Name: Elusive Küçük Memeliler Yüksek Kalite DNA Edinme Noninvaziv Saç Örnekleme Tekniği (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-13T09:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Keşfedin, American pika gibi uçucu küçük memelilerden noninvaziv tüy örnekleme ile yüksek kaliteli DNA elde etme yöntemini. Bu teknik, yaban hayatı ekolojisi ve koruma genetiği çalışmalarında hayvanları rahatsız etmeden genetik analiz yapmayı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz L. Evans, B. Granger, D. Rissling, Z. Sim, A. Goodwin, K. Hayhurst ve D. Kuch alanında yardım için teşekkür etmek istiyorum. K. Galbreath lütfen Bella Coola vadiden pika karaciğer örnekleri sağladı. Bu noninvaziv genetik örnekleme yöntemi tasarımına katkıda ilginç tartışmalar için, A. Gonçalves Da Silva ve K. Larsen teşekkür ederiz. Bu çalışma, Doğal Bilimler ve Mühendislik Araştırma Konseyi Kanada Keşif ve MAR UBC Okanagan Bireysel Araştırma hibe tarafından finanse edildi. İsviçre Ulusal Bilim Vakfı Doktora Bursu PBSKP3_128523 PH desteklenir. Bu çalışma, British Columbia Üniversitesi (A07-0126 Sertifika numarası) hayvan bakım protokolü takip yapıldı.

1. Saç tuzak Bir tuzak kurmak için önce, ideal bir konuma pika habitat veya talus eğimi içinde belirlenecek. Bu hayvanlar yaz sonu gibi tuvaletleri sitelerinde bulunan taze scats topladığımız bitki örtüsü önbelleklerini saman yığınları içerir. Şeritler ambalaj bant (uzunluğu 10-50cm), 360 derecelik bir yapışkan bir yüzey sağlamak için alınır ve zarf pika saman yığını (Şekil 1) veya tuvalet sitenin girişinde bir web gibi bir şekilde düzenlenmiştir. Misina kayaların yapılandırmasına bağlı olarak, bir parça saç tuzak yapısını desteklemek için kullanılır, fakat bu girişleri, tam olarak bir açıklama kullanımı oldukça küçük (çapı &lt;30cm) çoğu zaman gerekli değildir. Henry ve Russello (2010) 3 misina bulunabilir. Saç tuzaklarına mümkün olduğunca sık kontrol ve bant (Şekil 2) saç örnekleri üzerinde biriken sonra toplanan ve etiketlenir. Laboratuara bir kez geri taşınır, saçlar daha fazla manipülasyon kadar steril forseps kullanarak yapışkan bandı kaldırılmış ve kriyojenik tüpler aktarılır ve -20 ° C'de saklanır. Bağımsız kümelenmiş örnekleri farklı bireylere ait olduğu kabul edilir bir saç tuzak boyunca bir araya kümelenmiş Saç örnekleri, tek bir bireye ait olduğu kabul edilir. İkinci durumda, saç farklı tüpler yerleştirilir. Bu varsayımlar, daha sonra mikrosatellit genotipik verilere göre DNA parmak izi ve kimlik olasılık hesabı yoluyla test edilebilir. 2. DNA ekstraksiyonu Pika saç çok ince ve çok küçük bir kök ampul içerdiğinden, daha önce en az 25 kılların kaliteli downstream PCR 3 için yeterli miktarda DNA elde etmek için gerekli olduğunu göstermiştir . Biz DNA IQ sistemi (Promega, Madison, WI, USA) ve kıl örneklerinden DNA izolasyonu için üreticinin talimatlarına biraz değiştirilmiş bir versiyonu kullanıldı. Öncelikle, saç örneği tüp açarken saç kaybını önlemek amacıyla bir mikro santrifüj eğirilir. Daha sonra kuluçka çözüm Proteinaz K. Kuluçka 0.1 M DTT ve 1.8ng/ml bir final konsantrasyon neden DTT 10μl (1M) ve 10μl, proteinaz K (18ng/ml) ile 80 ul inkübasyon çözüm karıştırılarak hazırlanır solüsyonu (100 ul) örnek eklenir ve 56 ° C 'de 1 saat süreyle inkübe edilir. Bu arada, lizis çözüm 0.01m son bir DTT konsantrasyon, lizis tamponu her 100 ul DTT (1M) 1 ul ekleyerek hazırlanır. Hazırlanan lizis solüsyonu (200 ul), daha sonra 7 ul DNA IQ reçine ile birlikte, örnek, yüksek hızda 3 saniye için vortekslenmiş ve 5 dakika oda sıcaklığında inkübe. Örnek sonra 2 saniye boyunca vortekslenmiş ve manyetik boncuk çözüm ayrılması meydana gelen manyetik standı, takılmış. Sonra kalan çözüm emişli ve atılır, manyetik reçine pelet rahatsız etmemek için dikkatli olmak. Örnek sonra hazırlanan lizis çözüm vortekslenmiş ve ayrılık yeniden oluşursa manyetik stand döndü 100 ul ile tedavi edilir. Aspire lizis tamponu ve atılır ve bu adımı yıkama tamponu (100 ul) kullanarak üç kez tekrarlanır. Örnek daha sonra, 15 dakika boyunca manyetik stand kurumaya bırakılır. Kuruduktan sonra, 100 ul elüsyon tampon örnek eklenir ve 65 ° C'de 5 dakika inkübe. Örnek vortekslenmiş ve manyetik stand içine eklenir. Yıkandı, DNA içeren bir çözüm daha sonra 1.5 ml Eppendorf tüpüne aktarılır ve daha fazla manipülasyonlar kadar -20 ° C'de saklanır. Karaciğer örneklerinden DNA DNA IQ sistemi kullanılarak ayıklanır ve PCR için bir pozitif kontrol olarak kullanıldı. 3. PCR Noninvaziv saç tuzak ve karaciğer örnekleri elde edilen DNA, sonra yaygın olarak kullanılan moleküler belirteçlerin (mikrosatellit, AFLP, mitokondriyal sitokrom B ve ZFX / ZFY cinsiyet tayini işaretleyici) bir paketi yükseltmek için kullanılır. - 20 ng DNA, her astar 0.5 mcM, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM 10: PCR içeren 25 mcL hacmi Veriti termal cycler (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) kullanılarak yapıldı KCl, 1.5 mM MgCl 2, 200 mcM dNTP, 10 μ sığır serum albumini (BSA; New England Biolabs, Ipswich, MA, ABD) ve 0.5 U AmpliTaq Gold DNA polimeraz (Applied Biosystems). Mikrosatellit lokus'u Bisiklete binme parametreleri (95 10 dakika bir gol bisiklet programı kullanılarak optimize edilmiştir ° C, 95 ° C - 30 s, 30 s tavlama az 35 kür, 45 sn ve 72 ° C, 72 son bir adım ° C 10 dk). 1 azalarak tavlama ° C sıcaklık döngüsü başına 60 ila 55 ° C kalan 29 döngüleri 55 devam altıncı döngüsü, hangi noktada ° C ulaşana kadar Mitokondriyal parçaları için Bisiklete binme parametreleri yukarıda açıklandığı gibi ama bir tavlama ile 35 döngü oluşturdu50 ° C sıcaklık Amplifiye Fragment Uzunluk Polimorfizm Bonin 4 tarafından açıklanan omurgalı genomların için protokol yapıldı. Son olarak, moleküler cinsiyet tayini HinfI restriksiyon enzim sindirimi 5 ZFX / ZFY lokusların PCR-RFLP yöntemi kullanılarak yapıldı. Sindirilir ZFX / ZFX parçaları içeren% 3 agaroz jel üzerinde 100 baz puan (bp) merdiven (New England Biolabs) yanında çalıştırmak iken mikrosatellit AFLPs ve sitokrom B dizileri PCR ürünleri, ABI 3130XL genetik analizör (Uygulamalı Biyosistem) üzerine çalıştırmak % 2.5 SYBR Güvenli DNA jel leke (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ve KIRMIZI kişisel bir jel görüntüleme sistemi (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA) kullanılarak görüntülenebilmekte. Mikrosatellit ve AFLPs Genemapper v3.7 (Uygulamalı Biyosistem) ve mitokondriyal DNA kromatogram kullanarak Sequencher v4.7 (Gen Kodu Corporation, Ann Liman, MI, USA) kullanılarak görüntülendi görüntülendi. 4. Temsilcisi sonuçları Bizim noninvaziv tuzak kullanılarak elde edilen saç örneklerinden çıkarılan DNA PCR moleküler belirteçler çeşitli tip yükseltmek için kullanılmıştır. DNA karşılaştırması için bir temel olarak karaciğer örnekleri saç örnekleri yanında amplifiye edildi kullanarak ayıklanır. Nükleer mikrosatellit lokus'u saç ve karaciğer örnekleri (Şekil 3) hem de başarılı bir şekilde amplifiye edildi. Karaciğer örnekler kullanılarak sinyal yoğunluğu daha fazla olmasına rağmen, bu genotip puanlama üzerinde olumsuz bir etkisi yoktu (Şekil 3). AFLPs (Şekil 4), mitokondriyal DNA dizilerinin (Şekil 5) ve ZFX / ZFY moleküler cinsiyet tayini işaretleyici (Şekil 6) kullanarak benzer sonuçlar elde edildi. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 noninvaziv bir saç tuzak bir örnek, bir saman yığını. Kadar rulo ambalaj bant şeritler, saman yığını girişinde içine bir web gibi moda düzenlenmiştir. Misina bir parça saç tuzak için ek destek sağlamak için kullanılır. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2'de ambalaj bandı sıkışmış saç çok sayıda içeren bir başarıyla saç snare <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 bir temsilci nükleer mikrosatellit kromatogram (Ocp6) 8 Genemapper v3.7 (Applied Biosystems) görüntülenir. Üst kromatogram karaciğer dokusu yükseltme DNA ile elde edilen ve bu lokus (354/358) heterozigot idi. Alt kromatogram saç çıkarılan DNA dayalı bir heterozigot genotip (358/362) sergileyerek farklı bir kişi temsil eder. Saç örneği kromatogram sinyal karaciğer örneği daha düşük bir yoğunluğu olsa da, genotip puanlama sinyal bu fark olumsuz etkilenmez. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 temsilcisi AFLP kromatogram (E31T32) Genemapper v3.7 (Uygulamalı Biosystems) görüntülenir. Üst kromatogram karaciğer dokusu yükseltme DNA elde edildi, alt kromatogram saç çıkarılan DNA temsil eder. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5 Sequencher v4.7 (Gen Kod Corporation) görüntülenen bir temsilci, mitokondriyal DNA dizisi kromatogram (sitokrom B). Üst kromatogram karaciğer dokusu yükseltme DNA elde edildi, alt kromatogram saç çıkarılan DNA temsil eder. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig6.jpg" alt="Şekil 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 6"> Şekil 6, karaciğer ve saç örnekleri için yükseltilen temsili moleküler cinsiyet tayini işaretleyici (ZFX / ZFY) . Bu yaklaşım, Y kromozomu X kromozomu yoksun olduğunu, bu bölgede bir HinfI kısıtlama sitenin sahip olduğu gözlemine dayanır. Erkeklerde ise 432 bp, 261 bp ve 171 bp parçaları üreten Böylece, kadınlarda 432 bp iki ortak göç parçaları üretir.

<ol><li>Kendall, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demography+and+Genetic+Structure+of+a+Recovering+Grizzly+Bear+Population%5BTitle%5D)+AND+%22J+Wildlife+Manage%22%5BJournal%5D)">Demography and Genetic Structure of a Recovering Grizzly Bear Population.</a> J Wildlife Manage. 73, 3-3 (2009).</li>
<li>Rudnick, J. A., Katzner, T. E., Bragin, E. A., DeWoody, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-invasive+genetic+evaluation+of+population+size%2C+natal+philopatry%2C+and+roosting+behavior+of+non-breeding+eastern+imperial+eagles+%28Aquila+heliaca%29+in+central+Asia%5BTitle%5D)+AND+%22Conserv.+Genet%22%5BJournal%5D)">A non-invasive genetic evaluation of population size, natal philopatry, and roosting behavior of non-breeding eastern imperial eagles (Aquila heliaca) in central Asia.</a> Conserv. Genet. 9, 667-667 (2008).</li>
<li>Henry, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+population+structure+and+ex+situ+representation+of+the+endangered+Amur+tiger%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol%22%5BJournal%5D)">In situ population structure and ex situ representation of the endangered Amur tiger.</a> Mol Ecol. 18, 3173-3173 (2009).</li>
<li>Henry, P., Russello, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+high+quality+DNA+from+elusive+small+mammals+using+low-tech+hair+snares%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Wildlife+Res%22%5BJournal%5D)">Obtaining high quality DNA from elusive small mammals using low-tech hair snares.</a> Eur J Wildlife Res. , (2010).</li>
<li>Bonin, A., Pompanon, F., Taberlet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+amplified+fragment+length+polymorphism+%28AFLP%29+markers+in+surveys+of+vertebrate+diversity.+Method+Enzymol+395%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Use of amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers in surveys of vertebrate diversity. Method Enzymol 395.</a> , 145-145 (2005).</li>
<li>Fontanesi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexing+European+rabbits+%28Oryctolagus+cuniculus%29%2C+European+brown+hares+%28Lepus+europaeus%29+and+mountain+hares+%28Lepus+timidus%29+with+ZFX+and+ZFY+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Resour%22%5BJournal%5D)">Sexing European rabbits (Oryctolagus cuniculus), European brown hares (Lepus europaeus) and mountain hares (Lepus timidus) with ZFX and ZFY loci.</a> Mol Ecol Resour. 8, 1294-1294 (2008).</li>
<li>Piggott, M. P., Taylor, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+collection+of+animal+DNA+and+its+applications+in+conservation+management+and+understanding+the+population+biology+of+rare+and+cryptic+species%5BTitle%5D)+AND+%22Wildl.+Res%22%5BJournal%5D)">Remote collection of animal DNA and its applications in conservation management and understanding the population biology of rare and cryptic species.</a> Wildl. Res. 30, 1-1 (2003).</li>
<li>Banks, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demographic+monitoring+of+an+entire+species+%28the+northern+hairy-nosed+wombat%2C+Lasiorhinus+krefftii%29+by+genetic+analysis+of+non-invasively+collected+material%5BTitle%5D)+AND+%22Anim.+Conserv%22%5BJournal%5D)">Demographic monitoring of an entire species (the northern hairy-nosed wombat, Lasiorhinus krefftii) by genetic analysis of non-invasively collected material.</a> Anim. Conserv. 6, 101-101 (2003).</li>
<li>Litvaitis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+range-wide+survey+to+determine+the+current+distribution+of+New+England+cottontails%5BTitle%5D)+AND+%22Wildlife+Soc+B%22%5BJournal%5D)">A range-wide survey to determine the current distribution of New England cottontails.</a> Wildlife Soc B. 34, 1190-1190 (2006).</li>
<li>Peacock, M. M., Kirchoff, V. S., Merideth, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+nine+polymorphic+microsatellite+loci+in+the+North+American+pika%2C+Ochotona+princeps%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Notes%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of nine polymorphic microsatellite loci in the North American pika, Ochotona princeps.</a> Mol Ecol Notes. 2, 360-360 (2002).</li>
</ol>

Noninvaziv genetik örnekleme çeşitli nedenlerden dolayı geleneksel canlı yakalama yöntemleri için cazip bir alternatif haline gelmiştir. Birincisi, öne çıkmayan vahşi popülasyonlar biyolojik madde (örneğin, dışkı, tüyler, tüy, tükürük ve mukus) toplayarak, araştırmacılar, böylece hem hayvan ve araştırmacılar risklerin azaltılması, taşıma, hatta onları gözlemleyerek, rahatsız etmeden bu tür eğitim görebilirsiniz. İkincisi, zor ve nadir türlerin popülasyonlarında, daha geleneksel canlı tutucu yaklaşımları 6 ile zor bir görev noninvaziv genetik örnekleme çalışma biyologların sağlar. Ve üçüncüsü, NGS potansiyel böylece popülasyon parametreleri 7 tahminleri önyargıları en aza indirmek için yardımcı rahatsızlık hayvanlar, numune alma çabaları ve maliyetleri azaltarak, örnek boyutlarını artırabilir. Tehdit altındaki türler ile uğraşırken nüfus parametreleri önyargılı tahminler uygunsuz yönetimi neden olabilir Bu son nokta, önemli olabilir. Mevcut video makalede biz, bir örnek olarak Amerikan Pika, zor küçük memeliler örnek, basit, roman, ucuz ve noninvaziv bir yöntem kullanarak, açıklanmaktadır. Biz, bu non-invaziv örnekleme yöntemi, yakalama ya da ölümcül örnekleme yaşamak için cazip bir alternatif haline saç çıkarılan bu DNA mikrosatellit, AFLP, mitokondriyal ve cinsiyet tayini belirteçler açısından karaciğer örneklerden çıkarılan DNA benzer şekilde gerçekleştirir göstermektedir. Genel olarak, çalışmanın altında canlılar üzerindeki etkisini en aza indirirken, bu yöntem, nadir veya zor küçük memeli türlerin genetik ve davranışsal çalışmalar nüfus veri toplama aşamasında yararlı olacağını tahmin ediyoruz.

Saç tuzak: <ul><li> Net, ambalaj bandını Rolls (3M, St Paul, MN, ABD) </li><li> Misina (£ 10) </li><li> Kriyojenik tüp (2ml) </li><li> Steril forseps </li><li> Sıvı Azot Dewar (isteğe bağlı) </li></ul> DNA ekstraksiyonu: <ul><li> Doku ve saç çıkarma Kiti (Promega Kat. # DC6740), DNA IQ Sistemi (Promega Kat. # DC6701). </li><li> MagneSphere Teknoloji Manyetik Ayırma Standı (Kat. # Z5342; Promega) </li><li> Mikro santrifüj </li><li> Hibridizasyon fırın veya su banyosu </li><li> 1.5 ml Eppendorf Tüpleri </li></ul>

elusive küçük memeliler yüksek kalite dna edinme noninvaziv saç Örnekleme tekniği

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvaziv genetik örnekleme yaklaşımları yaban hayatı popülasyonları çalışma için giderek daha önemli hale gelmektedir. Bir dizi çalışmada, popülasyon genetiği ve vahşi popülasyonlar 1 demografi araştırmak için non-invaziv örnekleme teknikleri kullanılarak bildirdin . Bu yaklaşım, nadir veya zor türlerin 2 ile uğraşırken özellikle yararlı olduğu kanıtlanmıştır . Bu yöntemlerden bir dizi örnek saç, dışkı ve diğer etobur ve orta ölçekli memelilerin biyolojik madde için geliştirilmiş olsa da, büyük ölçüde zor küçük memeliler denenmemiş kaldı. Bu videoda, bir roman, ulaşılması zor bir küçük memeli, Amerikan pika (Ochotona princeps&#39;in) hedef ucuz ve noninvaziv saç tuzak mevcut. Biz web benzeri bir biçimde düzenlenmiş ve pikas &#39;yaşam alanı seyahat rotaları boyunca yerleştirilen bant ambalaj şeritleri oluşan saç tuzak, set-up genel açıklar. Biz büyük bir miktar sonra toplanır ve laboratuara geri getirdi saç toplama tuzak etkinliğini göstermektedir. Daha sonra DNA izole etmek ve nükleer Mikrosatellitlerin amplifiye parça uzunluk polimorfizmi (AFLPs), mitokondriyal dizileri (800bp) yanı sıra da dahil olmak üzere yaygın olarak kullanılan moleküler belirteçler yükseltmek için bu yöntemi, yardımcı vitrin DNA IQ sistemi (Promega) kullanımını göstermek bir moleküler cinsiyet tayini işaretleyici. Genel olarak, yaban hayatı nüfus biyologlar için bir örnekleme tekniği olarak bu romanı noninvaziv saç tuzak yararını göstermektedir. Biz bu yaklaşımın doğal popülasyonları içinde çalışma organizmaların etkilerini en aza indirerek, araştırma alanları açılması, küçük memeliler çeşitli için geçerli olacağını tahmin ediyoruz.

Biz Amerikan pika gösterildiği gibi, verimli bir şekilde zor küçük memeliler saç örnekleri toplamak için bir non-invaziv örnekleme yaklaşımı sunuyoruz. Biz örneklenmiş saç DNA açılan ve yaban hayatı ekolojisi ve korunması çalışmalarında yaygın olarak kullanılan moleküler belirteçler çeşitli yükseltme bu yöntemin yararını göstermektedir.

Elusive Küçük Memeliler Yüksek Kalite DNA Edinme Noninvaziv Saç Örnekleme Tekniği

Yaban hayatı popülasyonlarını incelemek için noninvaziv genetik örnekleme yaklaşımları giderek daha önemli hale gelmektedir. Bir dizi çalışma, ... kullanımını rapor etmiştir.

Yaban hayatı popülasyon genetikçileri, ilgilendikleri türlerden veri elde etmek için giderek daha fazla non-invaziv örnekleme yaklaşımlarını kullanmaktadır. Bu yaklaşımların; hayvan davranışı, popülasyon, demografi ve genetikle ilgili soruları araştırmada, özellikle nadir ve gizlenen hayvanlarda yararlı olduğu kanıtlanmıştır; araştırmacılar tüy gibi biyolojik materyalleri uzaktan toplayarak ilgilendikleri türleri rahatsız etmeden, onlara zarar vermeden ve hatta onları gözlemlemeden inceleyebilirler. Bu teknikler temel olarak boz ayılar gibi orta ve büyük boyutlu karnivorlara uygulanmış olsa da, bu boşluğu doldurmak adına küçük herbivor memelilere daha az odaklanılmıştır.Küçük memelileri örneklemek için yeni ve yenilikçi yaklaşımlar geliştirilmektedir. Bu video makalesi, Amerikan Pika olarak adlandırılan küçük lagomorflardan dikkat çekmeden tüy örnekleri elde etmenin yeni ve yenilikçi bir yolunu açıklamaktadır. Bu küçük memeliler, New Mexico ve Kaliforniya'dan Britanya Kolumbiyası'nın merkezine kadar Kuzey Amerika'nın tüm dağ silsilelerinde bulunur.Yırtıcılardan korunmanın yanı sıra çevresel ekstrem koşullardan da koruma sağlayan Tala Yamaçları adı verilen kayalık alanlarda yaşarlar. Genellikle yayılım alanlarının güney kesiminde deniz seviyesinden 2.500 metre üzerindeki rakımlarda bulunurlar, ancak dağılımlarının en kuzey noktasında deniz seviyesinde de görülebilirler. Pikalar kış uykusuna yatmazlar.Yaz boyunca gün içinde aktiftirler, ancak etkinliklerini sabah ve akşam saatlerinde yoğunlaştırırlar. Sıcaklıklar daha düşük olduğunda, çevredeki bitki örtüsüyle beslenmek için Tali yamacına komşu çayırlara çıkarlar. PIKA'nın bir özelliği, yiyeceklerini sadece açık alanda yememesidir.Onu Tallis'taki bölgesine geri götürür ve saman yığınlarında depolar. Tür kolayca tespit edilebilse de, doğası gereği ürkektir ve araştırmacılar tarafından yerleştirilen canlı tuzaklarından sıklıkla kaçınır. Ayrıca, bir dizi ekolojik, davranışsal ve evrimsel soruyu incelemek amacıyla yapılan müdahaleler sırasında pika'ların tutulmaya karşı hassas oldukları ve bunun hayvanın ölümüyle sonuçlanabileceği tespit edilmiştir.British Columbia Üniversitesi'nin Okanagan kampüsünden doktora adayı Philippe Henry, etkileri en aza indirgerken bu yakalanması zor küçük memeliden örnek alabilmek için türe uygun, non-invaziv bir örnekleme tekniği geliştirmiştir. Bir tuzak kurmadan önce, Tallis yamacındaki aktif PIKA bölgelerine dair kanıtlar aramaktadır. Bunlar arasında hayvanın kış boyunca hayatta kalabilmek için geç yaz döneminde topladığı bitki önbellekleri olan saman yığınları ve taze dışkılar yer almaktadır.Bu genellikle belirli yuva alanlarında bulunur. TLU içerisinde potansiyel bir habitat zirvesi belirlendiğinde, giriş kısmına stratejik olarak bir kıl tuzağı yerleştirilir. Philippe, bir paketleme bandı rulosu kullanarak, bant şeritlerini ustaca yuvarlar ve çevreleyecek şekilde örümcek ağı benzeri bir biçimde düzenler.Gizlenme tuzaklarının girişleri, hayvanın içinden geçebilmesi için ne çok büyük ne de çok küçük olan bir delik sağlayan karmaşık tasarımlarla yapılmıştır. Hipotetik olarak, bir pika günlük faaliyetlerini rahatsız edilmeden sürdürürken kapanın içinden geçecek ve geride tüy örneği bırakacaktır. Tüylerin kendisi, çok küçük bir kök yumrusuna sahip olup oldukça incedir.Analiz için uygun bir örnek elde edebilmek amacıyla, aynı bireye ait en az 25 kıl olması istenir. Ayrıca, etkileşim konumlarının bant boyunca birbirinden ayrı olması gerekir. Bağımsız olarak kümelenmiş olanlar, ayrı bireyler olarak kabul edilir.Bir arada kümelenmiş olanların aynı olduğu varsayılırken, toplanan saçlar, özellikle nükleer DNA'nın en yüksek konsantrasyona sahip olduğu kök soğanıyla birlikte, örneğin yapısını bozmadan steril penslerle banttan dikkatlice çıkarılabilir. Ardından, saç dikkatlice iki mililitrelik bir kriyojenik tüpe yerleştirilir ve örnek daha ileri analizler için laboratuvara ulaşana kadar sıvı azot tankında saklanır. Laboratuvara ulaştığında, tüp açıldığında saç kaybını önlemek için saç örneği bir mikro santrifüjde çöktürülür; DNA, Promega DNA IQ sistemi kullanılarak saç örneklerinden ekstrakte edilir. İlk adım, 100 microliters inkübasyon tamponu, 1.8 milligrams per milliliter proteinaz K ve 0.1 molar DTT içeren solüsyonun hazırlanmasını içerir.İnkübasyon çözeltisinin sonraki 100 µL'si saça eklenir ve 56 °C'de bir saat boyunca inkübe edilir. Ardından numune, 0,01 M DTT ve yedi µL resüspande edilmiş DNA IQ reçinesi içeren 200 µL lizis tamponu ile işlenir. Daha sonra numune yüksek hızda üç saniye boyunca vortekslenir ve oda sıcaklığında 5 ila 10 dakika inkübe edilir.Sindirilmiş numune daha sonra yüksek hızda iki saniye boyunca vortekslenir ve manyetik ayırma standına yerleştirilir. Bu noktada, DNA fragmanlarını içeren manyetik reçine çözeltiden anında ayrılır ve tüpün dibinde bir pelet oluşturur. Kalan çözelti daha sonra uzaklaştırılır ve atılır.Ardından, numune tekrar 100 µL lizis tamponu ile işlenip vortekslenir ve ayrışmanın gerçekleştiği manyetik standa geri yerleştirilir. Daha sonra, aynı işlem yıkama tamponu kullanılarak üç kez daha tekrarlanır. Son yıkamanın ardından, numune manyetik standda 15 dakika boyunca kurumaya bırakılır.Ardından, numuneye 100 µL elüsyon tamponu eklenir ve 65 °C'de beş dakika boyunca inkübe edilir. Son olarak, numune iki saniye boyunca vortekslenir ve manyetik standa yerleştirilir. DNA çözeltisi daha sonra 1,5 mL'lik bir ependorf tüpüne aktarılır ve -20 °C'de saklanır.Analizlere geçmeden önce kendimi tanıtayım; ben Peter Bohi. British Columbia Üniversitesi Okanagan kampüsünde, Dr. Michael Rosso'nun Ekolojik ve Koruma Genomiği laboratuvarında doktora adayıyım. Bu yaz örneklediğimiz kıllardan ekstrakte edilen DNA, PCR ile çeşitli moleküler markör türlerini amplifiye etmek için kullanılmıştır.Pozitif kontrol ve temel olarak karaciğer örnekleri de kullandık. Yöntemimizin karşılaştırılması için, hayvanımızda popülasyon ve genetik yapıyı incelemek amacıyla kullanılacak nükleer mikrosatellit lokuslarını ve rakım gradyanı boyunca genetik temel adaptasyonunu incelemek için kullanılacak A FLP genomik taramalarını amplifiye ettik. Ayrıca, türün filocoğrafyasını incelemek için kullanılabilecek 800 baz çiftine kadar mitokondriyal DNA sekanslarını amplifiye ettik ve popülasyonlarımızdaki bireylerin cinsiyetini belirlemek amacıyla çinko parmak sekansları ve P-C-R-R-F-L-P tabanlı moleküler cinsiyet belirleme aracını uyguladık.Test edilen tüm belirteçlerde, kıl ve karaciğer örneklerinden ekstrakte edilen DNA'lar, karşılaştırılabilir düzeylerde DNA dizisi ve genotip kalitesi üretmiştir. Bu videoda, DNA IQ ekstraksiyon protokolü ile birleştirilen bu non-invaziv örnekleme yönteminin etkili olduğunu ve PCR amplifikasyonu için yeterli kalite ve miktarda DNA sağlayan yeterli miktarda kıl örneği elde edilebildiğini gösterdik. Genel olarak, bu yöntemin, incelenen türler üzerindeki etkileri minimize ederken nadir veya ürkek küçük memelilerin popülasyon, genetik ve davranışsal çalışmalarına yönelik veri toplama sürecini kolaylaştırmada faydalı olacağını öngörüyoruz.

a-noninvasive-hair-sampling-technique-to-obtain-high-quality-dna-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Fare Tails Genomik DNA izolasyonu

Kazanç ya da kayıp fonksiyon-arabuluculuk lentivirüs kullanarak bir saç kökü yenilenme modeli Doku özgü analizi.

Saç Rejenerasyon sırasında epitelyal-mezenkimal Sinyal Rapid Genetik Analizi

Biz etiketleme ve yenidoğan farelerin genotiplenmesi ve onlardan birincil nöronal kültürlerin üreten prosedürleri açıklar. genotyping, hızlı, verimli ve güvenilir, ve otomatik nükleik asit ekstraksiyon için izin verir. Bu neonatally öldürücü fareler ve genotipleme önce tamamlanmasını gerektirmektedir kültürleri için özellikle yararlıdır.

Hayvanlar Rapid Genotipleme Beyin Nöronlar İlköğretim Kültürler kurulması izledi

Alopesi, kemoterapinin bir yan etkisi de dahil olmak üzere birçok farklı durumda ortaya çıkabilen yaygın bir saç dökülmesi şeklidir.  Farelerde saç dökülmesini ölçmek için, gri tonlamalı bir analiz yapmak için standart bir jel görüntüleyici kullanarak, umut verici yeni alopesi tedavilerinin incelenmesini kolaylaştırmak için bir yöntem geliştirdik.

Gri tonlama Analizi İle Farelerde Saç Dökülmesi Kantitatif Analiz Yeni Bir Teknik

Burada mevcut olan biyo-parçacıkların toplanması için, optimize edilmiş ve etkin bir temizleme stratejisi tarif tek-aşamalı bir 5 ul mikro hacim liziz / STR amplifikasyon içeren geliştirilmiş bir amplifikasyon protokolü ile birlikte numune 'DNA dokunun', bir geri kazanıma müsaade etmek kısa tandem tekrarı (STR) biyo-parçacık verici (ler) profilleri.

Adli &#39;Dokunmatik DNA&#39; Kanıt dan Basitleştirilmiş mikromanipulasyon tarafından Kurtarılan Tek İnsan Bioparticles geliştirilmiş Genetik Analiz

Bu makalede, biz emici microbiopsy tekniği nasıl yapılır ve nasıl örnek için RNA çıkarma basit ve aynı zamanda yapılan örnekleme için-deri ve kan minimal invaziv bir şekilde kullanılabileceğini göstermektedir.

Emici Microbiopsy örnekleme ve RNA çıkarma minimal invaziv, eşzamanlı kan ve cilt analizi için

Bu, vahşi doğada yakalanan yarasaların genomik, transkripsiyonik ve proteomik analizleri için en uygun doku hazırlığı için bir protokoldür. Bu yarasa yakalama ve diseksiyon, doku koruma ve yarasa dokusunun hücre culturing için protokoller içerir.

-Omics Analizleri ve Birincil Hücre Kültürü için Yarasaların Doku Toplama

Mevcut protokol, sürekli büyüyen bir fare kesici dişinden, fare azı dişinden ve insan dişlerinden tek hücreli RNA-seq analizine uygun tek hücreleri izole etmek için hızlı, verimli ve nazik bir yöntem sunar.

Fare ve İnsan Dişlerinden Tek Hücrelerin Hızlı İzolasyonu

Burada, artık yumurta kalıntılarının sahada toplanmasına dayanan kelebek popülasyonlarının noninvaziv genetik örneklemesi için basit bir protokol sunuyoruz. Tür kimliğini doğrulamak ve genetik çeşitliliği ölçmek için kullanılabilir. Bu protokol, toplum bilimi katılımı için daha geniş gruplara kolayca uyarlanabilir.

Nadir Kelebek Popülasyonlarının Tahribatsız Genetik Örneklemesini Yapmak için Topluluk Bilim Adamlarını Görevlendirmek

Biz postmortem insan beyni superior temporal girus III. Tabakası homojen bir hücre popülasyonu, piramidal nöronlar, RNA izole etmek ve ayıklamak için lazer yakalama mikrodiseksiyon kullanarak bir süreci tanımlar. Biz (T7 tabanlı) mRNA daha sonra doğrusal yükseltmek. Kullanmakta olduğunuz örnek Affymetrix insan X3P mikroarray melezleşme.

İnsan Postmortem Beyin Dokusu Tek Hücre Popülasyonlar Yüksek Kalite RNA Alınması

Keşfedin, American pika gibi uçucu küçük memelilerden noninvaziv tüy örnekleme ile yüksek kaliteli DNA elde etme yöntemini. Bu teknik, yaban hayatı ekolojisi ve koruma genetiği çalışmalarında hayvanları rahatsız etmeden genetik analiz yapmayı sağlar.

Elusive Küçük Memeliler Yüksek Kalite DNA Edinme Noninvaziv Saç Örnekleme Tekniği

Daha fazla video keşfet