeler ve MA-6N Narishige destek ve hizalamak için kullanılır . Burada görüldüğü gibi kafa adaptörü tutarak (B), spinal istikrar cihaz üzerinde bir KXA anestezi ile anestezi yetişkin transgenik farelerin doğru yerleştirilmesi . Eklemek spinal kelepçeler hemen rostrally ve kaudal laminektomi ve açık omurilik dokusu yerleşimi gösterir. &lt;img alt = "Şekil 2" src = "/ files/ftp_upload/2760/2760fig2.jpg" /&gt; Şekil 2 anestezi farelerin omurilik yüksek yoğunluk mikroglia hücreleri ve kan damarları in vivo görüntüleme. Öngörülen ama olmayan hizalı z yığınlarının (A), kan damarları ile yakın bir CX3CR1 GFP / + fare (kırmızı, rodamin dekstran iv enjeksiyon ile etiketli) spinal kord çok yoğun GFP pozitif mikroglia (yeşil) . (B) Yüksek büyütmeli görüntü (A) tek bir mikrogliyal hücre geminin etrafında genişletilmiş süreçleri ve omurilik parankimi doğru bir kan damarı duvarına bağlı olarak etiketlenmiş. Ölçek barlar, 10μm. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/2760/2760fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 farklı günlerde taşındı ve anestezi farelerin omurilik reimaged aynı aksonal segment ve mikroglia in vivo görüntüleme de Tekrarlanan. (A) YFP-lab 0 ve 5 gün eLED aksonlar. (B). Çevrelerindeki aynı vasküler yapılar ve mikroglia hücreleri, 0 ve 1 gün Cx3cr1 GFP / + farelerin omurilik in vivo olarak görüntülenmiş . Ölçek barlar, 10μm. Movie 1 Temsilcisi timelapse dizisi in vivo fare omurilik satın aldı. Bu dizi detay ince floresan yapıları ile yoğun nüfuslu bir doku içinde zamanla damar (kırmızı, rodamin dekstran iv enjeksiyon ile etiketli) mikroglia Proses dinamiği (yeşil) ve bunların etkileşimleri gösterir. Ham görüntüleri sadece arka plan gürültü, parlaklık ve kontrast için düzeltilmiş ve timelapse film görüntü hizalama olmadan, ortalama veya bireysel uçakları z seçim z projelendirme sıralı olarak elde edilen görüntü yığınları tarafından inşa edilmiştir. Kan damarları mikroglia görüntü olarak z uçaklar benzer bir aralık içerisinde. Z düzlemi derinliği: 38 mm.oad/2760/Davalos_Movie_1.mov "&gt; film izlemek için buraya tıklayın. Film 2 Timelapse dizisi, tek bir z-düzlemi düzeyinde görüntüleme yöntemi ham istikrar göstermektedir . KXA anestezi altında spinal stabilizasyon cihaz yerleştirilir CX3CR1 GFP / + fareler omurilikte aynı tek z-düzlemi Hızlı satın alma, daha hızlı bir tarama 1 kare / s hızında ardışık çerçeve arasındaki minimum görüntü deplasman gösteriyor farenin solunum hızı. Küçük kalan deplasman muhtemelen kalp atışı nedeniyle <a alt="Movie 2" href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2760/Davalos_Movie_2.mov">film izlemek için buraya tıklayın.</a>

<ol><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248, 73-76 (1990).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).</li>
<li>Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+the+immune+system%3A+progress%2C+pitfalls+and+promise%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 497-507 (2006).</li>
<li>Misgeld, T., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+the+diseased+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of the diseased nervous system.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 449-463 (2006).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
<li>Davalos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308, 1314-1318 (2005).</li>
<li>Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+dendritic+spine+stability+in+the+adult+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term dendritic spine stability in the adult cortex.</a> Nature. 420, 812-816 (2002).</li>
<li>Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dendritic+calcium+dynamics+in+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons.</a> Nature. 385, 161-165 (1997).</li>
<li>Trachtenberg, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420, 788-794 (2002).</li>
<li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+Ca2%2B+signaling+evoked+by+sensory+stimulation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytic Ca2+ signaling evoked by sensory stimulation in vivo.</a> Nat. Neurosci. 9, 816-823 (2006).</li>
<li>Christie, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+arrest+of+individual+senile+plaques+in+a+model+of+Alzheimer%27s+disease+observed+by+in+vivo+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Growth arrest of individual senile plaques in a model of Alzheimer's disease observed by in vivo multiphoton microscopy.</a> J. Neurosci. 21, 858-864 (2001).</li>
<li>Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrillar+amyloid+deposition+leads+to+local+synaptic+abnormalities+and+breakage+of+neuronal+branches%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches.</a> Nat. Neurosci. 7, 1181-1183 (2004).</li>
<li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3, 489-496 (2006).</li>
<li>Takano, T., Han, X., Deane, R., Zlokovic, B., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+astrocytic+Ca2%2B+signaling+and+the+microvasculature+in+experimental+mice+models+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of astrocytic Ca2+ signaling and the microvasculature in experimental mice models of Alzheimer's disease.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1097, 40-50 (2007).</li>
<li>Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Fractalkine+Receptor+CX3CR1+Function+by+Targeted+Deletion+and+Green+Fluorescent+Protein+Reporter+Gene+Insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Fractalkine Receptor CX3CR1 Function by Targeted Deletion and Green Fluorescent Protein Reporter Gene Insertion.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).</li>
<li>Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+axonal+degeneration+and+regeneration+in+the+injured+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord.</a> Nat. Med. 11, 572-577 (2005).</li>
<li>Kim, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+microscopy+imaging+of+intact+spinal+cord+and+cerebral+cortex+reveals+requirement+for+CXCR6+and+neuroinflammation+in+immune+cell+infiltration+of+cortical+injury+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites.</a> J. Immunol. Methods. 352, 89-100 (2010).</li>
<li>Shakhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+T+cell-dendritic+cell+interactions+precede+the+development+of+both+tolerance+and+immunity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo.</a> Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).</li>
<li>Tadokoro, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+inhibit+stable+contacts+between+CD4%2B+T+cells+and+dendritic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo.</a> J Exp Med. 203, 505-511 (2006).</li>
<li>Lindquist, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+dendritic+cell+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Visualizing dendritic cell networks in vivo.</a> Nat. Immunol. 5, 1243-1250 (2004).</li>
<li>Schwickert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((vivo+imaging+of+germinal+centres+reveals+a+dynamic+open+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">vivo imaging of germinal centres reveals a dynamic open structure.</a> Nature. 446, 83-87 (2007).</li>
</ol>

Biz ifşa etmek başka bir şey var.

Istikrarlı ve tekrarlayan yoğun nüfuslu iki foton mikroskopi kullanılarak anestezi farelerin omurilik floresan hücresel yapılarının in vivo görüntüleme yöntemi, burada açıklanan sağlar. Yakalanan istikrar, ısmarlama bir spinal stabilizasyon cihaz ve solunum kaynaklı hareket artifakı azaltan bir anestezik rejiminin bir sonucudur. Spinal stabilizasyon aygıtı fare gövdesinin altında nefes alan sağlar ve piyasada mevcut spinal kelepçeler ve baş montaj parçası (Şekil 1) kullanılarak inşa edilebilir. Bu yönt...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Rodamin B dekstran </td><td> Invitrogen </td><td> D1841 </td><td> Seyreltilmiş 70 kDa ACSF (3% w / v) </td></tr><tr><td> Ketamin HCl </td><td> Bionichepharma </td><td> NDC No: 67457-001-10 </td><td> Enjektabl, 50mg/ml </td></tr><tr><td> Anased </td><td> Lloyd Labs </td><td> ADA No: 139-236 </td><td> Xylazine enjektabl 20mg/ml </td></tr><tr><td> Acepromazine </td><td> Vedco </td><td> ADA No: 117-531 </td><td> Enjektabl, 10mg/ml </td></tr><tr><td> Suni gözyaşları merhem </td><td> Anka kuşu ilaç </td><td> NDC No: 57319-760 25 </td><td> Yağlayıcı </td></tr><tr><td> Betadine </td><td> Balıkçı </td><td> 19-061617 </td><td></td></tr><tr><td> McPherson-Westcott Makas </td><td> Dünya Hassas Enstrümanlar </td><td> 555500S </td><td> Eğri, künt ucu makas </td></tr><tr><td> Düz Forseps </td><td> Dünya Hassas Enstrümanlar </td><td> 555047FT </td><td> Dişli ucu forseps </td></tr><tr><td> Küçük damar dağlamak </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 18000-00 </td><td></td></tr><tr><td> Gelfoam </td><td> Pharma, Pfizer Inc. </td><td> Mikser Mill MM400 </td><td></td></tr><tr><td> Kompakt spinal kord kelepçeler </td><td> Narishige </td><td> STS-A </td><td></td></tr><tr><td> Kafa tutan Adaptörü </td><td> Narishige </td><td> MA-6N </td><td></td></tr><tr><td> Gelseal </td><td> Amersham Biosciences Corp. </td><td> 80-6421-43 </td><td></td></tr><tr><td> Laktatlı Ringers </td><td> Baxter Healthcare &lt;/ Td&gt; <td> 2B8609 </td><td></td></tr><tr><td> Buprenex </td><td> Reckit Benckiser Pharmaceuticals Inc </td><td> NDC No: 12.496 - 6757-1 </td><td> Buprenorfin enjektabl </td></tr><tr><td> Baytril </td><td> Bayer </td><td> ADA 140-913 </td><td> Enrofloxacin, antibakteriyel enjektabl % 2.27 (20ml) </td></tr><tr><td> Isıtma pedi - Büyük </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 21060-10 </td><td></td></tr></tbody></table>

fare omurilik İki foton mikroskop kullanarak in vivo görüntüleme

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

Farelerde genetik olarak belirli bir hücre türleri 2-3 in vivo 4-7 sayısız dokuların fizyolojik ve patolojik süreçler hakkındaki bilgimizi önemli ölçüde genişletti floresan proteinleri ifade etmek için tasarlanmış iki foton mikroskopi 1 kullanarak in vivo görüntüleme. Merkezi sinir sistemi (MSS) çalışmalarda, bir roman bolluk ve altında nöronlar, astrositler, mikroglia, hücrelerin davranışları hakkında sık sık beklenmedik bulgular üretti beyinde in vivo görüntüleme alanında geniş bir uygulama olmamıştır fizyolojik veya patolojik koşullar 8-17. Ancak, çoğunlukla teknik komplikasyonlar yaşayan fare omurilik çalışmalarda in vivo görüntüleme uygulanması sınırlıdır. Özellikle omurilik, akciğer ve kalp görüntüleme yaşayan omurilik zor bir görev yapan önemli bir hareket artifakı anatomik yakınlık üretir. </p&gt; Biz, omurga stabilizasyon, solunum kaynaklı hareketlerin azaltılması ve böylece iki foton mikroskopi in vivo fare omurilik görüntü kullanımının kolaylaştırılması omurilik görüntüleme doğasında kısıtlamaların üstesinden gelen yeni bir yöntem geliştirdi . Bu önemli bir azalma, solunum bağlı hareketleri sonucu, derin bir anestezi yöntemi ile özelleştirilmiş bir spinal stabilizasyon cihaz birleştirerek elde edilir. Bu video protokol, doku hasarı minimumda tutmak ve kanama uzun süre boyunca stabil fizyolojik şartlar altında muhafaza edilebilir yaşayan omurilik küçük bir alanda açığa çıkarmak için nasıl gösterir. Temsilci ham görüntüleri yüksek çözünürlükte in vivo ayrıntılı olarak mikroglia arasındaki yakın ilişki ve damarsal satın aldı. Timelapse dizisi canlı fare omurilik mikrogliyal süreçlerin dinamik davranışı gösterir. Ayrıca, aynı z kare sürekli bir tarama göstermekresmi hizalaması alım sonrası gerekmez görüntü ve / veya timelapse filmleri yığınları oluşturmak için bu yöntem elde edebilirsiniz olağanüstü istikrar var. Sonuç olarak, in vivo olarak devam eden fizyolojik veya patolojik süreçler uzunlamasına çalışmalar için izin veren bu yöntem, daha sonra timepoints omurilik aynı bölgede tekrar ve Reimage nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

Fare spinal kolon stabilize ve tekrarlayan gerçekleştirmek için minimal invaziv bir protokol<em&gt; In vivo</em&gt; Omurilik görüntüleme iki foton mikroskopi kullanılarak açıklanmıştır. Bu yöntem, solunum kaynaklı hareketlerini en aza indirmek ve hiçbir hizalama veya diğer post-processing gerektiren ham görüntü verisi üretmek için bir spinal stabilizasyon cihazı ve anestezi rejimi birleştirir.

Fare Omurilik İki foton Mikroskop kullanarak in vivo Görüntüleme

Belirli hücre tiplerinde floresan proteinler eksprese edecek şekilde genetik olarak modifiye edilmiş farelerde 2-3 iki foton mikroskobu kullanılarak yapılan in vivo görüntüleme 1 ...

Bu prosedürün amacı, iki foton mikroskopisi kullanarak fare omuriliğinde stabil in vivo görüntüleme gerçekleştirmektir. Bu işlem, öncelikle hayvanın sabit ancak sakin bir solunum ritmi sağlayan bir anestetik karışım ile anestezi edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, omurganın istenen seviyede açığa çıkarılması ve ardından altta yatan omuriliğin in vivo olarak görüntülenebilmesi için bir laminektomi yapılmasıdır.Üçüncü adım, hayvanın spinal stabilizasyon cihazına yerleştirilmesidir. Son adım ise açığa çıkarılan spinal kord segmentinin izole edilmesidir. In vivo görüntüleme hazırlığı sonucunda, iki foton mikroskopisi kullanılarak yapılan time-lapse in vivo görüntüleme yoluyla, canlı spinal korddaki hücrelerin dinamik davranışları ve diğer hücre tipleri veya yapılarla olan etkileşimlerini detaylandıran sonuçlar elde edilebilir.Bu tekniğin, omuriliğin in vivo görüntülenmesine yönelik önceki girişimlere göre temel avantajı, herhangi bir son işlem gerektirmeyen ve anında değerlendirilip ileri analizler için kullanılabilecek in vivo görüntüleme verileri üretmesidir. Bu tekniğin etkileri, omurilik yaralanması veya hastalığı sonrası tedaviye kadar uzanmaktadır; çünkü örneğin, omurilik yaralanmasının yanı sıra bir yaralanma sonrası aksonal dejenerasyonun veya rejenerasyonun ilerleyişini gerçek zamanlı olarak incelememize olanak tanır. Bu teknik; multipl skleroz veya amyotrofik lateral skleroz gibi, hastalık patolojisinin omurilikte belirgin olduğu hastalık hayvan modellerinde, enflamatuar veya nörodejeneratif süreçlerin ilerleyişini incelemek için kullanılabilir.İşleme hayvanın ağırlığını ölçerek başlayın. Ardından, anestezik karışımı intraperitonal olarak enjekte ederek hayvanı anesteziye alın. Deney boyunca hayvanın derin anestezide olduğundan emin olmak için düzenli olarak ayak parmağı sıkıştırma testi uygulayın ve saat başı veya ihtiyaç duyuldukça başlangıç dozunun yarısı kadar ek anestezik uygulayın.Ardından, kornea dehidrasyonunu ve hasarını önlemek için gözlerin üzerine yapay gözyaşı pomadı uygulayın. Hayvanın sırtındaki tüyleri bir düzeltici cihazla kısaltın ve kalan tüyleri keskin bir bıçakla tıraş edin. Tıraş edilen bölgeyi dezenfekte ettikten sonra hayvanı mikroskop altına yerleştirin ve istenen spinal seviyenin yaklaşık 1,5 santimetre üzerinden küçük bir boylamsal insizyon yaparak prosedüre başlayın.Kutanöz bağ dokusu dikkatlice geri çekilerek sırt kasları açığa çıkarılır. Ardından, paravertebral kaslar istenen seviyede omurga kolonundan dikkatle ayrılır. Kasları her bir spinöz çıkıntının her iki yanından ayırmak için mümkün olduğunca az insizyon yapılır.Ardından, ayrılan kasları laminat yüzeyden sıyırın. Gerektiğinde, olası küçük kanamaları kontrol altına almak için küçük bir damar koterizasyon cihazı kullanın. Alt taraftaki laminatı yeterince açığa çıkarana ve çıkaracağınız laminatı net bir şekilde tanımlayabilene kadar kasları sıyırmaya devam edin.Omurganın her iki yanındaki spinal klemplerin giriş bölgelerini hazırlamak için, bir çift kavisli makasın uçlarını paravertebral kasların arasına yerleştirin ve klemplerin takılacağı dört cep oluşturmak için kas dokusunu dikkatlice kenara itin. Omuriliği zedelemeden kavisli küt uçlu makasların lamina altına güvenli bir şekilde yerleştirilmesini sağlamak için omurga sütununu düz dişli pensle kaldırın. Ardından, kemiği önce bir taraftan sonra diğer taraftan yavaşça keserek laminektomiyi gerçekleştirin; hafif kanamaları sınırlamak için insizyonun yanına bir pamuklu çubukla tampon yapın veya önceden kesilmiş küçük bir jel köpük emilebilir jelatin sünger parçası yerleştirin.Bundan sonra, dokuyu yıkamak için önceden ısıtılmış steril yapay serebrospinal sıvı kullanın. Temel bileşenleri Nagate STSA kompleks spinal kord klempaları ve Nagate MA altı N kafa tutma adaptörü olan bir spinal stabilizasyon cihazı özel olarak tasarlanmıştır. Hayvanın başı desteklenirken spinal kolonunun ve kuyruğunun klemplenebilmesi için iki naga parçasını hizalı tutacak paslanmaz çelik bir taban plakası yapılmıştır.Hayvanı stabilize etmek için tüm düzeneğin, alçaltılmış bir mikroskop tablası üzerinde mikroskop lensinin altına sığması gerektiğini unutmayın. İlk olarak, hayvanı spinal stabilizasyon cihazının taban plakasındaki bir yükseltme pedinin üzerine yerleştirin. Başı baş tutma adaptörüne sabitledikten sonra, SDSA cihazının spinal klempsini, laminektomi bölgesinin yanlarında kalan önceden hazırlanmış yuvalara, hayvanın anterior posterior ekseni boyunca yerleştirin.Su daldırma lensinin açıkta kalan omuriliğin üzerine indirilebilmesi için yeterli alan sağlamak amacıyla, iki klempi hayvanın ROS kordal eksenine göre yaklaşık 45 derecelik bir açıyla yerleştirin. Ardından, görüntüleme deneyinde yükseltme pedi çıkarıldıktan sonra hayvanın vücudunun asılı kalabilmesi için üçüncü klempi kuyruğun tabanına yerleştirin. Sonrasında, omuriliğin A CSF içerisinde tutulmasını kolaylaştırmak için açıkta kalan omuriliğin etrafına jel sızdırmazlık maddesiyle küçük bir kuyu oluşturun.Ardından, In vivo görüntülemeye başlamaya hazır olduğunuzda yükseltme pedini çıkarın, stabilizasyon cihazını önceden ısıtılmış mikroskop haznesine getirin ve alçaltılmış mikroskop tablasına yerleştirin. Laminektominin lens ile hizalandığından emin olun. Su daldırma lensini A CSF çözeltisinin içine dikkatlice indirin ve spinal klemplere veya jel sızdırmazlığa temas etmediğinden emin olun.İlgi alanını belirlemek için epi floresan yöntemini kullanın ve ardından bu alana odaklanın. Lazer tarama moduna geçin ve görüntülenen dokudaki floroforlar için uygun iki foton lazer uyarımı, dalga boyu, dikroik aynalar ve bant geçiren filtreleri kullanarak in vivo görüntüleme gerçekleştirin. Görüntüleme deneylerinin sonunda, hayvanı spinal stabilizasyon cihazından çıkarın.Laminektomi çevresindeki bölgeden jel mühürü dikkatlice silin ve temizleyin. Laminektominin üzerindeki sırt kaslarını iyice dikin. Ardından cilt insizyonunu dikin ve burayı Betadine ile silin; bu işlem, in vivo ortamda gerekli oldukları için Zack görüntülerinin bir projeksiyonu olarak ve ardından görüntü hizalaması yapılmadan Z ekseni boyunca projekte edilmiş haliyle burada gösterilmiştir.Görüntü, omurilikte kan damarlarıyla (kırmızı) yakın temas halindeki yüksek yoğunluktaki GFP pozitif mikroglial hücreleri (yeşil) göstermektedir. Burada, bir kan damarı duvarına tutunmuş tek bir mikroglial hücrenin yüksek büyütmeli görüntüsü yer almakta olup, hücrenin bazı uzantılarının damarın çevresine ve bazılarının ise omurilik parankimine doğru uzandığı detaylı bir şekilde görülmektedir. Burada, aynı YFPH hattı faresinin omuriliğinde, iki farklı seansta beş gün arayla yeniden konumlandırılan ve görüntülenen aynı YFP etiketli aksonal segmentlerin tekrarlayan in vivo görüntüleme örneği sunulmuştur. Bu ise, omurilikte iki ardışık günde in vivo olarak görüntülenen aynı vasküler yapıların ve mikroglial hücrelerin tekrarlayan görüntülemesine başka bir örnektir.Burada, spinal korddan in vivo olarak elde edilen temsili bir zaman atlamalı sekans yer almaktadır. Bu sekans, yeşil renkle gösterilen mikroglial hücrelerin ince uzantılarının dinamik davranışlarını ve kırmızı renkle gösterilen damar sistemiyle olan etkileşimlerini ayrıntılı olarak göstermektedir. Ham görüntüler zaman içinde yalnızca arka plan gürültüsü, parlaklık ve kontrast açısından düzeltilmiş ve zaman atlamalı film, görüntü hizalaması yapılmaksızın görüntü yığınlarının ardışık olarak reddedilmesiyle oluşturulmuştur.Bireysel düzlemlerin ortalama seçimiyle, kan damarları mikroglia görüntüleriyle benzer bir Z düzlemi aralığından geçer. Görüntü hacminin derinliği 38 mikrondur. Bu, görüntüleme yönteminin tek bir Z düzlemi seviyesindeki stabilitesini gösteren bir zaman atlamalı dizidir.KXA karışımı ile anestezi uygulanmış ve spinal stabilizasyon cihazına yerleştirilmiş CX3CR1 GFP heterozigot bir farenin omuriliğinde aynı tek Z düzleminin hızlı şekilde elde edilmesi, ardışık kareler arasında minimum görüntü kayması olduğunu göstermektedir. Özellikle, bu sekansın hızı saniyede bir kare olup, bu hız farenin solunum hızından daha yüksektir. Kalan küçük yer değiştirme muhtemelen hayvanın kalp atışından kaynaklanmaktadır.Bu prosedürü uygularken, insizyon sayısını minimumda tutmaya dikkat etmek ve meydana gelen küçük kanamaları anında durdurmaya çalışmak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, iki foton mikroskobisi kullanarak fare görme korteksinde nasıl stabil in vivo görüntüleme yapılacağı konusunda kapsamlı bir bilgi edinmiş olmalısınız.

in-vivo-imaging-of-the-mouse-spinal-cord-using-two-photon-microscopy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Source: Nishimura, C.  ve ark. HIV Kaynaklı Nöroinflamasyonun Fare Modelinde İki Foton Mikroskobu Kullanılarak Serebral Vasküler Mimarinin Ölçülmesi. J. Vis. Exp. (2016). Bu video, iki foton mikroskobu kullanılarak fare beynindeki kortikal kılcal damarların in vivo görselleştirmesini göstermektedir. İnce kafatası kortikal pencereli anestezi uygulanmış bir fareye floresan boya enjekte etme, görüntüleme için kurulumu hazırlama ve analiz için beyin mikrovasküler yapılarının ayrıntılı görüntülerini...

 Fare Beyni Mikrovaskülatürünün İn Vivo Görüntülenmesi için İki Foton Mikroskobu 

Nöronlarda deneyim-bağımlı moleküler değişiklikler davranışsal sorunlara yanıt olarak adapte beyin yeteneği için gereklidir.

Kortikal Nöronlar In Vivo İki foton Of Görüntüleme Deneyimi bağımlı Moleküler Değişiklikler

Canlı hayvanda hızlandırılmış görüntüleme, sağlam beyindeki yapısal yeniden yapılanma hakkında değerli bilgiler sağlar. Burada, canlı fare korteksindeki floresan etiketli sinaptik yapıların iki foton mikroskobu ile transkraniyal görüntülenmesine izin veren inceltilmiş bir kafatası preparatını tanıtıyoruz.

İki-Foton<em&gt; In vivo</em&gt; Bir inceltilmiş-kafatası Hazırlık kullanarak Fare Cortex dendritik dikenler Görüntüleme

Bu videoda, bir canlı fare dorsal spinal kord üzerinde kronik optik görüntüleme odasını yerleştirmeye yönelik bir prosedür açıklanmaktadır. odası, cerrahi işlem ve kronik görüntüleme gözden ve gösterilmiştir.

Boyuna için bir Spinal Odası implantasyon için bir Prosedürü İn Vivo Fare Omurilik Görüntüleme

İki fotonlu intravital görüntüleme, dorsal kolon travmatik omurilik ezilme yaralanması olan kemik iliği kimerik bir hayvanda omurilikteki farklı hücre tipleri arasındaki etkileşimleri araştırmak için kullanılabilir.

Fare Sırt Sütun Crush Yaralanmalarında mikroglia ve Makrofagların ile aksonal İlişkilerin Intravital Görüntüleme

Fare omuriliği görüntülenmesi için yeni bir ex vivo hazırlık. Bu protokol, omurilik boyunca canlı hücresel etkileşimlerin iki foton görüntüleme için izin verir.

Fare Omurilik Hücresel Dynamics İki foton Görüntüleme

Bu video, Thy1-GFP transgenik hattında in vivo iki foton mikroskobu kullanılarak fare retrosplenial korteksindeki nöronların kronik olarak görüntülenmesine izin veren kraniyotomi prosedürünü göstermektedir. Bu yaklaşım, mCherry eksprese eden adeno ilişkili virüsün dorsal hipokampusa enjeksiyonu ile birleştirilir. Bu teknikler, RSC'de deneyime bağlı yapısal plastisitenin uzun süreli izlenmesine izin verir.

Eşzamanlı İki foton<em&gt; İn Vivo</em&gt; Fare Retrosplenial kortekste sinaptik Girişlerin Görüntüleme ve postsinaptik Hedefler

Biz dinamik spinal vasküler değişiklikler yetişkin Sprague-Dawley Sıçanlarda contusive Medulla Spinalis Yaralanmalarında takip izlemek için iki farklı floresan boyalar kullanarak yöntemi Imaging bir vivo tanıtmak.

İçinde bir Vivo Vasküler Dynamics Contusive Medulla Spinalis Yaralanmalarında takip görüntüleme için duo-renk yöntemi

Bu protokol, intravital mikroskopi ile görselleştirmeyi kolaylaştırmak için bir farenin omuriliğine cam pencere nin yerleştirilmesini açıklar.

Farede Laminektomi ve Omurilik Penceresi İmplantasyonu

Uyarılmış Raman saçılması (SRS) mikroskopisi, biyomoleküllerin spesifik kimyasal bağların içsel titreşimine dayanarak etiketsiz görüntülenmesini sağlar. Bu protokolde, canlı farelerin omuriliğindeki hücresel yapıları görselleştirmek için entegre bir SRS ve iki fotonlu floresan mikroskobun enstrümantal kurulumu açıklanmaktadır.

İn vivo Kombine İki Foton Floresan ve Stimüle Raman Saçılma Mikroskobu ile Biyolojik Dokuların Görüntülenmesi

Bu protokol, floresan polistiren mikrosferler kullanılarak in vivo iki foton mikroskopi görüntüleme için optimize edilmiş kronik kraniyal pencere ve mikrovasküler embolizm fare fare modeli için adım adım yaklaşımın ayrıntılı bir açıklamasını içerir.

Floresan Polistiren Mikrosferleri Kullanarak In Vivo İki Foton Mikroskopi İçin Mikrovasküler Embolizm Fare Modeli

Öğrenin fare omuriliğinde iki foton mikroskopi kullanarak stabil in vivo görüntüleme yöntemini. Solunum kaynaklı hareket artefaktlarını minimize ederek yüksek çözünürlüklü hücresel dinamikleri uzunlamasına inceleyin.

Fare Omurilik İki foton Mikroskop kullanarak in vivo Görüntüleme

Daha fazla video keşfet