Name: Kültür MSS Nöronlar Dendritik Omurga Morfoloji Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Öğrenin, kültüre edilmiş kortikal nöronlarda dendritik omurga morfolojisini ve hareketliliğini GFP ve konfokal mikroskopi kullanarak analiz etme yöntemini. Bu teknik sinaptik plastisite ve nöronal hastalıklarda yapısal değişiklikleri incelemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Kelly Jones Biz dikkatli bir düzenleme için teşekkür ederim. Amerikan Kalp Derneği Doktora Sonrası Bursu (DPS);; Bu çalışma NIH hibe R01MH 071.316, Alzheimer Derneği, Şizofreni ve Depresyon (NARSAD) Araştırma Ulusal İttifak, ve Otizm Araştırma Ulusal İttifak (naar) (PP) tarafından desteklenen edildi Amerikan Kalp Derneği predoctoral Bursu (KMW).

<ol><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+neuronal+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developments in neuronal cell culture.</a> Nature. 336, 185-186 (1988).</li>
<li>Xie, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kalirin-7+controls+activity-dependent+structural+and+functional+plasticity+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Kalirin-7 controls activity-dependent structural and functional plasticity of dendritic spines.</a> Neuron. 56, 640-656 (2007).</li>
<li>Spear, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+adolescent+development+and+alcohol+use+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Res+Health%22%5BJournal%5D)">Modeling adolescent development and alcohol use in animals.</a> Alcohol Res Health. 24, 115-123 (2000).</li>
<li>Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Liu, F., Brandon, N. J., Penzes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+receptor+ss+activity+modulates+synaptic+signaling+and+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Estrogen receptor ss activity modulates synaptic signaling and structure.</a> J Neurosci. 30, 13454-13460 (2010).</li>
<li>Srivastava, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+enhancement+of+two-step+wiring+plasticity+by+estrogen+and+NMDA+receptor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Rapid enhancement of two-step wiring plasticity by estrogen and NMDA receptor activity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105, 14650-14655 (2008).</li>
<li>Woolfrey, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epac2+induces+synapse+remodeling+and+depression+and+its+disease-associated+forms+alter+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Epac2 induces synapse remodeling and depression and its disease-associated forms alter spines.</a> Nat Neurosci. 12, 1275-1284 (2009).</li>
<li>Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+actin+in+anchoring+postsynaptic+receptors+in+cultured+hippocampal+neurons%3A+differential+attachment+of+NMDA+versus+AMPA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors.</a> J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).</li>
<li>Harms, K. J., Tovar, K. R., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse-specific+regulation+of+AMPA+receptor+subunit+composition+by+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synapse-specific regulation of AMPA receptor subunit composition by activity.</a> J Neurosci. 25, 6379-6388 (2005).</li>
<li>Xie, Z., Huganir, R. L., Penzes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+dendritic+spine+structural+plasticity+is+regulated+by+small+GTPase+Rap1+and+its+target+AF-6%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent dendritic spine structural plasticity is regulated by small GTPase Rap1 and its target AF-6.</a> Neuron. 48, 605-618 (2005).</li>
<li>Jones, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+modulation+of+spine+morphology+by+the+5-HT2A+serotonin+receptor+through+kalirin-7+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Rapid modulation of spine morphology by the 5-HT2A serotonin receptor through kalirin-7 signaling.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 19575-19580 (1957).</li>
<li>Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+spine+motility+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 13438-13443 (1999).</li>
<li>Lichtman, J. W., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy.</a> Nat Methods. 2, 910-919 (2005).</li>
<li>Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+spines+and+dendrites+distribute+dye+evenly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Do spines and dendrites distribute dye evenly.</a> Trends Neurosci. 27, 445-446 (2004).</li>
</ol>

Bu çalışmanın Üretim MetaMorph (Moleküler Devices, Inc.) Tarafından desteklenmiştir.

Bu teknikler, neuropathologies için katkıda bulunabilir post-sinaptik mekanizmalarının etkilerini anlamak üzerine odaklı dendritik omurga morfolojisi, sabit veya canlı birincil kortikal nöronların lineer yoğunluk ve motilite ayrıntılı kantitatif analiz için yukarıda anlatılan. Benzer bir yaklaşım, hipokampal piramidal, Purkinje, ya da orta dikenli bir nöronlar da dahil olmak üzere herhangi bir dikenli bir nöron omurga morfolojisi ve motilitesi, ölçmek için kullanılabilir. Burada açıklanan pr...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> 18 mm yuvarlak Kapak cam No 1.5 </td><td> Warner Aletleri </td><td> 64-0714 (CS-18R15) </td><td></td></tr><tr><td> 22 mm kare Kapağı cam No 1.5 </td><td> Warner Aletleri </td><td> 64-0721 (CS-22S15) </td><td></td></tr><tr><td> Poly-D-Lizin </td><td> Sigma </td><td> P-0899 </td><td> MW 70 ~ 150 kDa </td></tr><tr><td> Neurobasal Medya </td><td> Invitrogen </td><td> 21103049 </td><td></td></tr><tr><td> B27 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504044 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamin </td><td> Invitrogen </td><td> 21051024 </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin-Streptomisin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140148 </td><td></td></tr><tr><td> D, L-APV (AP-5) </td><td> Ascent Bilimsel </td><td> ASC-004 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668019 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965092 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Mediatech Cellgro </td><td> 25-060-C 1 </td><td> 1M, pH 7 </td></tr><tr><td> Formaldehit Çözüm </td><td> Merck Kimyasallar </td><td> FX0415-5 </td><td> % 36, Histoloji derece </td></tr><tr><td> Normal Keçi Serum </td><td> VWR </td><td> 100188-514 </td><td> Jackson Immunoresearch Labs </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC21568-2500 </td><td> Acros Organics </td></tr><tr><td> Alexa Fluor yüksek 488 keçi anti-fare IgG (H + L) çapraz adsorbe </td><td> Invitrogen </td><td> A-11.029 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 keçi anti-tavşan IgG (H + L) * yüksek çapraz adsorbe * </td><td> Invitrogen </td><td> A-11034 </td><td></td></tr><tr><td> Altın antifade reaktif uzatmak </td><td> Invitrogen </td><td> P36934 </td><td> Özel ambalajlar </td></tr><tr><td> Kapalı görüntüleme aşamasında haznesi </td><td> Warner </td><td> RC-30HV </td><td></td></tr><tr><td> Sıcaklık kontrol ünitesi </td><td> Warner </td><td> TC-344B </td><td></td></tr><tr><td> MetaMorph </td><td> Evrensel Görüntüleme </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kültür mss nöronlar dendritik omurga morfoloji analizi

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritik dikenler, beynin içinde eksitatör bağlantılarının büyük çoğunluğu siteleri, ve sinapsların post-sinaptik gözü formu. Bu yapılar aktin zengin ve son derece dinamik olduğu gösterilmiştir. Klasik Hebbian plastisite nöromodülatör sinyallerinin yanı sıra tepki olarak, dendritik dikenler şekli ve sayısı, arıtma ve nöral devrelerin beynin içinde bilgi işleme ve depolama için kritik olduğu düşünülmektedir değiştirebilirsiniz. Dendritik dikenler içinde, proteinlerin karmaşık bir ağ dendritik omurga morfolojisi ve sayısının kontrolü sağlayan aktin cyctoskeleton ekstrasellüler sinyaller bağlantı. Nöropatolojik çalışmalar, şizofreni, otizm spektrum bozuklukları arasında değişen bir dizi hastalık durumlarında, anormal dendritik omurga morfolojisi veya numaraları görüntülemek göstermiştir. Ayrıca, son genetik çalışmalar, bu proteinlerin, kısmen, bu bozuklukların patofizyolojisinde altında yatan anormal omurga plastisite katkıda bulunabilir önerileri yol sinaptik proteinleri kodlayan birçok genlerindeki mutasyonlar belirledik. Dendritik omurga morfolojileri / sayısını kontrol etmek, bu proteinlerin potansiyel rolünü araştırmak için, kültürlü kortikal nöronların kullanımı çeşitli avantajlar sunuyor. Birincisi, bu sistem sabit hücreleri dendritik dikenler yüksek çözünürlüklü görüntüleme gibi canlı hücreler zaman atlamalı görüntüleme için izin verir. İkincisi, in vitro sistemde bu mutant protein, shRNA yapıları tarafından demonte veya farmakolojik tedaviler ifade protein fonksiyonunun kolay manipülasyon için sağlar. Bu teknikler, araştırmacılar, hastalıkla ilişkili proteinlerin rolünü incelemek ve mutasyonlar bu proteinlerin in vivo fonksiyonu nasıl tahmin başlamak için izin verir.

Çok sayıda yeni çalışmalar sinaptik proteinlerin beyin patolojileri ile ilişkili mutasyonlar belirledik. Primer kültür kortikal nöronların dendritik omurga morfoloji ve motilite bu hastalıkla ilişkili proteinlerin etkilerini inceleyen büyük esneklik sunar.

Kültür MSS Nöronlar Dendritik Omurga Morfoloji Analizi

Dendritik dikenler, beyindeki eksitatuar bağlantıların çoğunluğunun gerçekleştiği bölgelerdir ve sinapsların post-sinaptik kompartmanını oluştururlar. Bunlar...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, çeşitli moleküler ve farmakolojik manipülasyonların dendritik dikensi morfoloji ve hareketliliği üzerindeki etkilerini değerlendirmektir. Bu, nöronal morfolojiyi belirlemek ve endojen protein ekspresyonu ile fonksiyonunu manipüle etmek için, dışsal DNA plazmit ekspresyonu olan veya olmayan, GFP ile işaretlenmiş primer kültür kortikal nöronların kesilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda hücrelere farmakolojik işlem uygulanabilir ve ardından hücreler immün boyama için fikse edilebilir veya zaman ayarlı (time-lapse) görüntüleme için hazırlanabilir.Ardından, dendritik dikenlerin ve dendritik diken morfolojisi ile hareketliliğinde meydana gelen indüklenmiş değişikliklerin görselleştirilmesine olanak sağlayacak farmakolojik tedavi uygulanır. Daha sonra, konfokal mikroskop kullanılarak fikse edilmiş hücrelerin Z serisi görüntüleri veya canlı hücrelerin belirli zaman noktalarında alınan görüntüleri elde edilir. Dendritik diken morfolojisinin detaylı ölçümleri, Z serisi görüntülerinin 2D projeksiyonlarından yapılabilir.Elde edilen sonuçlar, dendritik diken şeklinin veya hareketliliğinin kantitatif morfolojik analizine dayanarak, moleküler veya farmakolojik manipülasyonların dendritik diken morfolojisi veya hareketliliği üzerindeki etkisini göstermektedir. Bu yöntem; sinaptik plastisite nasıl düzenlenir? Eksitatör sinapslar nasıl gelişir? gibi nörobilimdeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Sinapslar nasıl korunur veya nasıl ortadan kaldırılır? Nörotransmitterler veya genler gibi moleküller sinaps yapısını nasıl düzenler? Bu yöntem, sinapsların düzenlenmesinin temelinde yatan temel mekanizmalara dair içgörü sağlayabildiği gibi, otizm, şizofreni veya Alzheimer hastalığı gibi bir dizi psikiyatrik ve nörolojik bozukluğun belirgin bir özelliği olan sinaps yapısındaki bozulmalara, hastalıkla ilişkili genlerin katkısının araştırılması için de kullanılabilir.İlk olarak, DMEM'in pH değerini 10 millimolar steril HEPES ile dengeleyerek H-D-M-E-M hazırlayın. Karışımı 37 °C'ye kadar ısıtın. Ardından, üzerinde hücreler bulunan 18 mm'lik lamel camları, 37 °C'de önceden ısıtılmış, antibiyotiksiz 600 µL besiyerine aktarın.Hücreleri 37 °C'de inkübe edin ve 30 dakika boyunca %5 karbondioksit ile destekleyin. Her bir lam için, belirlenen miktardaki DNA'yı 50 µL H-D-M-E-M'e ekleyin ve beş dakika bekletin. Ardından, 4 µL lipo 2000'i başka bir 50 µL H-D-M-E-M'e ekleyin ve bunu da beş dakika bekletin.İki tüpü iyice karıştırın ve %5 karbondioksit ile desteklenmiş, 37 derece Celsius sıcaklıktaki nemlendirilmiş bir inkübatörde en az 20 dakika bekletin. Ardından, karışımı hücrelere damla damla ekleyin. Hücreleri aynı koşullarda dört saat daha inkübe etmeye devam edin, daha önce hazırlanmış 300 mikrolitre besleme ortamını 400 mikrolitre 37 derece Celsius ile karıştırın.Taze besleme ortamı. Ardından, hücrelerin bulunduğu lamelleri hem eski hem de taze besleme ortamı içeren medyuma aktarın. Plazmidlerin ekspresyonunun iki ila üç gün daha devam etmesine izin verin.200 µM D-L-A-P-V içeren bir CSF hazırlayın. Bunu 37 °C'ye kadar ısıtın. Ardından, lamel camları 900 µL sıcak A CSF içerisinde 30 ila 60 dakika ön inkübasyona tabi tutun.Farmakolojik ajanı, çözeltiyi A CSF ile seyrelterek stok çözeltiden 10 x çalışma konsantrasyonuna getirin. Ajanı, hücrelere 1000 microliters final hacme ve bir X ajan final konsantrasyonuna ulaşacak şekilde dikkatle ekleyin. Nöronları oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 800 microliters %4 formaldehit, %4 sükroz PBS içerisinde fikse edin.Formaldehit atıklarını bertaraf ederken dikkatli olarak bunları PBS ile iki kez yıkayın. Ardından nöronları, bir buz bloğu üzerinde dört derece santigrat sıcaklıkta 10 dakika boyunca 800 microliter önceden doldurulmuş metanol ile fikse edin. Lamel örtülerini her seferinde 10 dakika boyunca 800 microliter PBS ile iki kez yıkayın.Ardından, %2 normal keçi serumu ve 800 µL %0,1 Triton X 100 içeren PBS içerisinde, gözleri ve blok hücreleri aynı anda bir saat boyunca permeabilize edin. Oda sıcaklığında, GFP ve epitop etiketi veya endojen proteinlere karşı üretilmiş primer antikorları, %2 normal keçi serumu içeren PBS'ye ekleyin. Daha sonra 15 cm'lik bir kap alıp bunu karelere bölün.Bunları numaralandırın ve paraform ile örtün. Her kareye bir damla olacak şekilde, paraforma 80 µL antikor ve bloklama karışımı ekleyin. Lamine camı, hücreler aşağı bakacak şekilde antikor ve bloklama karışımının üzerine yerleştirin.Şimdi kabı parafilm ile kapatın ve dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca inkübe edin. Lamelleri, her seferinde 15 dakika olacak şekilde 3 kez PBS ile yıkayın. Alexa konjuge ikincil antikorları %2 normal keçi serumu içeren PBS içinde dilüe edin.Sekonder antikorları oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin ve sonrasında ışıktan koruyun. Hücreleri tekrar PBS ile her seferinde 15 dakika olmak üzere 3 kez yıkayın. Son olarak, lama uygun Antifa reajeni kullanarak lamel kamerları standart mikroskop lamlarına monte edin; 1,4 sayısal açıklıklı 63x yağ daldırma objektif kullanılır.Önceden belirlenmiş artışlarla (örneğin 0,37 micrometers) bir Z serisi olarak bir görüntü dizisi elde edin. Uygun lazer hattını kullanarak floresan görüntüleri alın.Örneğin, 488 nanometrede uyarma yapan bir argon lazer hattı ve 505 ila 530 nanometre arasında bir bant geçiren filtre kullanın. Spine içindeki floresan sinyali ile arka plan arasında keskin bir kontrast oluşturmak için dedektör kazancını (gain) ve ofsetini ayarlayın. Aynı deney kapsamındaki tüm taramalar için görüntüleme parametrelerini aynı tutun.Dendritik dikenlerin morfolojilerini incelemek amacıyla görüntü analizi için Molecular Devices firmasının Metamorph yazılımı kullanılır; maksimum projeksiyon rekonstrüksiyonları ve arka planı çıkarılmış görüntüler ile Z serisi görüntüler çökertilir. Ardından, toplamda en az 100 µm uzunluğunda iki dendriti olan bir nöron seçilir ve gerekli mesafe kalibrasyonu yapılır. Daha sonra, eşik değeri dikenlerin ana hatlarına tam olarak karşılık gelecek şekilde ayarlanarak, tüm dikenleri kapsayacak biçimde nöronun ikili (binary) bir görüntüsü oluşturulur.Değişkenliği azaltmak için dikenleri yalnızca sekonder ve tersiyer dendritler üzerinde ölçün. Ölçümleri dallanma noktaları arasındaki segmentler üzerinden yapın. Kapalı bir parametre oluşturmak için her bir dikeni manuel olarak çevreleyin.Metamorph kullanarak spine uzunluğu, spine genişliği, kesit alanı ve dendritik spine lineer yoğunluğu dahil olmak üzere spine parametrelerini ölçün. Ardından, kantifikasyon ve istatistiksel analiz için dendritik spine morfometrik parametrelerini excel'e aktarın. 22 by 22 milimetrelik lameller üzerinde büyütülen nöronları, 1.5 mililitre A CSF içinde 30 ila 60 dakika boyunca ön inkübasyona tabi tutun.%5 karbondioksit ile desteklenmiş, 37 °C sıcaklıktaki nemlendirilmiş bir inkübatörde bekletiniz. Ardından, spine hareketliliğini incelemek için hücreleri 37 °C sıcaklıktaki kapalı bir görüntüleme tablası haznesine aktarınız; fotootürlüğü en aza indirmek için GFP, mCherry veya floresan işaretli protein eksprese eden, inci benzeri morfolojiye sahip sağlıklı nöronlar seçiniz. Lazer gücünü %0,5 ile %1 arasına düşürünüz. Daha sonra 63 x objektif ve 1,4 sayısal açıklık kullanarak, her 10 dakikada bir iki x ortalama ile görüntüler elde ediniz.Nöronları bir saat boyunca görüntüleyin. Ardından, bir peristaltik pompa kullanarak görüntüleme haznesine ilacı veya taşıyıcıyı perfüze edin. Nöronları bir saat daha görüntüleyin.Her görüntüleme oturumunun sonunda, her zaman noktasında Z serisi görüntüler toplayın; fotohasar seviyesini belirlemek için tüm nöronun 10x görüntüsünü elde edin ve stres belirtileri gösteren nöronları nicel değerlendirmeden çıkarın. Ardından, her zaman noktasına ait Z serisi görüntüleri Metamorph programında maksimum projeksiyon rekonstrüksiyonları şeklinde daraltın; görüntü kalitesine ve transfeksiyona seviyesine bağlı olarak, diken (spine) morfolojisi ve hareketliliğini değerlendirmek üzere analiz için net görüntüler üretmek amacıyla median pass filtresi veya arka plan çıkarma işlemi uygulayın. Metamorph'ta 100 dakikalık görüntüleme oturumlarının başında, ortasında ve sonunda alınan görüntüleri renk kodlayın ve üst üste bindirin; hücre başına en az 100 mikrometre dendriti analiz edin. Toplam diken hareketlilik oranı, diken sayısına normalize edilmiş toplam hareketlilik olaylarının sayısı (örneğin uzama-geri çekilme, baş morfolojisi değişimi veya protrusif hareketlilik) olarak tanımlanır.Bu yöntem, olayların büyüklüklerini dikkate almadan gerçekleşme sıklıklarını ölçer ve genel hareketliliğin genel bir tahminidir. Protrüzyon olayı, bir spine başından veya dendritik şafttan yeni, geçici bir çıkıntının ortaya çıkması olarak tanımlanmıştır. Retraksiyon olayı ise, bir spine başı veya dendritik şaft üzerinde bulunan mevcut veya geçici bir çıkıntının kaybolması olarak tanımlanmıştır.İlaç tedavisine yanıt olarak bireysel spine morfolojisindeki değişimleri değerlendirmek için, çıkıntı (protrusion) ve uzama (extension) olaylarının toplamı, sayılandırılan dendrit bölgesindeki toplam spine sayısına bölünür. Görüntüleme oturumunun başlangıcında ve ardından perfüzyon tedavisinden hemen önce ve sonraki her zaman noktasında dendritik spine kesit alanını veya dendritik spine lineer yoğunluğunu ölçün; her zaman noktasını tedaviden bir saat önceki zaman noktasına göre normalize edin. Daha sonra, sayılandırma ve istatistiksel analiz için dendritik spine morfometrik parametrelerini excel'e aktarın.Bu örnek, 0,52 ve 1,0 µm boyutlarındaki floresan mikrokürelerin alanlarının sırasıyla 0,21 µm² ve 0,78 µm² olarak, 0,2 µm mikroküreler için bile doğru şekilde ölçüldüğünü göstermektedir. Ölçümler gerçek boyutlara oldukça yakındır. Burada, 63 x objektif ve 1,4 sayısal açıklığa sahip bir konfokal mikroskop kullanılarak görüntülenen, GFP ile transfekte edilmiş bir kortikal nöronun temsili görüntüsü gösterilmektedir.Dendritik dikenlerin detaylı yüksek çözünürlüklü görüntüleri burada sunulmuştur. Aktiviteye bağımlı stimülasyonların iyi tanımlanmış bir etkisi, dendritik diken boyutundaki artıştır. Burada, aktiviteye bağımlı bir stimülasyondan önce ve sonra 30 dakika boyunca görüntülenen, EGFP eksprese eden DIV 24 kortikal nöronuna ait bir dendritik dikenin temsili zaman ayarlı (time-lapse) görüntüsü yer almaktadır.Bu zaman atlamalı deney, dendritik spine boyutundaki artışın aktiviteye bağlı uyaranlardan kaynaklandığını doğrulamaktadır. Bazal spine hareketliliğini incelemek için 0, 50 ve 100. dakikalarda görüntüler alınır. Spine uzamaları, geri çekilmeleri, protrüzyonları, hareketliliği ve baş morfolojisi değişimleri ayrı ayrı ölçülür ve toplam hareketlilik olarak birleştirilir. Bu rakamlar, bazal koşullar altında bile kortikal nöronların dendritik spine'lerinin belirli bir düzeyde hareketlilik sergilediğini doğrulamaktadır. Bu prosedürün ardından.Dendritik diken morfolojisinin düzenlenmesi ve sinaps fonksiyonu ile koordinasyonu hakkındaki ek soruları yanıtlamak için, reseptörlerin diğer sinaptik proteinlerle kolokalizasyonu, proteinlerin sinapslardaki lokalizasyonu ve elektrofizyolojik incelemeler gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, çeşitli moleküler ve farmakolojik manipülasyonların sinaps yapısı üzerindeki etkilerini değerlendirmek için dendritik diken morfolojisinin ve motilitesinin detaylı analizinin nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

analysis-of-dendritic-spine-morphology-in-cultured-cns-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Kaynak: Pekarek, B. T., et. al., CLARITY Doku Temizleme ile Sağlam Nöronal Dendritlerin Görüntülenmesi ve Miktarının Belirlenmesi. J. Vis. Uzm. (2021)Bu videoda, konfokal mikroskopi ve 3D rekonstrüksiyon tekniklerini kullanarak dendritik direkleri, omurga morfolojisini ve nöronal dağılımı incelemek için temizlenmiş bir fare beyninin hazırlanmasını, görüntülenmesini ve analizini gösteriyoruz.

Temizlenmiş Bir Fare Beyninde Sağlam Dendritik Arbors ve Omurga Morfolojisinin Konfokal Mikroskopi Görüntülemesi

Kaynak: Gouder, et. al. İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Türetilen Piramidal Nöronlardan Dendritik Dikenlerin Üç Boyutlu Miktar Tayini. J. Vis. Uzm. (2015).Bu video, konfokal mikroskopi kullanılarak transdüksiyona uğramış, immün etiketli piramidal nöronlardaki dendritik dikenlerin görüntülenmesini ve analizini göstermektedir. Arka plan gürültüsü azaltılır ve dendritler çapları ve uzunlukları tahmin edilerek izlenir. Otomatik omurga segmentasyonu, dendrit ve omurga boyutları için...

Konfokal Mikroskopi Görüntüleme Kullanılarak Dendritik Dikenlerin Miktar Tayini

Fare modellerinin hipokampusunda dendritik arborizasyonun görselleştirilmesi ve ölçülmesi için iki yöntem açıklıyoruz: gerçek zamanlı ve genişletilmiş alan derinliği görüntüleme. İlk yöntem, karmaşık topografik izlemeye ve dallanma derecesinin ölçülmesine izin verirken, ikincisi dendritik ağacın hızlı bir şekilde görselleştirilmesine izin verir.

Farelerde Hipokampal Bölgesi Dentate Gyrus dendritik arborization Değerlendirilmesi

Piramidal nöronlar dendritik dikenleri memeli beyin korteksinde en uyarıcı sinaps sitelerdir. Bu yöntem, uyarılmış pluripotent kök hücrelerinden elde edilen insan kortikal piramidal glutamaterjik nöronları omurga morfolojileri 3D kantitatif analiz açıklanır.

İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin türetilmiş Piramidal Nöronlar gelen Dendritik Spine Üç boyutlu Niceleme

Burada ayrıntılı bir Golgi-Cox protokolünü sunuyoruz. Bu güvenilir doku lekesi metodu, minimal sorun giderme ile hipokampustaki ve tüm beyindeki sitolojik mimarinin yüksek kaliteli bir değerlendirmesini sağlar.

Yaşlı Bir Farede Hipokampal Dendritik Karmaşıklığın Golgi-Cox Yöntemi ile Değerlendirilmesi

Nörokimyasal ve davranışsal anormalliklerin altında yatan nöronlar ve dendritik dikenlerde potansiyel morfolojik değişikliklerin değerlendirilmesi için kritik olan piramidal nöronları etiketlemek ve analiz etmek için bir protokol salıyoruz.

Beyin Dilimlerinde ve Birincil Hücre Kültüründe Piramidal Nöronların Balistik Etiketlemesi

Nöronal dendritik morfoloji genellikle fonksiyon alttan. Gerçekten de, nöronların gelişimini etkileyen birçok hastalık süreci morfolojik bir fenotip ile kendini gösterir. Bu protokol, bozulmamış dendritik çardakları ve ilişkili dikenlerini analiz etmek için basit ve güçlü bir yöntemi açıklar.

CLARITY Doku Temizleme Yoluyla Bozulmamış Nöronal Dendritlerin Görüntülenmesi ve Nicelleştirilmesi

Dendritik dikenler sinir sisteminin önemli hücresel özellikleridir. Burada C. elegans'ta dendritik dikenlerin yapısını ve işlevini değerlendirmek için canlı görüntüleme yöntemleri tanımlanmıştır. Bu yaklaşımlar, dendritik omurga şeklini veya işlevini tanımlayan genler için mutant ekranların geliştirilmesini desteklemektedir.

Caenorhabditis elegans'ta Dendritik Dikenleri Görüntüleme

Protokol, hipokampustaki nöronları ve sıçanın medial prefrontal korteksi boyamak için sinir sisteminin herhangi bir bölümüne uyarlanabilen hızlı Golgi yönteminin bir modifikasyonunu açıklar.

Hipokampus ve Prefrontal Kortekste Dendritik Omurga Görselleştirme için Hızlı Golgi Lekesi

Dendritik dikenler, çoğu uyarıcı sinapsın post-sinaptik bölmeleridir. Dendritik omurga morfolojisindeki değişiklikler, nörogelişim, yaşlanma, öğrenme ve birçok nörolojik ve psikiyatrik bozukluk sırasında meydana gelir ve güvenilir dendritik omurga analizinin önemini vurgular. Bu protokol, otomatik üç boyutlu nöron rekonstrüksiyon yazılımı kullanılarak dendritik omurga morfolojisinin doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde ölçülmesini açıklar.

Otomatik Üç Boyutlu Nöron Rekonstrüksiyon Yazılımı Kullanılarak Dendritik Omurga Ölçümü

Öğrenin, kültüre edilmiş kortikal nöronlarda dendritik omurga morfolojisini ve hareketliliğini GFP ve konfokal mikroskopi kullanarak analiz etme yöntemini. Bu teknik sinaptik plastisite ve nöronal hastalıklarda yapısal değişiklikleri incelemeye yardımcı olur.

Kültür MSS Nöronlar Dendritik Omurga Morfoloji Analizi

Daha fazla video keşfet