Name: Tüm Dağı In situ Hibridizasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 54 s
Description: Öğrenin, fare embriyolarında gen ifadesi desenlerini görselleştirmek için tüm dağı in situ hibridizasyon protokolünü. Bu yöntem, gelişim biyolojisi araştırmalarında tekrarlanabilir sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH hibe R21MH082360 (BGC) ve R01HD056315 (UYM) yanı sıra Georgia Üniversitesi tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Divjak, M., Glare, E. M., Walters, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+non-radioactive+in+situ+hybridization+in+human+airway+tissues%3A+use+of+PCR-generated+templates+for+synthesis+of+probes+and+an+antibody+sandwich+technique+for+detection+of+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Improvement of non-radioactive in situ hybridization in human airway tissues: use of PCR-generated templates for synthesis of probes and an antibody sandwich technique for detection of hybridization.</a> J. Histochem. Cytochem. 50, 541-548 (2002).</li>
<li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).</li>
<li>Logel, J., Dill, D., Leonard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+cRNA+probes+from+PCR-generated+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Synthesis of cRNA probes from PCR-generated DNA.</a> Biotechniques. 13, 604-610 (1992).</li>
<li>Maddox, D. M., Condie, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+expression+of+a+glutamate+decarboxylase+gene+in+multiple+non-neural+tissues+during+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic expression of a glutamate decarboxylase gene in multiple non-neural tissues during mouse development.</a> BMC Dev Biol. 1, 1-1 (2001).</li>
<li>Conlon, R. A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+retinoic+acid+rapidly+induces+anterior+ectopic+expression+of+murine+Hox-2+genes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Exogenous retinoic acid rapidly induces anterior ectopic expression of murine Hox-2 genes in vivo.</a> Development. 116, 357-368 (1992).</li>
<li>Krauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+pax%5Bzf-a%5D%3A+a+paired+box-containing+gene+expressed+in+the+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Zebrafish pax[zf-a]: a paired box-containing gene expressed in the neural tube.</a> EMBO J. 10, 3609-3619 (1991).</li>
<li>Hemmati-Brivanlou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+specific+mRNAs+in+Xenopus+embryos+by+whole-mount+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization.</a> Development. 110, 325-330 (1990).</li>
<li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%3A+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).</li>
<li>Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+pattern+of+the+Brachyury+gene+in+whole-mount+TWis%2FTWis+mutant+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression pattern of the Brachyury gene in whole-mount TWis/TWis mutant embryos.</a> Development. 113, 913-917 (1991).</li>
<li>Conlon, R. A., Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+postimplantation+embryo+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to postimplantation embryo whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 373-383 (1993).</li>
<li>Parr, B. A., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Wnt+genes+exhibit+discrete+domains+of+expression+in+the+early+embryonic+CNS+and+limb+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mouse Wnt genes exhibit discrete domains of expression in the early embryonic CNS and limb buds.</a> Development. 119, 247-261 (1993).</li>
<li>Rosen, B., Beddington, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+in+situ+hybridization+in+the+mouse+embryo%3A+gene+expression+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Whole-mount in situ hybridization in the mouse embryo: gene expression in three dimensions.</a> Trends Genet. 9, 162-167 (1993).</li>
<li>Quiring, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+expression+screening+by+automated+whole-mount+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization.</a> Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).</li>
<li>Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+in+situ+screen+provides+molecular+evidence+for+the+induction+of+eye+anterior+segment+structures+by+the+developing+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens.</a> Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).</li>
<li>Neidhardt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+screen+for+genes+controlling+mammalian+embryogenesis%2C+using+high-throughput+gene+expression+analysis+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Large-scale screen for genes controlling mammalian embryogenesis, using high-throughput gene expression analysis in mouse embryos.</a> Mech. Dev. 98, 77-94 (2000).</li>
<li>Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gcm2+and+Foxn1+mark+early+parathyroid-+and+thymus-specific+domains+in+the+developing+third+pharyngeal%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal.</a> 103, 141-143 (2001).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu protokolü açıklanan yöntemler farklı kaynaklardan bir dizi uyarlanmış ve tüm montaj E8.5-E11.5 günlük fare embriyoları için optimize edilmiştir. Omurgalı embriyolarının in situ hibridizasyon tüm montaj yöntemleri ilk 1990&#39;ların başında 2,5-12 ortaya çıktı. Bu protokol öncelikle Xenopus embriyolar 7,8 yanı sıra fare 2,11 için geliştirilen yöntemler uyarlanmıştır. Bizim protokol vurgu büyük bir prob dikkatli kalite değerlendirmesi üzerine yerleştirilir. Yüksek kalite ve yük...

<table border="1"><tbody><tr><th> Isim </th><th> Tip </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> Digoxigenin-11-üridin-5&#39;-trifosfat </td><td> Reaktif </td><td> Roche </td><td> 11209256910 </td><td></td></tr><tr><td> Ribonükleozit trifosfat Seti </td><td> Reaktif </td><td> Roche </td><td> 11277057001 </td><td></td></tr><tr><td> Radyoaktif RNA saflaştırılması için Hızlı Spin Sütunlar </td><td> Tedarik </td><td> Roche </td><td> 11274015001 </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNA polimeraz </td><td> Reaktif </td><td> Roche </td><td> 10881767001 </td><td></td></tr><tr><td> SP6 RNA polimeraz </td><td> Reaktif </td><td> Roche </td><td> 10810274001 </td><td></td></tr><tr><td> T3 RNA polimeraz </td><td> Reaktif </td><td> Roche </td><td> 11031163001 </td><td></td></tr><tr><td> CTP, [α-32P] - 800Ci/mmol 10mCi/ml, 250 μCi </td><td> Reaktif </td><td> Perkin Elmer </td><td> BLU008X250UC </td><td></td></tr><tr><td> DNaz I rekombinant, RNaz-serbest </td><td> Reaktif </td><td> Roche </td><td> 4716728001 </td><td></td></tr><tr><td> Üre, Renksiz-beyaz kristaller veya kristal toz </td><td> Reaktif </td><td> Balıkçı </td><td> BP169-500 </td><td></td></tr><tr><td> Jel yükleme tamponu </td><td> Reaktif </td><td> Ambion </td><td> AM8547 </td><td></td></tr><tr><td> Hybond-N +, Amersham </td><td> Tedarik </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN82B </td><td></td></tr><tr><td> UV Stratalinker 2400 </td><td> Ekipman </td><td> Stratagene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dietil pyrocarbonate </td><td> Reaktif </td><td> Sigma </td><td> D5758-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Heparin sodyum </td><td&gt; Reaktif </td><td> Acros </td><td> 41121-0010 </td><td></td></tr><tr><td> su içinde hidrojen peroksit% 30 </td><td> Reaktif </td><td> Fisher bilimsel </td><td> BP2633-500 </td><td></td></tr><tr><td> Gluteraldehid,% 8 EM notu </td><td> Reaktif </td><td> Polysciences </td><td> 0/710 </td><td> Üreticinin talimatlarına göre dikkatli kullanın </td></tr><tr><td> Reaktif Engelleme </td><td> Reaktif </td><td> Roche </td><td> 11096176001 </td><td> -20 ° C&#39;de% 5 hisse senedi ve depoya Yap </td></tr><tr><td> Proteinaz K </td><td> Reaktif </td><td> Roche </td><td> 3115852001 </td><td></td></tr><tr><td> Rnaz A </td><td> Reaktif </td><td> Roche </td><td> 10109142001 </td><td> Yapmak kadar -20 ° C&#39;de 10 mg / ml stok ve mağaza </td></tr><tr><td> Rnaz T1 </td><td> Reaktif </td><td> Roche </td><td> 10109193001 </td><td></td></tr><tr><td> Ultrapure Formamid </td><td> Reaktif </td><td> Invitrogen </td><td> 15515-026 </td><td></td></tr><tr><td> Levamizol hidroklorür </td><td> Reaktif </td><td> ICN Biomedicals. A.Ş. </td><td> 155228 </td><td></td></tr><tr><td> Torula maya Ribonükleik asit, Tip VI </td><td> Reaktif </td><td> Sigma </td><td> R6625 </td><td> fenol / kloroform birkaç kez ekstre edilmiş ve çökelen DEPC-dH2O içinde tekrar süspanse edilir ve -20 ° C&#39;de saklanmıştır </td></tr><tr><td> Anti-digoxigenin-AP Fab fragmanları </td><td> Reaktif </td><td> Roche </td><td> 11093274910 </td><td></td></tr><tr><td> Presipite BM Mor AP Yüzey. Çözüm Hazır kullanın. </td><td> Reaktif </td><td> Roche </td><td> 11 442 074 001 </td><td></td></tr><tr><td> 4 mL, Açık, Kapalı Üst, Depolama Flakon Kolaylık Seti </td><td> Tedarik </td><td> Ulusal bilimsel </td><td> B7800-2 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> N Bake hibridizasyon fırın Sarsıntı </td><td> Ekipman </td><td> Boekel Scientific </td><td> 136400 </td><td></td></tr><tr><td> Sure-Tek Biyopsisi </td><td> Tedarik </td><td> Fisherbrand </td><td> 15-200-402C </td><td></td></tr><tr><td> Paraplast Artı doku gömme orta </td><td> Reaktif </td><td> Fisherbrand </td><td> 23-021-400 </td><td></td></tr><tr><td> Peel-A-Way atılabilir plastik doku gömme kalıpları </td><td> Tedarik </td><td> Polysciences </td><td> 18646A </td><td></td></tr><tr><td> Colorfrost Artı Mikroskop slaytlar </td><td> Tedarik </td><td> Fisherbrand </td><td> 12-550-17 </td><td></td></tr><tr><td> Nükleer Hızlı Kırmızı </td><td> Reaktif </td><td> Sigma </td><td> N8002 </td><td></td></tr><tr><td> Cytoseal 60 </td><td> Reaktif </td><td> Richard-Allan Bilimsel </td><td> 8310-16 </td><td></td></tr></tbody></table>

tüm dağı<em&gt; in situ</eme11.5 fare embriyolarına e8.5 ve&gt; hibridizasyon

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

In situ hibridizasyon Tüm monte embriyolar gen ifade desenlerinin tanımlanmasına yönelik çok bilgilendirici bir yaklaşımdır. Situ hibridizasyon işlemlerinde uzun ve teknik olarak topluca nihai sonucun kalitesine katkıda birden önemli adımlar ile zorlu. Bu protokol prob etiketleme ve performansını optimize etmek için ayrıntılı birkaç önemli kalite kontrol adımları açıklar. Genel olarak, bizim protokol ayrıntılı bir açıklamasını sunar gerekli kritik adımlar tekrarlanabilir yüksek kaliteli sonuçlar elde etmek. İlk olarak, PCR tarafından üretilen DNA şablonları in vitro transkripsiyon yoluyla digoxygenin (DIG) etiketli probların RNA üretimini açıklıyoruz. Bu miktar, bütünlüğü ve DIG-etiketli problar spesifik faaliyetini belirlemek için üç kritik kalite kontrol testlerinin açıklanmaktadır. Bu adımlar bir bütün fare embriyo endojen mRNA&#39;ların tespit etmek için yeterli hassasiyet prob üretmek için önemlidir.Ayrıca, in situ hibridizasyon için E8.5-E11.5 günlük fare embriyo fiksasyon ve depolama yöntemleri açıklanmaktadır. Daha sonra, hibridizasyon koşulları, hibridizasyon sonrası yıkamalar ve non-spesifik hibridizasyon probu kaldırmak için RNaz tedavi ayrıntılar, ardından suyla yeniden embriyoların sınırlı proteinaz K sindirimi için ayrıntılı yöntemler açıklanmaktadır. AP-bağlı antikor etiketli sonda görselleştirmek ve endojen transkript salgılama modelini ortaya çıkarmak için kullanılır. Temsilcisi sonuçları başarılı deneyler ve tipik suboptimal deneylerden gösterilmiştir.

Bütün bu montaj<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon protokolü E8.5-E11.5 günlük fare embriyoları gen ekspresyon çalışmaları için tekrarlanabilir, yüksek kaliteli sonuçlar sağlamak kritik adımları anlatılmaktadır.

Tüm Dağı<em&gt; In situ</emE11.5 fare embriyolarına E8.5 ve&gt; Hibridizasyon

Tüm bağlamda in situ hibridizasyon, embriyolardaki gen ekspresyon modellerinin belirlenmesi için oldukça bilgilendirici bir yaklaşımdır. In situ hibridizasyon prosedürleri...

Bu prosedürün genel amacı, bütün fare embriyolarındaki gen ekspresyon modellerini tanımlamaktır. Bu işlem, öncelikle ilgili gen için spesifik bir ribo prob tasarlanıp üretilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından embriyolar toplanır ve hibridizasyon için işleme tabi tutulur.Ardından, işaretli prob embriyolarla hibritlenir. Son adım, hibritlenmiş probun immünohistokimyasal saptama ile görselleştirilmesidir. Nihayetinde, tüm embriyolarda veya embriyonik kesitlerde gen ekspresyon modellerini gösteren sonuçlar elde edilebilir.Stereomikroskop, diseksiyon mikroskobu veya standart bir aydınlık alan mikroskobu ile görüntüleme yapıldıktan sonra, bu yönteme yeni başlayan kişiler genellikle zorluk yaşarlar; çünkü in situ hibridizasyon prosedürleri uzun ve teknik açıdan zahmetlidir ve nihai sonucun kalitesine toplu olarak katkıda bulunan birden fazla önemli adım vardır. İlk olarak, beş prime uçlarında farge transkripsiyon promotör dizileri ile tasarlanmış gene özgü PCR primerlerini kullanarak ilgilenilen diziyi amplifiye edip kalıp DNA üretin. Ardından, PCR ürününü saflaştırın ve yazılı protokole uygun olarak bir proteinaz K sindirim adımı ekleyin.Ardından, bir in vitro transkripsiyon reaksiyonu ku

whole-mount-in-situ-hybridization-of-e85-to-e115-mouse-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video in situ hibridizasyon, 2 farklı genler mekansal ve zamansal ifade desen genç civciv embriyolarında görüntülenebilmekte hangi bir yöntem 2-renk tüm montaj göstermektedir. Bu yöntem başlangıçta David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham ve David Ish-Horowicz tarafından tanıtıldı.

Erken Civciv Embriyolar in situ Hibridizasyon Çift Tüm Dağı

Biz fare embriyonik doku doku-spesifik gen ekspresyonu başlangıcı sırasında veya sonrasında doku spesifik genlerin faktör etkileşimleri belirlemek için yöntem bir kromatin immunoprecipitation (ChIP) göstermektedir. Bu protokol, normal embriyonik gelişim sırasında ortaya çıkan doku-spesifik gen aktivasyon çalışması için yaygın olarak uygulanabilir olmalıdır.

Erken evre Fare Embriyolar kullanarak Doku özel Genler Kromatin Immunoprecipitation Testi

Ex vivo Fare neuroepithelium Tek Hücre Bölümler Canlı Görüntüleme

Burada, genetik olarak tasarlanmış farelerin geliştirilmesinde duyusal akson büyüme fenotiplerini değerlendirmek için etkili bir yöntem olarak, tüm hayvanda periferik nosiseptör akson projeksiyonlarının görüntülenmesi için fetal fareleri genotiplemek, boyamak ve hazırlamak için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz.

Fare Embriyo Duyu Akson Projeksiyonlar tüm montaj Görüntüleme

İn vivo potansiyellerini belirlemek için kültürlenmiş hücreleri erken fare embriyolarının tanımlanmış bölgelerine aşılamak için bir yöntem gösteriyoruz. Ayrıca, eksojen DNA'nın embriyolardaki birkaç hücreye hassas bir şekilde iletilmesini sağlayan, çapı bilinen cam kılcal damarları kullanan optimize edilmiş bir elektroporasyon yöntemi de sunuyoruz.

Erken Postimplantation Fare Embriyolar içine Hücreleri veya DNA Kesinlikle lokalize Transferi Yöntemleri

Fare embriyolarının üç boyutlu (3D) görüntülerini elde etmek için yüksek çözünürlüklü episkopik mikroskopi kullanan ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Bu geliştirilmiş protokol, floresan boyanın penetrasyonunu arttırmak için modifiye edilmiş bir doku hazırlama yöntemi kullanır, böylece hem küçük hem de büyük boyutlu numunelerin morfometrik analizine izin verir.

3D Görüntüleri Hızlı Toplama Yüksek çözünürlüklü Episcopic Mikroskopi kullanma

Düğüm ve notochordal plaka gelişmekte olan çeşitli teknikler kullanarak görüntülenir fare embriyo organizatörler sinyal geçici. Burada, biz iki çalışma onların yapısı ve morfogenetik bozmak nasıl ayrıntılı olarak tarif: 1) Tarama elektron mikroskobu (SEM); ve 2) bütün Dağı ayirt (WMIF).

Düğüm ve Notochordal plaka Gastrulating fare embriyo Tarama elektron mikroskobu ve bütün Dağı ayirt kullanarak görselleştirme

Biz bütün Dağı epifluorescent mikroskobu ventrikül belirli MLC-2v-tdTomato muhabir çakma fareler disseke fare embriyosu üzerinde kullanarak fare kalp geliştirme incelemek için protokolleri mevcut. Bu yöntem her aşamasında emek yoğun histochemical yöntemleri olmadan fare kalp geliştirme sırasında ventrikül oluşumu doğrudan görselleştirmek için bize izin verir.

Bütün Mount Epifluorescence kullanarak fare embriyogenez sırasında kalp odası gelişimin analizi

Klasik olarak, fare embriyonik kapak primordiyumunun endokardiyumu transversal, koronal veya sagital kesitler kullanılarak analiz edilmiştir. Valvulojenik bölgelerde endokardın en yüzlü, iki boyutlu görüntülenmesi için yeni yaklaşımımız, kapak gelişimi sırasında endokardın düzlemsel polarite ve hücre yeniden düzenleme analizine izin verir.

En Yüz Fare Embriyolarında Düzlemsel Morfogenez Analizi için Endokardiyal Minderin Hazırlanması

Bu makale, tek hücrelerin ve çekirdeklerin dizilimi için gastrulasyon yapan fare embriyolarının yüksek kaliteli tek hücreli ve çekirdek süspansiyonları için bir boru hattı oluşturur.

Mutant Bütün Fare Embriyolarının Tek Hücreli RNA Dizilimi: Epiblasttan Gastrulasyonun Sonuna Kadar

Öğrenin, fare embriyolarında gen ifadesi desenlerini görselleştirmek için tüm dağı in situ hibridizasyon protokolünü. Bu yöntem, gelişim biyolojisi araştırmalarında tekrarlanabilir sonuçlar sağlar.

Tüm Dağı

Daha fazla video keşfet