Name: Yellow Fever Sivrisinek Hemocytes Toplama ve Boyama için Protokol Aedes aegypti /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Öğrenin Aedes aegypti sivrisineklerinden hemosit toplama ve boyama yöntemini. Bu teknik perfüzyon ve enjeksiyonu birleştirerek temiz hemolit preparatları izole eder. Araştırmacılar için sivrisinek immünolojisi çalışmalarını kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

John Frey ve Ben Peterson Yazarlar sivrisinek yetiştirme için teşekkür etmek istiyorum. Biz de hemocyte mikrograflar yardım için teşekkür ederim. Christine Davis ve Gary Radice Bu araştırma, Richmond Sanat ve Bilim yaz bursu AA Qayum ve fakülte hibe A. Telang Üniversitesi tarafından finanse edildi.

1. Hemocyte toplama önceden hazırlanması <ol><li> (Antikoagülan; 98 mM NaOH, 186 mM NaCl, 1.7 mM EDTA, 41 mM sitrik asit, pH 4,5)% 60 Schneider Orta,% 10 fetal sığır serumu (FBS), ve% 30 sitrat tampon oluşan bir hemolimf seyreltici çözüm hazırlayın 11. -20 ° C'de saklanabilir 1.0 mL alikotları yapın (Malzeme) her bir kısım sadece bir kez kullanın. </li><li> Cam gravür aracını kullanarak bir ucunda 1 cm çapında bir daire puanlama cam mikroskop slayt (75 x 25 x 1 mm) hazırlayın. Alternatif olarak, iki ön kazınmış çevreleri ile mikroskop lamı (örneğin Fisher Scientific veya EMS kaynakları) satın alınabilir. Sivrisinek başına bir cam slayt ihtiyaç duyulacaktır. </li><li> (Malzeme) cam iğneler bir dizi hazırlayın aşağıda önerilen ayarları (Sutter Instruments, Model P-87) göre çekilir: <table border="1"><tbody><tr><td> Isı Rampa 5 </td></tr><tr><td> Çekme: 45 </td></tr><tr><td> Vel: 75 </td></tr><tr><td> Time: 175 </td></tr><tr><td> Basınç 580 </td></tr></tbody></table> Bu çektirmenin önerilen ayarları kullanarak, sap uzunlukları yaklaşık 3 mm toplam uzunluğu 500 mm çapında iğne inşa. Önceden çekilmiş iğneler de (örneğin TriTech Araştırma) satın alınabilir. </li></ol> 2. Hemocyte toplama önceden mikroenjektör hazırlanması <ol><li> Üreticinin talimatlarına göre mikroenjektör iğne tutucu çekti içine bir iğne takın. Dolgu mikroenjektör (Malzeme) boru, şırınga ve üreticinin talimatlarına göre mineral yağ ile cam iğne çekti. </li></ol> 3. Dişi sivrisineklerin hemocyte toplama önceden hazırlanması <ol><li> Buz ile temas halinde küçük katı kafesi kaplar içine 15 yetişkin kadın aspire. Yeterince derin buz sivrisinek daldırın kafes kafes ve tüm tarafların bu tüm yükseklik böylece buz ile temas halinde. Bu sivrisinek, soğuğa maruz olacağını garanti eder. Yaklaşık 8 dakika kadar veya Soğuk anestezisi sivrisinek artık hareketli. </li><li> Bir sivrisinek bir depresyon slayt üzerine yerleştirin. Bu slayt enjeksiyonlar için site olarak hizmet verecek. </li></ol> 4. Hemocyte toplama <ol><li> Mikroenjektör çekti cam iğne içine hemolimf seyreltici 12 ul sürebilir ve çözüm yedinci ve sekizinci karın segmentleri arasındaki sivrisinek içine enjekte etmek için ayarlayın. Yaklaşık 3 sivrisinek kadar alınan toplam 12 ul hacmi 3-3.5 ul enjekte edilebilir. Enjeksiyon yapılır sivrisinek forseps ile yavaşça yerinde tutulan olmalıdır. Küçük hacimli bir seyreltici mineral yağ enjekte ediliyor önlemek amacıyla iğnenin ucunda kalmalıdır. Enjeksiyondan sonra karın "dolu" ya da şişirilmiş bakmak gerekir. </li><li> Ayrı bir temiz bir kaba koyun, 5 dakika boyunca kurtarma buz sivrisinek enjekte. Sivrisinek içindeki antikoagülan seyreltici çözüm inkübasyon iç dokuya yapışmış hemocytes yerinden yardımcı olacaktır. Ortalama 3 ila 5 taze sivrisinekler, her 5 dakikada bir iyileşme döneminde enjekte edilebilir. </li><li> 5 dakika sonra kurtarma, bacaklarını snip, kanatlar ve mikro makaslar kullanılarak bir anda her sivrisinek birinin karın (sekizinci segment) ucu. Bu buz üzerinde yerleştirilen kurtarma fincan yapılmalıdır. Bacaklarını ve kanatlarını keserek koleksiyon slaytlar aktarılıyor ölçeklerin olasılığını azaltır. Not: bacakları kesilmiş ve kanatları çok torasik eklenti sitelerini yakın ya da kaçmaya hemolimf diğer açıklıklar yaratma riski yoktur. Hemolimf sadece karnın ucunda oluşturulan açılması yoluyla toplanan olmalıdır. </li><li> % 70 Etanol bir cam kazınmış mikroskop lamı kimwipe ile yıkayın ve kurulayın. Pozisyon kazınmış dairenin dış kenarından slayt sivrisinek enjekte ve iyileşti. Mikroenjektör taze hemolimf seyreltici 12 ul almak ve bu birimde, mesothorax lateral tarafında sivrisinek içine enjekte etmek için ayarlayın. Mineral yağ enjekte ediliyor önleyecek şekilde seyreltici değil tüm hacmi (10 ul yaklaşık 8) en sunun ama. Seyreltici bir iğnenin ucunda küçük hacimli kalmalıdır. </li><li> Kesme karın açılış kenarında 1 cm daire sivrisinek böylece yerleştirin. Enjeksiyondan sonra işaretli alana seyreltilmiş hemolimf içinde alınmalıdır. Iğne, mesothoracic enjeksiyon yerinden kaldırıldıktan sonra, forseps iki kolu arasındaki sivrisinek tutan devam kazınmış daire alan üzerine hemolimf doğrudan bu forseps ile karın hafifçe sıkın. </li><li> Seyreltilmiş hemolimf, yaklaşık 10 dakika veya kadar gözle görülür bir şekilde kuru slayt üzerinde kurumasına izin verin. </li></ol> 5. Hemocyte fiksasyon ve boyama <ol><li> Dip s: HEMA3 7 (Malzeme) ile ayrı ayrı slayt Lekemakrolid fiksatif 5 kez her defasında 1 saniye için, her 1 saniye için ve, nihayet, çözüm II daldırma slayt 3 kez, ben her 1 saniye için 3 kez çözüm Dipslide. DI su ile slayt arka durulayın. Slayt ön durulanır olmamalıdır. Kazınmış çemberin dışında boyanan doku içeren slayt ön Blot kurulayın. </li><li> Kazınmış merkezi etrafında montaj orta (örneğin Shur / Mount veya Polymount) uygulayın ve bunun üzerine bir kapak kayma yerleştirin. Kapak kayma (25 x 25 mm) üzerine hafifçe bastırın kapak kayma (boyanan doku içeren kazınmış daire dahil) kapsamındaki tüm alanı montaj orta yayılır. Slaytlar en az 3 saat veya gece boyunca kurumaya bırakın. Hemocytes optimum görüntüleme ve görüntüleme için toplama takiben 2 hafta içinde görülmelidir. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 1A-C sabit ve HEMA3 lekeli hemocytes Aedes aegypti yetişkin dişi toplanan örnekler gösterilmiştir. Şekil 1A, sitoplazma oranı (550x büyütme) 11 nükleer küçük boyutu, küresel sfero şekil ve yüksek dayalı bir prohemocyte olarak tanımlanan bir hemocyte gösterir . Şekil 1B nükleer oranı (550x büyütme), sfero şekil ve yüksek sitoplazma dayalı bir oenocytoid olarak sınıflandırılan bir hemocyte gösterir. Son olarak, Şekil 1C bir granülosit-tipi hemocyte (550x büyütme) gösterir. Granülositler doğada daha taneli ve cam yüzeylere bağlı olarak, şekil ve davranış daha amoeboid eğilimindedir. Hemocyte yazarak ve kurtarma 11 için daha önce yayımlanmış kriterler kullanarak, toplama yöntemi toplam hemocytes benzer bir numara verdi, ve biz de aynı şekilde granülositler, toplam hemocytes en büyük yüzde 11 (Şekil 2) makyaj bulundu . <img src="/files/ftp_upload/2772/2772fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 HEMA3 sabit bir temsilcisi, lekeli prohemocyte Işık mikroskop görüntüleri (A), oenocytoid (B) ve bir Ae granülosit (C). aegypti yetişkin kadın. C = sitoplazma, N = nükleus G = granüller. <img src="/files/ftp_upload/2772/2772fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 Toplam sayıları ± dişi sivrisineğin başına hemolimf seyreltme ve toplama yöntemi ile elde edilen tüm hemocytes ve granülositler GD.

<ol><li>Enayati, A., Hemingway, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+management%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Malaria management: past, present, and future.</a> Annu. Rev. Entomol. 55, 569-569 (2010).</li>
<li>Medlock, J., Luz, P. M., Struchiner, C. J., Galvani, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+transgenic+mosquitoes+on+dengue+virulence+to+humans+and+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Naturalist%22%5BJournal%5D)">The impact of transgenic mosquitoes on dengue virulence to humans and mosquitoes.</a> The American Naturalist. 174, 565-565 (2009).</li>
<li>Baton, L. A., Garver, L., Xi, Z., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomics+studies+on+the+innate+immunity+of+disease+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Functional genomics studies on the innate immunity of disease vectors.</a> Insect Sci. 15, 15-15 (2008).</li>
<li>Thomas, R. E., Wu, W. K., Verleye, D., Rai, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midgut+basal+lamina+thickness+and+dengue-1+virus+dissemination+rates+in+laboratory+strains+of+Aedes+albopictus+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Midgut basal lamina thickness and dengue-1 virus dissemination rates in laboratory strains of Aedes albopictus (Diptera: Culicidae).</a> J. Med. Entomol. 30, 326-326 (1993).</li>
<li>Bartholomay, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+infection+responses+in+the+haemocytes+of+the+mosquito%2C+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Profiling infection responses in the haemocytes of the mosquito, Aedes aegypti.</a> Insect Mol. Biol. 16, 761-761 (2007).</li>
<li>Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insect+cellular+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">The insect cellular immune response.</a> Insect Sci. 15, 1-1 (2008).</li>
<li>Hillyer, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+mortality+in+immune+challenged+mosquitoes+%28Aedes+aegypti%29+correlates+with+a+decrease+in+haemocyte+numbers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Age-associated mortality in immune challenged mosquitoes (Aedes aegypti) correlates with a decrease in haemocyte numbers.</a> Cell. Microbiol. 7, 39-39 (2005).</li>
<li>Chen, C. C., Laurence, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+study+on+humoral+encapsulation+of+microfilariae%3A+establishment+of+technique+and+description+of+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">In vitro study on humoral encapsulation of microfilariae: establishment of technique and description of reaction.</a> International Journal for Parasitology. 17, 781-781 (1987).</li>
<li>Beerntsen, B. T., Christensen, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dirofilaria+immitis%3A+effects+on+hemolymph+polypeptide+synthesis+in+Aedes+aegypti+during+melanotic+encapsulation+reactions+against+Microfilariae%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Dirofilaria immitis: effects on hemolymph polypeptide synthesis in Aedes aegypti during melanotic encapsulation reactions against Microfilariae.</a> Exp. Parasitol. 71, 406-406 (1990).</li>
<li>Hillyer, J. F., Schmidt, S. L., Christensen, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antibacterial+innate+immune+response+by+the+mosquito+Aedes+aegypti+is+mediated+by+hemocytes+and+independent+of+Gram+type+and+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Infect%22%5BJournal%5D)">The antibacterial innate immune response by the mosquito Aedes aegypti is mediated by hemocytes and independent of Gram type and pathogenicity.</a> Microb. Infect. 6, 448-448 (2004).</li>
<li>Castillo, J. C., Robertson, A. E., Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+hemocytes+from+the+mosquitoes+Anopheles+gambiae+and+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of hemocytes from the mosquitoes Anopheles gambiae and Aedes aegypti.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 36, 891-891 (2006).</li>
</ol>

Burada açıklanan hemocyte toplama yöntemi değiştirilmiş ve daha önce yayınlanmış yöntemlerden biri daha az adımlarla Aedes sivrisinek hemocytes temiz hazırlıkları izole etmek için izin verir . Bizim özel ilgi hemocyte Aedes sivrisinek popülasyonları karakterize yatıyor, biz doğru enjeksiyon hacimlerini belirlemek için ilk denemeler yapıldıktan sonra bu tekniğin diğer sivrisinek gruplarına uygulanabilir inanıyoruz. Bizim protokol salin solüsyonu yerine antikoagülan tamponlar kullanır ve in vivo...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> Schneider Orta </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S0146 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0643 </td><td></td></tr><tr><td> Hema3 leke kit </td><td> Balıkçı </td><td> 123-869 </td><td></td></tr><tr><td> Cam iğneler (Filament ile borosilikat) </td><td> Sutter Enstrüman </td><td> BF100-78-10 </td><td> 1.0mm OD ve 0.78mm ID </td></tr><tr><td> İğne çektirmesi </td><td> Sutter Aletleri </td><td> Model P-87 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroenjektör </td><td> TriTech Araştırma </td><td> MINJ-PD </td><td></td></tr><tr><td> İğne tutucu </td><td> TriTech Araştırma </td><td> MINJ-4 </td><td></td></tr></tbody></table>

yellow fever sivrisinek hemocytes toplama ve boyama için protokol aedes aegypti</em

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Sivrisinekler, sarı humma virüsü, sıtma parazitleri ve filarial solucanları gibi hastalığa neden olan patojenleri bir dizi için vektörler. Laboratuvarlar gibi patojenlerin 1, 2 dirençli transgenik sivrisinek üreten umuduyla hastalık vektör türlerinde doğuştan gelen bağışıklık sisteminin anti-patojen bileşenleri araştırıyoruz. Sivrisinek doğuştan gelen bağışıklık sisteminin savunma 3 birkaç satır oluşur . Epiteli-astarlı sivrisinek midgut 4 dayattığı bariyer kaçmayı patojenlerin hemolimf girin ve dolaşan hemocytes kapsülleyen önemli hücresel bileşenleri ve içine patojenlerin 5, 6 karşılaşma. Araştırmacılar, sivrisinekler hematopoetik dokular için kanıt değildir ve mevcut delil hemocytes sayısı yetişkin ortaya çıkması sabittir ve numaraları aslında sivrisinek yaşları 7 olarak azalabilir göstermektedir. Düzgün bir şekilde toplamak ve tıbben önemli böceklerden hemocytes tespit yeteneği hücresel bağışıklık çalışmaları için önemli bir adımdır. Ancak, sivrisinek, küçük boyutu ve sınırlı hemolimf hacmi bağışıklık hücreleri toplamak için bir meydan okuma oluşturmaktadır. Sivrisinek hemocytes toplamak için iki yerleşik yöntemlerin bir kesim burnumun 8 hemolimf sürülmesi ve ses hacmi (perfüzyon), tuzlu su, baş ve göğüs (yani, serviks) ve perfüze hemolimf toplanan arasında membranöz necklike bölgeye enjekte edilir karın 9, 10 distal bölgede yırtık bir açılış. Bu teknikler, ancak hemocytes düşük kurtarma ve sırasıyla 11 yağlı vücut hücreleri ile mümkün kirlenme ile sınırlıdır. Kirlenmesine neden olan ölçekler ve iç dokularda 11 seviyelerini azaltırken Daha yakın zamanlarda bir yöntem antikoagülan tamponlarının kullanımı ile immunocytes yüksek enjeksiyon / kurtarma, gelişmiş kurtarma olarak anılacaktır . Bu yöntem geliştirilmiş bir yöntem için birincil kültür hemocytes toplama ve bakımı sağlar, ancak enjeksiyon ve mansap hedefi teşhis için hemocytes, toplamak, düzeltmek ve leke ise gerekli değildir toplama adımları bir dizi gerektirir. Burada, Aedes sivrisinek hemocytes temiz hazırlıkları izole etmek için yüksek enjeksiyon tekniklerinin doğruluğu, salin solüsyonu yerine antikoagülan tamponlar kullanarak perfüzyon kolaylık getiren sivrisinek hemolimf toplama yöntem göstermektedir.

A açıklanmıştır sivrisinek hemocytes toplamak ve leke henüz doğru yöntem basitleştirilmiş. Bizim metodumuz Aedes sivrisinek hemocytes temiz hazırlıkları izole etmek için yüksek enjeksiyon teknikleri doğruluk ile perfüzyon sadeliği birleştirir. Bu yöntem çalışmaları gerektiren türleri hemocytes bilgi ve bolluk kolaylaştırır.

Yellow Fever Sivrisinek Hemocytes Toplama ve Boyama için Protokol Aedes aegypti</em

Sivrisinekler; sarı humma virüsü, sıtma parazitleri ve filaryal solucanlar gibi bir dizi hastalık yapıcı patojen için vektör görevi görürler. Laboratuvarlar...

Bu prosedürün genel amacı, sivrisineklerden hemositleri toplamak ve boyamaktır. Bu işlem, öncelikle soğutulmuş sivrisineklerin içine küçük hacimli bir antikoagülan seyreltici enjekte edilerek gerçekleştirilir. Hemositleri serbest bırakmak ve tüm hemositleri çözeltiye geçirmek için işlem uygulanır.Prosedürün ikinci adımı, sivrisineğin bacaklarını, kanatlarını ve abdomen ucunu çıkarmaktır. Üçüncü olarak, perfüzyon işlemini başlatmak için sivrisineğin ayrı bir bölgesine taze dilüent enjekte edilir. Son adım ise, toplanan hemositlerin fikse edilebilmesi ve boyanabilmesi için dilüe edilmiş hemolenfin hazırlanmış bir lam üzerine yönlendirilmesidir.Nihayetinde, temel kaydırmalı mikroskopi aracılığıyla, ilgili sivrisinek türlerinde bulunan temel hemo bölge türlerini ve sayılarını gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu tekniğin profüzyon gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, profüzyonun basitliğini yüksek enjeksiyon yöntemlerinden elde edilen doğrulukla birleştirmesi, ancak nihai hedefe daha az adımla ulaşmasıdır. Amacımız, hemo sit türlerini ve bunların immün zorlanmalara karşı bolluğunu belirlemektir.Bu tekniği laboratuvarımdan lisans öğrencisi Amina Abdul Kum uygulamaktadır. Protokole başlamadan önce, hemolenf dilüent çözeltisini bir mililitrelik alikotlar halinde hazırlayın. Bunları -20 °C'de saklayın ve bir alikotun kullanılmayan herhangi bir kısmını tekrar dondurmayın.Şimdi bir milimetre kalınlığındaki mikroskop lamları üzerine bir santimetrelik daireler çizin. Her sivrisinek için bir lam gereklidir. Çekilmiş iğneleri hazırlayın.İğne için bir açıklık oluşturmak amacıyla çekilmiş her iğnenin ucunu kırın. Bir iğneyi, bir mikro enjektörün tüp ve şırınga bileşenlerine bağlı olan tutucusuna monte edin. Ardından, mineral yağ kullanarak tüp ve iğne tutucu düzeneğindeki hava kabarcıklarını giderin.Bu el şırıngasıyla mineral yağı çekin ve içinde hava kabarcığı kalmadığından emin olun. Damlayan yağı toplamak için iğnenizin altına bir kap yerleştirin. Mikro enjektörün bu kısmını açın ve hava kabarcıklarını gidermek için buraya yağ doldurun.Ve bu parça, tıpkı diğer uçta olduğu gibi, el tipi şırıngaya kolayca takılır. Mineral yağı, plastik tüplerden geçecek ve mevcut tüm hava kabarcıklarını giderecek şekilde yavaşça enjekte edin. Ardından, üst kısmı mineral yağı ile damlayacak noktaya gelene kadar tekrar doldurun.Ardından, hava kabarcığı oluşmaması için düzeneği tekrar bu cam şırıngaya bağlayın. Sonra, iğne tüpleri ve şırınganın tamamı dolana kadar monte edilen bileşenleri mineral yağ ile geri doldurun. Mikro enjektör, artık dilüent iletimi için kullanıma hazırdır.Ardından, buzun içine tamamen daldırılacak küçük, katı bir kafes kaba 15 yetişkin dişinin aspire edilmesiyle hayvanları hazırlamaya başlayın. Sivrisinekler, genellikle sekiz dakika veya daha kısa süren soğukla hareketsiz kaldıklarında anestezi altına girmiş olurlar. Anestezize edilmiş tek bir sivrisineği, mikroenjeksiyonun gerçekleştirileceği çukur lam üzerine yerleştirin.Mikroskop altında, mikro enjektöre 12 µL hemolenf dilüenti çekin. Sivrisineği mikroskop altında pensle nazikçe sabitleyin ve 3 ila 3,5 µL dilüent enjekte edin. Yedinci ve sekizinci abdominal segment arasında abdomen şişecektir.Seyreltici enjekte edilirken, üç sivrisineğe enjeksiyon yapılabilir. Mikro enjektörü yeniden doldurmadan önce, enjekte edilen tüm sivrisinekleri, yaklaşık beş dakika boyunca iyileşmeleri için buz üzerinde temiz bir plastik kaba yerleştirin. İnkübasyon sırasında, antikoagülan seyreltici, internal dokulara yapışmış hemositleri yerinden söker.İlk grup hayvanlar inkübasyon sırasında iyileşirken, genellikle üç ila beş sivrisinek daha enjekte edilebilir. Kapta geçirdikleri beş dakikanın ardından, enjekte edilen sivrisineklerin üyelerini, kanatlarını ve abdomenlerinin uçlarını sekizinci segmentten mikro makasla keserek hazırlayın. Üyeleri ve kanatları toraksa veya hemo kısmına çok yakın yerden kesmemeye dikkat edin.Sivrisinek kaçabilir. Şimdi bir aşındırılmış lamı %70 ethanol ile yıkayın ve mikroskop altında bir kim wipe ile kurulayın. Diseke edilmiş bir sivrisineği, aşındırılmış dairenin dış kenarına yerleştirin.Mikro enjektörü 12 µL taze seyreltici ile doldurun. Sivrisineği pensle tutun ve meso thorax'ın yan tarafına 8 ila 10 µL enjekte edin. Bu enjeksiyondan sonra herhangi bir mineral yağı enjekte etmemeye dikkat edin.Hemolenf, abdomen bölgesinden toplama dairesine alınacaktır; hemolenf akışını yönlendirmek ve teşvik etmek için pensle abdomene nazikçe baskı uygulayın. Toplanan hemolenfin lam üzerinde kurumasına izin verin. Bu işlem yaklaşık 10 dakika sürmelidir.Ardından boyama işlemi için hazır hale gelir. Her bir lamı ayrı ayrı Hema three ile boyayın. Her lamı, her daldırmada sadece bir saniye olacak şekilde fiksatife beş kez daldırın.Bunu, önce birinci çözeltiye ardından ikinci çözeltiye üçer kez birer saniyelik daldırmalarla takip edin. Şimdi lamın sadece arka kısmını deiyonize su ile durulayın, ön kısmını durulamayın. Ön yüzü kurulayın ve montaj medyumu ile bir lamel yerleştirin; medyumun boyanmış dokunun üzerini tamamen doldurması için lameli nazikçe bastırın.En iyi sonuçlar için lamın en az üç saat boyunca kurumasına izin verin. Boyanan hemostatik hücreler, bu hazırlıktan sonraki iki hafta içinde incelenmeli ve görüntülenmelidir. Yetişkin dişilerden alınan bu hücreler, bu protokol kullanılarak tanımlanmıştır.İlk görüntü, fal şekli ve yüksek çekirdek-sitoplazma oranına dayanarak bir pro-hemosit gösterse de, bu görüntü fal şekli ve sitoplazma-çekirdek oranına dayanarak bir ENO sitidir. Son olarak, bu bir granülosit tipi hemosittir.Önceki yüksek enjeksiyon yöntemlerine kıyasla daha granüler bir dokuya sahiptir ve şekil olarak daha çok bir OID'dir. Bu protokol, benzer toplam hemosit sayısı sağlamış ve benzer şekilde granüler bölgeleri en yaygın hücre tipi olarak tanımlamıştır. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde uygulandığında yaklaşık 15 ila 20 sivrisinek için bir saat içinde tamamlanabilir.Bu videoyu izledikten sonra, sivrisineklere dent maddesinin nasıl doğru şekilde enjekte edileceğini, hemolarailerinin nasıl toplanacağını ve ardından hemolarailerinin görselleştirme ve görüntüleme için nasıl hazırlanacağını iyi bir şekilde kavramış olmalısınız.

a-protocol-for-collecting-staining-hemocytes-from-yellow-fever

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Dang virüsü için potansiyel refrakter olarak bir gen tespit edildikten sonra, bu sivrisinek içinde viral enfeksiyonların önlenmesinde rolü için değerlendirilmesi gerekmektedir. Bu protokol, dang sivrisinek enfeksiyonların ölçüde test nasıl göstermektedir. Kültür, membran beslenmesi sivrisinek insan kanı virüs büyüyor ve sivrisinek midgut viral titreleri assaying teknikler gösterilmiştir.

Dang Enfeksiyonlar Sivrisinekler (A. aegypti) ve Enfeksiyon Fenotip belirlenmesi için protokol

Sıtma için potansiyel bir gen refrakter olarak tespit edildikten sonra, bu sivrisinek içinde Plasmodium enfeksiyonları önlemede rolü için değerlendirilmesi gerekmektedir. Bu protokol, sivrisinek Plasmodium enfeksiyonların ölçüde test nasıl göstermektedir. Gametocyte kültür, membran beslenmesi sivrisinek insan kanı hazırlamak ve sivrisinek midgut viral titreleri assaying teknikler gösterilmiştir.

Sivrisinekler ve Enfeksiyon Fenotip belirlenmesi Plasmodium falciparum Enfeksiyonlar Protokol

Zamansal ve mekansal gen ekspresyon analizleri fonksiyonel genomik önemli bir role sahiptir. Tüm montaj...

Melezleme<em&gt; In situ</em&gt; Bezler, Yumurtalık ve Vektör Sivrisinek ve Embriyoların

Böcek hemocytes böcek tüm gelişim aşamalarında immün ve non-immün hem de pek çok önemli fonksiyonları, yürütmek. Hemocyte türleri ve işlev Bizim bugünkü bilgi böcek genetik modeller üzerinde çalışmalar geliyor. Burada, biz, ayıklanması ve niceleme yabani tırtıllar gelen hemocytes görselleştirmek için bir yöntem mevcut.

Vahşi Tırtıllar gelen Hemocytes ayıklamak için basit bir protokol

Floresan<em&gt; In situ</emSivrisinekler ve Mitotik Kromozomlar üzerinde&gt; Hibridizasyon

Elektrofizyolojik inceleme ile belirlendiği zaman Aedes aegypti büyük tat uzantıları gen ekspresyonunu değerlendirmek için iki yöntem kullanılarak,, varsayım olarak, acı ve itici bileşikler, nöronal yanıtları altında yatan genlerin dizi belirledik.

Fizyolojik Kayıtlar ve Sarı-ateş Sivrisinek Tat Çıkıntılara RNA Sıralama Aedes aegypti

Sunulan protokol, Aedes aegypti sivrisinek popülasyonlarının Zika gibi belirli bir virüs için vektör yeterliliğini bir muhafaza ortamında belirleyebilir.

Zika Virüsü Kullanan Aedes aegypti Sivrisineklerinde Vektör Yetkinlik Analizleri

Açıklanan, yumurtaları saymak ve 24 kuyu doku kültürü plakası kullanarak bireysel sivrisineklerin kuluçka oranlarını belirlemek için zaman ve yerden tasarruf sağlayan bir yöntemdir, bu da doğurganlık ve doğurganlık testlerinin ölçeğini ve hızını önemli ölçüde artırabilir.

24 Kuyu Doku Kültürü Plakası (EAgaL Plakaları) kullanılarak Aedes aegypti için Geliştirilmiş Doğurganlık ve Doğurganlık Tahlilleri

Bu protokolün amacı, yapay bir membran besleyici aracılığıyla Aedes aegypti sivrisineklerine hayvansal türevli ve yapay kan yemekleri sunmak ve yutturılan yemek hacmini tam olarak ölçmektir.

Aedes aegypti Sivrisineklerinde Hayvansal Türevli Kan ve Yapay Yemeklerin Beslenmesi ve Ölçülmesi

Burada, erkek Aedes aegypti'nin çiftleşme rekabet gücünün bir işaretleyici olarak floresan boyası kullanılarak incelenmesi için bir protokol sunuyoruz. Dişi sivrisinekler çiftleşme için hem işaretli hem de işaretlenmemiş erkeklere maruz kalır. Çiftleşme sonrası spermathecae'leri çiftleşme partnerlerini belirlemek için floresan mikroskop altında incelenir.

Erkek Aedes aegypti Sivrisineklerinde Çiftleşme Rekabet Gücünü Incelemek için Floresan Boyası Rhodamine B'yi Kullanmak

Burada, CRISPR-Cas9 teknolojisini kullanarak sivrisinek A. aegypti'de embriyonik mikroenjeksiyon yoluyla genom düzenleme için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

Sarı Humma Sivrisineği Aedes aegypti'de CRISPR-Cas9 Kullanılarak Genom Düzenleme

Öğrenin Aedes aegypti sivrisineklerinden hemosit toplama ve boyama yöntemini. Bu teknik perfüzyon ve enjeksiyonu birleştirerek temiz hemolit preparatları izole eder. Araştırmacılar için sivrisinek immünolojisi çalışmalarını kolaylaştırır.

Yellow Fever Sivrisinek Hemocytes Toplama ve Boyama için Protokol Aedes aegypti

Daha fazla video keşfet