Yellow Fever Sivrisinek Hemocytes Toplama ve Boyama için Protokol Aedes aegypti

Bu prosedürün genel amacı, sivrisineklerden hemositleri toplamak ve boyamaktır. Bu işlem, öncelikle soğutulmuş sivrisineklerin içine küçük hacimli bir antikoagülan seyreltici enjekte edilerek gerçekleştirilir. Hemositleri serbest bırakmak ve tüm hemositleri çözeltiye geçirmek için işlem uygulanır.

Prosedürün ikinci adımı, sivrisineğin bacaklarını, kanatlarını ve abdomen ucunu çıkarmaktır. Üçüncü olarak, perfüzyon işlemini başlatmak için sivrisineğin ayrı bir bölgesine taze dilüent enjekte edilir. Son adım ise, toplanan hemositlerin fikse edilebilmesi ve boyanabilmesi için dilüe edilmiş hemolenfin hazırlanmış bir lam üzerine yönlendirilmesidir.

Nihayetinde, temel kaydırmalı mikroskopi aracılığıyla, ilgili sivrisinek türlerinde bulunan temel hemo bölge türlerini ve sayılarını gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu tekniğin profüzyon gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, profüzyonun basitliğini yüksek enjeksiyon yöntemlerinden elde edilen doğrulukla birleştirmesi, ancak nihai hedefe daha az adımla ulaşmasıdır. Amacımız, hemo sit türlerini ve bunların immün zorlanmalara karşı bolluğunu belirlemektir.

Bu tekniği laboratuvarımdan lisans öğrencisi Amina Abdul Kum uygulamaktadır. Protokole başlamadan önce, hemolenf dilüent çözeltisini bir mililitrelik alikotlar halinde hazırlayın. Bunları -20 °C'de saklayın ve bir alikotun kullanılmayan herhangi bir kısmını tekrar dondurmayın.

Şimdi bir milimetre kalınlığındaki mikroskop lamları üzerine bir santimetrelik daireler çizin. Her sivrisinek için bir lam gereklidir. Çekilmiş iğneleri hazırlayın.

İğne için bir açıklık oluşturmak amacıyla çekilmiş her iğnenin ucunu kırın. Bir iğneyi, bir mikro enjektörün tüp ve şırınga bileşenlerine bağlı olan tutucusuna monte edin. Ardından, mineral yağ kullanarak tüp ve iğne tutucu düzeneğindeki hava kabarcıklarını giderin.

Bu el şırıngasıyla mineral yağı çekin ve içinde hava kabarcığı kalmadığından emin olun. Damlayan yağı toplamak için iğnenizin altına bir kap yerleştirin. Mikro enjektörün bu kısmını açın ve hava kabarcıklarını gidermek için buraya yağ doldurun.

Ve bu parça, tıpkı diğer uçta olduğu gibi, el tipi şırıngaya kolayca takılır. Mineral yağı, plastik tüplerden geçecek ve mevcut tüm hava kabarcıklarını giderecek şekilde yavaşça enjekte edin. Ardından, üst kısmı mineral yağı ile damlayacak noktaya gelene kadar tekrar doldurun.

Ardından, hava kabarcığı oluşmaması için düzeneği tekrar bu cam şırıngaya bağlayın. Sonra, iğne tüpleri ve şırınganın tamamı dolana kadar monte edilen bileşenleri mineral yağ ile geri doldurun. Mikro enjektör, artık dilüent iletimi için kullanıma hazırdır.

Ardından, buzun içine tamamen daldırılacak küçük, katı bir kafes kaba 15 yetişkin dişinin aspire edilmesiyle hayvanları hazırlamaya başlayın. Sivrisinekler, genellikle sekiz dakika veya daha kısa süren soğukla hareketsiz kaldıklarında anestezi altına girmiş olurlar. Anestezize edilmiş tek bir sivrisineği, mikroenjeksiyonun gerçekleştirileceği çukur lam üzerine yerleştirin.

Mikroskop altında, mikro enjektöre 12 µL hemolenf dilüenti çekin. Sivrisineği mikroskop altında pensle nazikçe sabitleyin ve 3 ila 3,5 µL dilüent enjekte edin. Yedinci ve sekizinci abdominal segment arasında abdomen şişecektir.

Seyreltici enjekte edilirken, üç sivrisineğe enjeksiyon yapılabilir. Mikro enjektörü yeniden doldurmadan önce, enjekte edilen tüm sivrisinekleri, yaklaşık beş dakika boyunca iyileşmeleri için buz üzerinde temiz bir plastik kaba yerleştirin. İnkübasyon sırasında, antikoagülan seyreltici, internal dokulara yapışmış hemositleri yerinden söker.

İlk grup hayvanlar inkübasyon sırasında iyileşirken, genellikle üç ila beş sivrisinek daha enjekte edilebilir. Kapta geçirdikleri beş dakikanın ardından, enjekte edilen sivrisineklerin üyelerini, kanatlarını ve abdomenlerinin uçlarını sekizinci segmentten mikro makasla keserek hazırlayın. Üyeleri ve kanatları toraksa veya hemo kısmına çok yakın yerden kesmemeye dikkat edin.

Sivrisinek kaçabilir. Şimdi bir aşındırılmış lamı %70 ethanol ile yıkayın ve mikroskop altında bir kim wipe ile kurulayın. Diseke edilmiş bir sivrisineği, aşındırılmış dairenin dış kenarına yerleştirin.

Mikro enjektörü 12 µL taze seyreltici ile doldurun. Sivrisineği pensle tutun ve meso thorax'ın yan tarafına 8 ila 10 µL enjekte edin. Bu enjeksiyondan sonra herhangi bir mineral yağı enjekte etmemeye dikkat edin.

Hemolenf, abdomen bölgesinden toplama dairesine alınacaktır; hemolenf akışını yönlendirmek ve teşvik etmek için pensle abdomene nazikçe baskı uygulayın. Toplanan hemolenfin lam üzerinde kurumasına izin verin. Bu işlem yaklaşık 10 dakika sürmelidir.

Ardından boyama işlemi için hazır hale gelir. Her bir lamı ayrı ayrı Hema three ile boyayın. Her lamı, her daldırmada sadece bir saniye olacak şekilde fiksatife beş kez daldırın.

Bunu, önce birinci çözeltiye ardından ikinci çözeltiye üçer kez birer saniyelik daldırmalarla takip edin. Şimdi lamın sadece arka kısmını deiyonize su ile durulayın, ön kısmını durulamayın. Ön yüzü kurulayın ve montaj medyumu ile bir lamel yerleştirin; medyumun boyanmış dokunun üzerini tamamen doldurması için lameli nazikçe bastırın.

En iyi sonuçlar için lamın en az üç saat boyunca kurumasına izin verin. Boyanan hemostatik hücreler, bu hazırlıktan sonraki iki hafta içinde incelenmeli ve görüntülenmelidir. Yetişkin dişilerden alınan bu hücreler, bu protokol kullanılarak tanımlanmıştır.

İlk görüntü, fal şekli ve yüksek çekirdek-sitoplazma oranına dayanarak bir pro-hemosit gösterse de, bu görüntü fal şekli ve sitoplazma-çekirdek oranına dayanarak bir ENO sitidir. Son olarak, bu bir granülosit tipi hemosittir.

Önceki yüksek enjeksiyon yöntemlerine kıyasla daha granüler bir dokuya sahiptir ve şekil olarak daha çok bir OID'dir. Bu protokol, benzer toplam hemosit sayısı sağlamış ve benzer şekilde granüler bölgeleri en yaygın hücre tipi olarak tanımlamıştır. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde uygulandığında yaklaşık 15 ila 20 sivrisinek için bir saat içinde tamamlanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, sivrisineklere dent maddesinin nasıl doğru şekilde enjekte edileceğini, hemolarailerinin nasıl toplanacağını ve ardından hemolarailerinin görselleştirme ve görüntüleme için nasıl hazırlanacağını iyi bir şekilde kavramış olmalısınız.