Name: Floresans Görüntüleme Living İzole Omurgalı fotoreseptör hücrelerinin hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Öğrenin, canlı izole omurgalı fotoreseptör hücrelerini floresans görüntüleme için hazırlama yöntemini. Bu teknik, hücre metabolizması ve sinyal iletimindeki gerçek zamanlı değişiklikleri incelemeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

NEI hibe EY014850 tarafından desteklenir.

1. Sylgard kapaklı sahanlar, deneysel odaları ve tıraş bıçakları hazırlanması <ol><li> Sylgard elastomer ile kaplı 35 mm Falcon Petri kutularına tek fotoreseptör hücreleri elde etmek için izole bir retina uygun kesme için gerekli. Elastomer tedarikçinin talimatlarına ve küçük bir miktar, bir tabaka ile alt kapak her çanak dökülür göre hazırlanır. Çanak kaplama sonra kapsar değiştirin ve saklayın. Elastomer birkaç gün zaman sertleşir ve bulaşıkları hazırız. </li><li> Böylece onlar bir görüntüleme deney sırasında hareketsiz İzole fotoreseptörlerin deneysel odasının alt sopa gerekir. Bu poli-L-lizin veya poli-L-ornitin odaları dipleri kaplama ile elde edilir. % 0.01 çözüm odasının her biri 200 mcL ekleyin ve tozdan korumak için bir kağıt havlu ile odaları kapsamaz. Çözüm kuruduktan sonra odaları, kapalı bir kutu distile su ve mağaza ile yıkayın. 2 hafta içinde kullanın. </li><li> Bir denemenin sonunda odaları temizlemek için herhangi bir yağ, yağ immersiyon objektif ve hücre enkaz kaldırmak için% 100 etanol ile yıkayın. Hücre enkaz kaldırmak için, pamuk uçlu aplikatörler kullanın ve odanın alt dikkatlice fırçalayın. Daha sonra, saf su ile yıkayın ve yeniden kaplama önce odaları kurumaya bırakın. </li><li> Metal kesici ile küçük parçalar (8 bir bıçak) çift kenarlı Jilet kesin. </li></ol> 2. Çözeltilerin hazırlanması <ol><li> Çözümlerinin bileşimi türüne bağlıdır. Amfibiler için, Ringer (mmol / L): 110 NaCl, 2.5 KCl, 1.6 MgCl 2, 1 CaCl 2, 5 Hepes, pH = 7.55. PH NaOH ile nihai değere ayarlanması gerekir. Memeliler için, Ringer (mmol / L): 130 NaCl, KCl 5, 0.5 MgCl 2, 2 CaCl 2, 25 hemisodium-HEPES, pH = 7.40. Ringer çözüm birkaç ay için, oda sıcaklığında iyi mühürlü muhafaza edilebilir. </li><li> Bakteri büyümesini önlemek için -20 ° C'de muhafaza Stok glukoz çözeltisi, 1 mol / L. </li><li> Deney günü, son 5 mmol / L konsantrasyonu Ringer çözümü için glikoz Günün sonunda, Ringer bakterilerin üremesine çünkü glikoz içeren atın. </li></ol> 3. Retina, izolasyon <ol><li> Retinanın uygun eksizyon için hayvan kurban önce en az 2-3 saat karanlık adapte olması önemlidir. Hayvanlar karanlık oda havalandırılmış uygun bir kapta koyu adapte edilmelidir. </li><li> Yarı yolda Ringer solüsyonu ile iki adet 35 mm Petri kapları doldurun. </li><li> Loş kırmızı ışık altında hayvan kurban ve gözleri kaldırın. Daha sonra, tüm işlemleri bir diseksiyon mikroskobu veya bir video monitör ile birlikte bir kamera kullanarak kızılötesi ışığı altında yürütülmektedir. </li><li> Gözün dış yüzeyinde herhangi bir artık doku çıkarın. Kes ve ön bölümü kaldırmak, daha sonra Ringer dolu Petri kutularına biri haline Göz yuvası aktarın. </li><li> Vitreus çıkarın ve dikkatli bir kısma ya da herhangi bir ek kesme Göz yuvası geri kalanı retinanın ayrılması. Retinanın hafifçe kaldırın ve Vizör adaptör tamamen ayrı. </li><li> Ikinci Petri kabı, plastik bir transfer pipet yardımıyla retina aktarın. Retinanın bir ışık geçirmez kutu içeren çanak tutun. </li></ol> 4. Tek fotoreseptör hücrelerinin izolasyonu <ol><li> Tüm işlemler kızılötesi ışık altında yürütülmektedir. Retinanın küçük bir parça kesin ve Sylgard kaplı çanak plastik bir pipet ile transfer. Retina parça içeren solüsyon hacmi 250 mcL ilgili olmalıdır. </li><li> Jilet bıçak tutucu ile küçük bir parça Grab bıçak kenarına sahibine yaklaşık 45 ° açı olmalıdır. Sylgard tabakası retina parça düzleştirin ve Sylgard katmanı yapışmış tutarak bıçağı ince retina parça doğrayın. </li><li> Çözümün bir deney odasına hücreleri içeren 200 mcL Transferi - retinanın Sylgard kaplı bir tabak içinde kalan herhangi bir parçası bırakın. Odanın ışık geçirmez bir kutuya izole hücreleri ile tutun. </li><li> 2-3 ml Ringer eklemek, sonra yerleşmek için hücreler için 10 dakika bekleyin. Bu aşamada, boya yükleme protokole göre izole hücrelerin belirli bir floresan boya (örneğin Fura-2) ile yüklü olabilir. </li><li> Hücreler artık deneyler için mikroskop aşamasında alınabilir. </li></ol> 5. Floresans görüntüleme <ol><li> Odanın Epifloresans mikroskop sahneye aktarın. Ayarlayın çözüm perfüzyon, sıcaklık probları, kızılötesi aydınlatma, vs. </li><li> Perdeleri kapatın ve deneme başlayacaktır. Mikroskop kafes içinde kızılötesi ışık açın, deneysel odasının alt odaklanmak ve hücreler için sahne taşımak. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonucus: Şekil 1. Bu protokol ile elde edilen bir semender (Ambystoma tigrinum) retinanın sağlıklı izole çubuk ve koni fotoreseptörlerin morfolojisi gösterir. Salamander hücreleri nedeniyle büyük boyutta ve birkaç saat sonra retina izolasyonu hayatta kalmak için yeteneklerini tek bir hücre floresan görüntüleme çalışmaları için yaygın olarak kullanılmaktadır. Buna ek olarak, bir semender retinanın bir çubuk ve koni fotoreseptörlerin hem de düzenli olarak elde edebilirsiniz. Hücrelerinin sağlığı için önemli bir kriter, sağlam bir elipsoid (Şekil 1), mitokondri yoğunlaşmıştır hücrenin bir parçası varlığıdır . Mitokondri hücreleri DAPI optik altında incelendi, bu konsantrasyon NADH varlığı nedeniyle, güçlü bir floresan sinyal (Şekil 2) verir . Sağlam bir elipsoid hasarlı hücre eksikliği genellikle deney Şekil için uygun olmayan bir işareti. 3 şişmiş bir hücre gövdesi ve yoğunlaştırılmış bir çekirdeği, bozuk bir semender çubuk fotoreseptör gösterir. Bu tür hücreler DAPI optik altında çok düşük floresan ekran, ama elipsoid bölge (okside flavin nükleotidler ve flavoproteins kaynaklanan) güçlü bir FAD sinyal göstermiyor FITC optik altında incelendi. Izole fotoreseptörlerin sağlık için bir başka kriter ışıkta stimülasyon üzerine dış segmentlerinde tüm-trans retinol (A vitamini) oluşturmak için yeteneğidir. A vitamini nesil önemli miktarda sağlam bir metabolik makine bağlıdır NADPH gerektirir. Şekil 4 ve 5 vitamini sağlam kurbağa ve fare çubuk fotoreseptör sırasıyla dış segmentlerinde bir oluşum göstermektedir. <img src="/files/ftp_upload/2789/2789fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Sağlıklı bir tek çubuk ve koni fotoreseptör hücrelerinin, bir kaplan semender retina izole edildi. Phototransduction dış segmentinde yer alır ve elipsoid yoğun mitokondri ile doludur. Çubuklar loş ışıkta görme, parlak ışık görüş için koniler için sorumludur. <img src="/files/ftp_upload/2789/2789fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Semender çubuk ve koni yaşam Floresan Bu kendi elipsoitlerin güçlü NADH floresan ve dış segmentlerinde anlamlı vitamin A floresan gösteren, koyu adapte hücrelerdir. Floresan görüntü yakalama, görünür ışık karanlık adaptasyon döneminden sonra ilk poz temsil eder. <img src="/files/ftp_upload/2789/2789fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Hasarlı semender çubuk fotoreseptör. Şişmiş hücre gövdesi ve özet çekirdeği hasar göstergesidir. Hücre ve okside minimal NADH sinyali (DAPI optik) var, ama çok daha güçlü FAD sinyali (FITC optik). <img src="/files/ftp_upload/2789/2789fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4. NADH ve retinol ile Kurbağa çubuk elipsoid bölgede güçlü NADH floresan gösteren sağlıklı bir kurbağa çubuk fotoreseptör. Önce dış segmente minimal floresan ışığa maruz kalma var. Işığa maruz kalma ardından, A vitamini oluşumu nedeniyle, dış segmentinde floresan önemli bir artış var. <img src="/files/ftp_upload/2789/2789fig5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5. Retinol ile Fare çubuk Bu sağlıklı bir fare fare çubuk fotoreseptörlerin elipsoid bölgelerinde güçlü bir floresan sinyal görünmüyor A vitamini oluşumu nedeniyle ışık maruz kaldıktan sonra önemli dış segmente floresan gösteren çubuk fotoreseptör.

<ol><li>Burns, M. E., Arshavsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+Counting+Photons%3A+Trials+and+Trends+in+Vertebrate+Visual+Transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Beyond Counting Photons: Trials and Trends in Vertebrate Visual Transduction.</a> Neuron. 48, 387-401 (2005).</li>
<li>Ebrey, T., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebrate+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Vertebrate Photoreceptors.</a> Prog Retin Eye Res. 20, 49-94 (2001).</li>
<li>Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+in+Vertebrate+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Adaptation in Vertebrate Photoreceptors.</a> Physiol Rev. 81, 117-151 (2001).</li>
<li>Palczewski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+Protein-Coupled+Receptor+Rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">G Protein-Coupled Receptor Rhodopsin.</a> Annu Rev Biochem. 75, 743-767 (2006).</li>
<li>Saari, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry+of+Visual+Pigment+Regeneration%3A+The+Friedenwald+Lecture%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Biochemistry of Visual Pigment Regeneration: The Friedenwald Lecture.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 41, 337-348 (2000).</li>
<li>Lamb, T. D., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dark+Adaptation+and+the+Retinoid+Cycle+of+Vision%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Dark Adaptation and the Retinoid Cycle of Vision.</a> Prog Retin Eye Res. 23, 307-380 (2004).</li>
<li>Imanishi, Y., Lodowski, K. H., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-Photon+Microscopy%3A+Shedding+Light+on+the+Chemistry+of+Vision%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Two-Photon Microscopy: Shedding Light on the Chemistry of Vision.</a> Biochemistry. 46, 9674-9684 (2007).</li>
<li>Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleached+Pigment+Produces+a+Maintained+Decrease+in+Outer+Segment+Ca2%2B+in+Salamander+Rods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Bleached Pigment Produces a Maintained Decrease in Outer Segment Ca2+ in Salamander Rods.</a> J Gen Physiol. 111, 53-64 (1998).</li>
<li>Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Bandarchi, J., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Dependent+Changes+in+Outer+Segment+Free-Ca2%2B+Concentration+in+Salamander+Cone+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Light-Dependent Changes in Outer Segment Free-Ca2+ Concentration in Salamander Cone Photoreceptors.</a> J Gen Physiol. 113, 267-277 (1999).</li>
<li>Woodruff, M. L., Sampath, A. P., Matthews, H. R., Krasnoperova, N. V., Lem, J., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Cytoplasmic+Calcium+Concentration+in+the+Rods+of+Wild-Type+and+Transducin+Knock-out+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Measurement of Cytoplasmic Calcium Concentration in the Rods of Wild-Type and Transducin Knock-out Mice.</a> J Physiol. 542, 843-854 (2002).</li>
<li>Leung, Y. T., Fain, G. L., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Measurement+of+Current+and+Calcium+in+the+Ultraviolet-Sensitive+Cones+of+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Measurement of Current and Calcium in the Ultraviolet-Sensitive Cones of Zebrafish.</a> J Physiol. 579, 15-27 (2007).</li>
<li>Matthews, H. R., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Spot+Confocal+Technique+to+Measure+Cytoplasmic+Calcium+Concentration+in+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Laser Spot Confocal Technique to Measure Cytoplasmic Calcium Concentration in Photoreceptors.</a> Methods Enzymol. 316, 146-163 (2000).</li>
<li>Szikra, T., Cusato, K., Thoreson, W. B., Barabas, P., Bartoletti, T. M., Krizaj, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+Calcium+Stores+Regulates+Calcium+Influx+and+Signal+Transmission+in+Rod+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Depletion of Calcium Stores Regulates Calcium Influx and Signal Transmission in Rod Photoreceptors.</a> J Physiol. 586, 4859-4875 (2008).</li>
<li>Krizaj, D., Copenhagen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+Calcium+Extrusion+Mechanisms+in+the+Outer+and+Inner+Segments+of+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of Calcium Extrusion Mechanisms in the Outer and Inner Segments of Photoreceptors.</a> Neuron. 21, 249-256 (1998).</li>
<li>Chen, C., Nakatani, K., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+Magnesium+Concentration+in+Salamander+Photoreceptor+Outer+Segments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Free Magnesium Concentration in Salamander Photoreceptor Outer Segments.</a> J Physiol. 553, 125-135 (2003).</li>
<li>Chen, C., Jiang, Y., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Behavior+of+Rod+Photoreceptor+Disks%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Dynamic Behavior of Rod Photoreceptor Disks.</a> Biophys J. 83, 1403-1412 (2002).</li>
<li>Tsina, E., Chen, C., Koutalos, Y., Ala-Laurila, P., Tsacopoulos, M., Wiggert, B., Crouch, R. K., Cornwall, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+Microfluorometric+Studies+of+Reduction+and+Clearance+of+Retinal+in+Bleached+Rod+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Physiological and Microfluorometric Studies of Reduction and Clearance of Retinal in Bleached Rod Photoreceptors.</a> J Gen Physiol. 124, 429-443 (2004).</li>
<li>Ala-Laurila, P., Kolesnikov, A. V., Crouch, R. K., Tsina, E., Shukolyukov, S. A., Govardovskii, V. I., Koutalos, Y., Wiggert, B., Estevez, M. E., Cornwall, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+Cycle%3A+Dependence+of+Retinol+Production+and+Removal+on+Photoproduct+Decay+and+Cell+Morphology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Visual Cycle: Dependence of Retinol Production and Removal on Photoproduct Decay and Cell Morphology.</a> J Gen Physiol. 128, 153-169 (2006).</li>
<li>Koutalos, Y., Cornwall, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluorometric+Measurement+of+the+Formation+of+All-Trans-Retinol+in+the+Outer+Segments+of+Single+Isolated+Vertebrate+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Microfluorometric Measurement of the Formation of All-Trans-Retinol in the Outer Segments of Single Isolated Vertebrate Photoreceptors.</a> Methods Mol Biol. 652, 129-147 (2010).</li>
<li>Wu, Q., Blakeley, L. R., Cornwall, M. C., Crouch, R. K., Wiggert, B. N., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interphotoreceptor+Retinoid-Binding+Protein+Is+the+Physiologically+Relevant+Carrier+That+Removes+Retinol+from+Rod+Photoreceptor+Outer+Segments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Interphotoreceptor Retinoid-Binding Protein Is the Physiologically Relevant Carrier That Removes Retinol from Rod Photoreceptor Outer Segments.</a> Biochemistry. 46, 8669-8679 (2007).</li>
<li>Kolesnikov, A. V., Ala-Laurila, P., Shukolyukov, S. A., Crouch, R. K., Wiggert, B., Estevez, M. E., Govardovskii, V. I., Cornwall, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+Cycle+and+Its+Metabolic+Support+in+Gecko+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Visual Cycle and Its Metabolic Support in Gecko Photoreceptors.</a> Vision Res. 47, 363-374 (2007).</li>
<li>Chen, C., Blakeley, L. R., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+All-Trans+Retinol+after+Visual+Pigment+Bleaching+in+Mouse+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Formation of All-Trans Retinol after Visual Pigment Bleaching in Mouse Photoreceptors.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 3589-3595 (2009).</li>
</ol>

Izole sağlıklı hücreler elde değilseniz, retinanın izolasyonu veya sağlık sorunu ya da doğrama ya yatıyor. Tipik olarak, göz ve vitreus ön çıkardıktan sonra, retina pigment epitel kolayca havalandığı. Göz yuvası çevreden başlayarak kapalı değilse, bunu kabuğu deneyin. Hala ayırmak için zor ise, daha büyük bir olasılık hayvan yeterli bir zaman dilimi için koyu adapte olmamıştır, ya da kırmızı ışık çok parlak. Hayvan için uygun karanlık adaptasyonu, ve loş kırmızı ışık olun. Retinada çubuk fotoreseptörlerin varlığı izole ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Isim </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> Karanlık oda (100-150 ft 2) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kırmızı ışık 19 </td><td></td><td></td><td> Online mağazalar </td></tr><tr><td> Kızılötesi ışık kaynakları ve kızılötesi görüntü izleyiciler </td><td> FJW Optik Systems, Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop 19 Diseksiyon </td><td></td><td></td><td> Infrared izleyiciler ile donatılmış </td></tr><tr><td> Epifloresans mikroskop ışık geçirmeyen bir kafesin 19 içine </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Diseksiyon araçları (makas, forseps, bıçak tutucu) </td><td> Roboz veya Güzel Bilim Araçları </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sylgard elastomer </td><td> İstanbul (Charlotte, NC) </td><td> Sylgard 184 elastomer kiti </td><td></td></tr><tr><td> Poli-L-ornitin (% 0.01) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4957 </td><td></td></tr><tr><td> Poli-L-lisin (% 0.1) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8920 </td><td> % 0.01 ile seyreltilir </td></tr><tr><td> Deneysel odaları </td><td> Warner Instruments (Hamden, CT) </td><td> D3512P </td><td></td></tr><tr><td> Petri kapları, plastik pipetler </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

floresans görüntüleme living İzole omurgalı fotoreseptör hücrelerinin hazırlanması

Preparation of Living Isolated Vertebrate Photoreceptor Cells for Fluorescence Imaging

Gözdeki, phototransduction ışık, bir elektrik sinyali dönüşüm, çubuk ve koni fotoreseptör hücrelerinin 1-4 tarafından yürütülmektedir. Rod fotoreseptörlerin loş ışıkta görme, parlak ışık konileri sorumludur. Phototransduction fotoreseptör hücre, görsel pigment, birincil ışık detektörü yüksek konsantrasyonda içeren özel bir bölmesi dış segmentinde yer alır. Retina cis, protein, opsin bağlı bir kromofor, 11 görme pigmenti oluşur. Görsel pigment tarafından emilir bir foton 11 kromofor isomerizes - cis-trans. Bu photoisomerization membran potansiyeli bir değişiklik sonuçlanan ve bir elektrik sinyali ışık uyaran transdüksiyon hakkında getirerek reaksiyonlar zincirini başlatan görsel pigment konformasyonel değişikliği beraberinde getiriyor. Işık uyarımı hücre kurtarma ışık ile aktive ara devre dışı bırakma ve membran potansiyeli yeniden kurulması içerir. Ca 2 + birkaç phototransduction yer alan enzimlerin aktivitesini modüle ve konsantrasyonu ışık uyarımı üzerine azalır. Bu şekilde, Ca 2 + hücre arka plan ışığı, ışık uyarılması ve adaptasyonu kurtarma önemli bir rol oynar . All-trans 5-7 cis kromofor iyileşme sürecinin bir diğer önemli bölümü, 11 photoisomerization ışık algılama sırasında tahrip olmuştur görsel pigment rejenerasyon. Bu yenilenme, apo-protein opsin geride bırakarak, all-trans retina photoactivated pigmenti tarafından serbest bırakılması ile başlar . Serbest bırakılan all-trans retina all-trans retinol, ve opsin NADPH kullanan bir tepki olarak hızla azalır, taze 11 ile birleşir - cis retina, görme pigmenti reform dış segmente getirilen. All-trans retinol sonra uzman taşıyıcı Interphotoreceptor retinoid Bağlayıcı Protein (IRBP) dış segmente ve komşu hücre içine transfer edilir. Floresan görüntüleme tek fotoreseptör hücrelerinin fizyolojisi ve hücre biyolojisi okumak için kullanılabilir. Ca 2 + duyarlı floresan boyalar 8-12 iç segmenti Ca 2 Ca 2 + mağazalar rolünün yanı sıra ışık dış segmente Ca 2 + değişiklikleri ve tepki arasındaki etkileşimi ayrıntılı olarak incelemek için kullanılabilir + homeostazı 13,14 . Floresan boyalar Mg 2 ölçmek için kullanılabilir + konsantrasyonu 15, pH, sulu ve membran bölmeleri 16 izleyiciler olarak. Son olarak, tüm-trans retinol (A vitamini) içsel floresan 17-19 tek fotoreseptör hücrelerinin oluşumu ve kaldırma kinetiği izlemek için kullanılabilir.

Floresan görüntüleme için farklı omurgalı türlerin tek yaşam fotoreseptör hücrelerinin hazırlanması için bir yöntem açıklanmıştır. Yöntem, NADH ya da A vitamini gibi endojen fluorophores, floresan görüntü veya Ca duyarlı Eksojen olarak eklenmiş floresan boyalar olabilir<sup&gt; 2 +</sup&gt; Ya da diğer faktörler.

Floresans Görüntüleme Living İzole Omurgalı fotoreseptör hücrelerinin hazırlanması

Omurgalı retinasında, ışığın elektriksel bir sinyale dönüştürülmesi olan fototransdüksiyon, çubuk ve koni fotoreseptör hücreleri tarafından gerçekleştirilir1-4.

Bu prosedürün genel amacı, floresan görüntüleme için tekil canlı fotoreseptör hücreleri hazırlamaktır. Bu işlem, öncelikle karanlığa adapte edilmiş bir retinanın izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı ise tekil canlı fotoreseptör hücrelerinin izole edilmesidir.Prosedürün üçüncü adımı, hücrelerin bir deney odasına aktarılmasıdır. Prosedürün dördüncü adımı, odanın mikroskop tablasına yerleştirilmesidir. Prosedürün son adımı ise sağlıklı bir hücrenin seçilmesidir. Floresan görüntüleme sayesinde; hücre floresansının görüntülenmesi yoluyla hücre metabolizması, sinyal iletimi, hücre içi taşınım veya oksidasyondaki gerçek zamanlı değişimleri gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bu yöntem, toksik yan ürünlerin temizlenmesi ve ışığın algılanması gibi omurgalı fotoreseptör alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin etkileri, hastalıkların fare modellerinden alınan fotoreseptör hücrelerini incelemek için kullanılabilmesi nedeniyle retina hastalıklarının tedavisine kadar uzanmaktadır. Protokole başlamadan önce, çeşitli malzemeleri önceden hazırlamanız gerekir.İlk olarak, elastomerin sertleşebilmesi için, tabak yüzeyini kaplayacak kadar cigar elas

preparation-living-isolated-vertebrate-photoreceptor-cells-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Geliştirilmesi ve Yetişkin hazırlanması Drosophila Brain ve Canlı Görüntüleme için Retinae

Bu video, çok renkli konfokal zaman atlamalı görüntüleme ve hedeflenen hücre ablasyon teknikleri verilmektedir. Time-lapse görüntüleme ilgi birden fazla hücre tiplerinin davranışlarını izlemek için...

Transgenik Zebra balığı Multicolor Time-lapse Görüntüleme: Hedefli Nöronal Hücre Ablasyon aktifleşir görselleştirme Retina Kök Hücreler

Bu makale, fare izole retinal hazırlanması incelemek ve kaydetmek için nasıl bir açıklama sağlar. Özellikle, floresan etiketli ganglion hücre popülasyonu ışık yanıtlarını kaydetmek ve daha sonra belirlemek ve morfolojisi analiz nasıl açıklar.

Genetik Etiketli Retina Ganglion Hücreleri Işık Tepkisi Record İzole Retina Hazırlık

Bu makale, tek tek hücrelerin sağlam fare retinada floresan etiketli nöron popülasyonları kayıt gösteriyor. Iki foton kızılötesi uyarma kullanarak transgenetically etiketli hücreleri ışık tepkileri, açık alan özellikleri, ve morfoloji çalışması için patch-klemp kayıt için hedef alındı.

Bozulmamış Retina Elektrofizyolojik Karakterizasyonu GFP-ifade eden hücre popülasyonlarının

Gerçek zamanlı görüntüleme embriyonik doku uzun süre boyunca meydan okuyor. Burada yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip uzun süre civciv omurilik hücresel ve alt hücresel değişikliklerin izlenmesi için bir test sunuyoruz. Bu teknik, sinir sistemi ve geliştirme embriyo diğer bölgeleri için adapte edilebilir.

Gelişmekte Neuroepithelium Hücre Davranış Yüksek çözünürlüklü Canlı Görüntüleme

Kaynak: Vacca, O., et al. Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease. J. Vis. Exp. (2015).Bu video, transgenik bir fare retinasında AAV aracılı gen aktarımı yöntemini ve ardından iç sınırlayıcı membran bütünlüğünü değerlendirmek için yapılan doku diseksiyonu ve boyama işlemlerini göstermektedir.

Bozulmuş Retinal Membran Bütünlüğünün Görselleştirilmesi için AAV Aracılı Gen Aktarımı

Kaynak: Laboissonniere, et. al. Retinal Ganglion Hücrelerinin Tanımlanmış Alt Kümelerinin Tek Hücreli RNA-Seq'i. J. Vis. Uzm.  (2017).  Bu video, transgenik bir fare retinasındaki retinal ganglion hücresi (RGC) alt tiplerini tanımlamak için bir floresan izleme tekniğini göstermektedir. İşlem, izole retinanın bir kayıt odasında sabitlenmesini, oksijenli perfüzyon ile hücre canlılığının korunmasını ve izleyicili bir pipet kullanılarak floresan olarak etiketlenmiş RGC'lerin hedeflenmesini içerir.

Fare Retinal Ganglion Hücre Alt Tiplerinin Floresan İzleme ile Tanımlanması

Burada, nöronal hücre tiplerinin izolasyondan önce sınıflandırılması ve ardından tek hücreli transkriptomların karakterizasyonu için kombinatoryal bir yaklaşım sunuyoruz. Bu protokol, başarılı RNA Sequencing (RNA-Seq) için numunelerin hazırlanmasını optimize eder ve özellikle hücresel çeşitliliğin daha iyi anlaşılması için tasarlanmış bir metodoloji tanımlar.

Retinal Ganglion Hücrelerinin Tanımlanmış Alt Kümelerinin Tek Hücreli RNA-Seqi

Zebra balığı retina rejenerasyon çoğunlukla sabit retina kullanılarak incelenmiştir. Ancak, bu tür interkinetic nükleer göç gibi dinamik süreçler rejeneratif tepki sırasında meydana gelen ve altında yatan mekanizmaları araştırmak için canlı hücre görüntüleme gerektirir. Burada, biz multiphoton mikroskopi kullanılarak Interkinetic Nükleer Göç (INM) gerçek zamanlı olarak izlemek için kültür ve görüntüleme koşulları açıklar.

Multiphoton Mikroskopi Canlı hücre Görüntüleme için Yetişkin Transgenik Zebra balığı Retina Eksplantlarından Kültür

Retina doku Imaging geleneksel biyokimyasal yöntemlerle toplanan tek hücreli bilgiler sağlar. Bu iletişim kuralı üzerinden Zebra balığı retina dilimleri hazırlanması için confocal düşsel açıklar. Floresan genetik olarak kodlanmış sensörler ve göstergesi boyalar görselleştirme çok sayıda biyolojik süreçlerin ayrı retina hücre türlerinde izin vermeyin.

Ex Vivo deneyler görüntüleme için yetişkin Zebra balığı üzerinden hazırlanması taze retina dilimleri

Bu protokol, sinir sistemi gelişimi sırasında H 2 O2'ninfizyolojik sinyal rollerini değerlendirmek için kültürlü zebra balığı nöronlarında ve larvalarında genetik olarak kodlanmış bir hidrojen peroksit (H 2 O2)-biyosensör kullanımını açıklar. Farklı hücre tiplerine uygulanabilir ve genel gelişimde reaktif oksijen türlerini (ROS) incelemek için deneysel tedavilerle değiştirilebilir.

Nöronal Gelişim Sırasında ROS Canlı Hücre Görüntüleme

Öğrenin, canlı izole omurgalı fotoreseptör hücrelerini floresans görüntüleme için hazırlama yöntemini. Bu teknik, hücre metabolizması ve sinyal iletimindeki gerçek zamanlı değişiklikleri incelemeye olanak tanır.

Floresans Görüntüleme Living İzole Omurgalı fotoreseptör hücrelerinin hazırlanması

Daha fazla video keşfet