Tüm Influenza Kantitatif Analiz Basit Slot Blot Tahliller Evrensel Antikorlar kullanarak Viral Hemagglutinins ve nöraminidaz yazın

Bu prosedürün genel amacı, korunumlu epitopları hedefleyen antikorlar kullanarak aşıların içindeki influenza viral hemaglütinin ve nöraminidaz içeriğini kantitatif olarak belirlemektir. Bu işlem, öncelikle korunumlu epitopların tanımlanmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, saptama hassasiyetini artırmak için referans ve aşı örneklerinin seyreltilmesidir.

Üçüncü adım, slot blot düzeneğinin kurulması ve numunelerin slotlara yüklenmesidir. Prosedürün dördüncü adımı, membrandaki HA veya NA'nın kendi evrensel antikorları kullanılarak tespit edilmesidir. Prosedürün son adımı ise densitometri yoluyla HA veya NA miktarlarının belirlenmesidir.

Nihayetinde, HA veya NA'nın kendi referans antijenlerine göre miktarının belirlendiğini gösteren sonuçlar elde edilebilir. Merhaba, ismim Anwar Hashem. Dr. Sean Lee'nin laboratuvarında doktora öğrencisiyim.

Merhaba, benim adım Caroline Grab ve Health Canada'daki Aşı Değerlendirme Merkezi'nde Dr. Sean Lee'nin laboratuvarında teknisyen olarak çalışıyorum. Bugün, influenza virüslerinin HA ve NA antijenlerini nicelendirmek için kullanılan bir slot bot prosedürünü uygulamalı olarak göstereceğiz. Bu tekniğin, tekli radyal immünodifüzyon (SRID) gibi mevcut yöntemlere veya fizikokimyasal yöntemlere göre temel avantajı, SRID'nin aksine suş veya alt tip spesifik antikorlar gerektirmemesi ve fizikokimyasal yöntemler gibi gelişmiş cihazlara ihtiyaç duymamasıdır.

Ayrıca, bu antikorlar bir RA'nın evrensel olarak korunan tek epitoplarını hedefledikleri için, ilgili araştırmacılar için temel araştırma araçları olarak kullanışlıdır. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler; çöktürülmüş aşı örneklerini bloke etmede zorluk, slotlar arasında örnek sızıntısı ve blotting aşamasında vakum kaybı gibi teknik sorunların yanı sıra, immün saptama sonrası gözlemlenen diffüz bantlarda yüksek arka plan gürültüsü gibi problemlerle karşılaştıkları için zorluk çekebilirler. Bununla birlikte, bazı kritik adımlarda dikkatli olmak bu sorunların çözülmesine yardımcı olabilir.

Bugün size bu prosedürü uygulamalı olarak göstereceğiz. Öyleyse başlayalım. Konserve bölgeleri belirlemek için, NCBI'dan alınan toplam 6.000'den fazla influenza A HA dizisini analiz etmek amacıyla cluster W hizalamaları kullandık ve HA2 alt biriminin N terminusünün yüksek derecede konserve bölge olduğunu tespit ettik.

Belirlenen konsensüs dizilerinin her bir amino asit pozisyonu için Shannon entropisi ve korunma oranı hesaplandı. Kırmızı ile gösterilen UNI one epitopu, slot blot analizi için HA'ya karşı evrensel bir antikor geliştirmek amacıyla seçilmiştir. Benzer bir yaklaşımla, tüm influenza A NA'larda iki evrensel olarak korunan dizi belirlenmiştir; bunlardan biri enzimatik olarak aktif bölgeye yakın, diğeri ise uç terminus kısmındadır. Bu amino asit dizilerine sahip peptitler, slot blot analizi için NA'ya karşı evrensel antikorlar üretmek amacıyla antijen olarak kullanılmıştır.

Slot blot prosedürüne başlamadan önce, hemaglütinin veya HA slot blot için TBS içinde 20 mililitre 4 M urea çözeltisi veya nöraminidaz veya NA slot blot için TBS içinde 20 mililitre %0,01 Tween 20 çözeltisi hazırlayın; ardından, TBS çözeltisini nihai konsantrasyonu %0,1 olacak şekilde ekleyerek iki litre yıkama tamponu hazırlayın. Daha sonra, yağsız süt tozunu yıkama tamponunda nihai ağırlık/hacim konsantrasyonu %5 olacak şekilde çözerek 80 mililitre bloklama tamponu hazırlayın. PVDF membranı metanol ile 15 saniye boyunca aktive edin ve ardından iki dakika boyunca çift distile su ile durulayın. Membranı kullanıma kadar TBS içinde bekletin; üç adet T blot SF filtre kağıdını kullanıma kadar TBS içinde önceden ıslatın; test edilecek aşı suşlarına karşılık gelen, önceden belirlenmiş HA içeriğine sahip influenza aşı referans standartlarını hazırlayın.

ABD'deki Biyolojik Değerlendirme ve Araştırma Merkezi'nden veya Birleşik Krallık'taki Ulusal Biyolojik Standart ve Kontrol Enstitüsü'nden temin edilmiş olup, HA referans antijenleri ve test aşı örnekleri için slot blot yöntemiyle HA veya NA miktar tayini için kullanılmıştır. Listelenen konsantrasyonlarda, dört molo üre içeren TBS içerisinde 650 µL seyreltilmiş HA referans antijen stoğu hazırlayın. Ardından, NA referans antijenleri ve test aşı örnekleri için iki kat fark oluşturmak ve örnek konsantrasyonlarının standart eğriye düşmesini sağlamak amacıyla, dört mo üre içeren TBS içerisinde 10 x, 20 x ve 40 x gibi üç farklı seyreltmede 650 µL test aşı örneği hazırlayın.

Sıralanan konsantrasyonlarda 0.01%sugen TBS içinde her birinden 650 mikrolitre NA antijen standart stokları hazırlayın; antijen standartları, yoğunluk sitometrisi analizleri ile birlikte SDS page kullanılarak kurum içinde hazırlanmıştır. Ardından, iki kat fark oluşturmak ve numune konsantrasyonunun standart eğri aralığına düşmesini sağlamak için test aşı numunelerinden 10 x, 20 x ve 40 x gibi üç farklı dilüsyonda 0.01%sugen TBS içinde 650 mikrolitre hazırlayın. Conta destek plakasını vakum manifolduna ve tavan contasını ise üzerine yerleştirerek önceden temizlenmiş ve kurutulmuş bir bio SF mikrofiltrasyon düzeneğini kurun.

Üç adet nemli BIO SF filtre kağıdı tabakasını contanın üzerine yerleştirin. Ardından önceden ıslatılmış PVDF membranı yerleştirin. Daha sonra numune şablonunu membranın üzerine yerleştirin ve membran yüzeyine eşit basınç uygulandığından emin olmak için dört vidayı çapraz bir düzenle parmağınızla sıkın. Cihazı bağlamadan önce, üç yollu valfin vakum manifoldunu vakum kaynağına maruz bırakacak şekilde ayarlandığını doğrulayın.

Pompayı çalıştırın ve bio dot düzeneğini bağlayın. Sonraki adımlarda numunelerin hızlı ve düzgün bir şekilde drene edilmesi için akış valfinin numune kuyucuklarının altında bir seviyeye konumlandırıldığından emin olun. Vida sıkma adımını çaprazlama düzenini kullanarak tekrarlayın.

Vakum uygulanırken vidaların sıkılması, daha sıkı bir sızdırmazlık sağlar ve kuyucuklar arası çapraz kontaminasyonu önler. Ardından, vakum manifoldunu havaya maruz bırakmak için akış valfini değiştirin ve pompayı kapatın. Sonrasında, membranı yeniden hidrate etmek için çok kanallı bir pipet kullanarak tüm kuyucuklara 100 µL TBS uygulayın.

Yuvayı eşit şekilde kaplamak için çözeltiyi, kuyucuğun ortasına ve mümkün olduğunca dibe yakın bir noktaya uygulayın. Oluşan hava kabarcıklarını gidermek için temiz bir pipet ucu kullanın. Manifoldu hem havaya hem de vakuma maruz bırakmak için akış valfini değiştirin.

Pompayı çalıştırın ve vakum miktarını ayarlamak için havaya açık olan gözenek üzerine bir parmağınızı koyarak tampon çözeltiyi kuyucuklardan nazikçe boşaltın. Ardından, manifoldu havaya maruz bırakmak için akış valfini değiştirin. Tampon çözelti tüm kuyucuklardan tamamen boşaltılır boşaltılmaz.

Pompayı kapatın veya vakumu kesin. Her kuyucuğa 200 µL standart veya aşı örneği seyreltisi uygulayın. Örnekleri, her seferinde bir tane olacak şekilde, her kuyucuğun merkezine ve mümkün olduğunca tabana yakın olacak şekilde pipetleyin.

Hava kabarcıklarının oluşmaması ve temizlenmesi için özen gösteriniz. Kullanılmayan kuyucuklara, kullanılan kuyucuklarda uygun vakum oluşmasını sağlamak için 200 µL örnek seyreltme tamponu ekleyiniz. Manifoldun hem havaya hem de vakuma maruz kalmasını sağlamak için akış valfini ayarlayınız.

Vakum pompasını çalıştırın ve havaya açık olan gözenek üzerindeki vakum miktarını bir parmağınızla kontrol ederek, örneklerin kuyucuklardan tamamen süzülmesini nazikçe sağlayın. Vakumu serbest bırakmak için parmağınızı porttan çekin. Tüm örnekler süzülür süzülmez işlemi hemen tamamlayın.

Her bir kuyucuğa 200 µL TBS ekleyin. Çok kanallı bir pipet kullanarak, havaya açık olan porta bir parmağınızla vakum miktarını kontrol ederek kuyucukları boşaltmak ve yıkamak için hafif bir vakum uygulayın. Kuyucuklar tamamen boşaldığında yıkama adımını bir kez tekrarlayın, ardından aşırı kurumayı önlemek için numune şablonunun vidalarını gevşetin ve vakumu kapatın.

Membranlar hemen kuyucuklardan çıkarılır ve bloklama tamponuna yerleştirilir. Membranı tamamen kaplayacak miktarda tampon kullanılır. Dört derece santigrat sıcaklıkta, hafifçe sallanarak gece boyu inkübe edilir.

Gece boyu süren inkübasyon ve bloklama tamponu uygulamasının ardından, membranı listelenen şekilde iki kez yıkayın; tüm yıkama ve inkübasyon işlemleri sırasında sallama platformu kullanın. Membranın çözelti ile tamamen kaplandığından emin olun.

Ardından, membranı HA'ya karşı uni one evrensel tavşan antikoru veya NA için evrensel antikolar HCA-2 veya HCA-3 ile, yıkama tamponunda %5 ağırlık/hacim BSA içinde seyreltilmiş olarak, oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin; bu antikurlar için tavşan antiserumunun 1:4.000 seyreltmeleri optimal sonuçlar vermiştir. Bunun ardından, membranı oda sıcaklığında, her seferinde 15 dakika boyunca nazikçe sallayarak üç kez yıkayın. Daha sonra membranı, bloklama tamponu ve 1:50.000 seyreltimindeki keçi anti IgG, IgG peroksidaz konjuge antikor ile oda sıcaklığında, nazikçe sallayarak 30 dakika boyunca inkübe edin; inkübasyon sonrası membranı yıkama tamponu ile oda sıcaklığında, her seferinde 15 dakika sallayarak üç kez yıkayın.

Ardından, membran yüzeyindeki kalıntı tween 20 deterjanını uzaklaştırmak için membranı beş dakika boyunca hafifçe sallayarak TBS ile yıkayın. Sonra, super signal West Dura extended duration substrate kitindeki her bir reajenden üç mililitre kullanarak geliştirme substratını hazırlayın ve karıştırın. Membranı, kuru bir kaba aktarmadan ve substratı uygulamadan önce fazla TBS tamponunu nazikçe uzaklaştırmak için kuru bir peçete üzerine yerleştirin; oda sıcaklığında hafifçe sallayarak beş dakika inkübe edin ve fazla substratı emdirerek uzaklaştırın.

İşlem tamamlandığında, membranı bir kemilüminesans filme maruz bırakın. Sinyal doygunluğunu önlemek için pozlama süresinin optimize edilmesi gerekecektir; ancak bu süre tipik olarak 10 saniye ile 10 dakika arasında değişir.

Her bir referans antijen replikat seti ve test aşı örneği için yoğunluk değerlerinin ortalamasını alın. Anlamlılık testi yapmak ve deneysel hatayı değerlendirmek için üçlü kitler gereklidir. Ortalama yoğunluk değerlerini, her bir yuvadaki HA veya NA antijen miktarına karşı grafiğe dökün.

Referans standarttan alınmıştır. Burada, değişken bir eğim ve lineer olmayan regresyon eğrisi uydurma yaklaşımını kullanarak, test örneği aşılarının yoğunluğundan örnek konsantrasyonunu ekstrapole etmek için bir referans aşı konsantrasyonu ve yoğunluğu kullanan, immünassayler için dört parametreli lojistik model gösterilmektedir. Standart eğrileri çizmek ve burada gösterildiği gibi elde edilen yoğunluk verilerinden konsantrasyonları belirlemek için Graph PRISM kullanılmıştır.

HA evrensel antikoru UNI one, viral dizilere karşı dikkat çekici bir özgüllük göstermiştir ve influenza'nın 13 farklı alt tipine bağlanma yeteneğine sahiptir. HA, virüs enfekte olmuş embriyolu tavuk yumurtalarının ENT toic sıvılarından ekstrakte edilmiştir. NP proteini yükleme kontrolüdür.

Negatif kontrol, enfekte edilmemiş yumurtalardan alınan alantoik sıvıdır ve pozitif kontrol ise NIBSC'den alınan H1 referans standardıdır. HA proteinlerinin hareketliliğinde gözlemlenen farklılıklar, muhtemelen boyutlarındaki ve/veya işlenme aşamalarındaki varyasyonlardan kaynaklanmaktadır. Burada gösterildiği gibi, NA'nın her iki korunmuş epitopuna karşı geliştirilen HCA-2 ve HCA-3 antikorları, NA'nın dokuz alt tipinin tamamına bağlanma yeteneği göstermiş ve alantoik veya hücresel proteinlere karşı çok düşük çapraz reaktivite sergilemiştir; P protein kontrolü Panel C'de gösterilmiştir. Pozitif kontrol, A/New Caledonia/20/99'un RNA1'i ile desteklenmiş ve ilgili antisera ile problanmış alantoik sıvıdır; NP protein kontrolü en altta gösterilmiştir.

Bu görüntü, influenza aşı referans standardındaki ve aşı örneklerindeki NA antijeninin miktar tayinine ilişkin HA sonuçlarına benzer temsili sonuçları göstermektedir. Yoğunluk analizi, bir aşı referans standardının çeşitli dilüsyonlarında slot blot ile tespit edilen NA antijeninden elde edilen sinyal yoğunluğunun, NA konsantrasyonu ile orantılı olduğunu göstermiştir. Bu prosedürü uygularken, çökmüş maddeleri çözmek ve slotun düzgün bir şekilde boşaldığından emin olmak için aşı örneklerinin ön işleme tabi tutulması gerektiğini hatırlamak önemlidir.

Kuyucuklar arasında numunelerin sızmasını önlemek için büyük özen gösterilmelidir. Yeni kullanılan her antikorun, geliştirme işleminden sonra arka plan gürültüsünü minimize ederken ideal yoğunlukta ve net sinyaller elde etmek için antikor dilüsyonlarının ve inkübasyon sürelerinin optimizasyonu gerekebilir. Bu teknik, influenza aşısı araştırmaları alanındaki bilim insanları için yol açmıştır.

HA ve NA antijenlerinin gelecekteki diğer kantitatif analizleri. Bu videoyu izledikten sonra, influenza virüslerinin önemli yüzey proteinlerinin, suşa özgü antikorlar kullanmadan basit deneylerle nasıl quantify edileceğine dair iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.