Name: Kromatin Aksonal Yaralanma Dorsal Kök Ganglia Doku Immunoprecipitation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Öğrenin, dorsal kök ganglia dokusundan kromatin immunoprecipitation yöntemiyle aksonal yaralanma sonrası transkripsiyon faktörü bağlanma bölgelerini ve epigenetik modifikasyonları nasıl tanımlayacağınızı.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz ince ayar ChIP için yaptığı katkılardan dolayı laboratuar ve Ricco Lindner ilk ChIP deneyleri Andrea Tedeschi yardım için teşekkür etmek isterim. Bu çalışma, Hertie Vakfı tarafından desteklenen; Fortune Grant, Tübingen Üniversitesi, ve DFG DI 1497/1-1 hibe (tüm Simone Di Giovanni verilen).

1. Siyatik ve dorsal kolon sinir hasarı <ol><li> Hayvan cerrahi bir havlu üzerine yerleştirilir ve bunun altında bir thermopad farenin vücut ısısı 37 ° tutmak ° C işlem boyunca mevcut. Bütün hayvanlar, sürekli bir izofluran O / 2 yönetim ameliyat için anestezi . Cerrahi aletler, işlem öncesi otoklavlanırlar. </li><li> Siyatik yaralanma, hem kıç dikkatle traş, epilasyon, Betadyne 3 kez izledi alkol ile cilt temizliği için önce genel saç çıkarıcı ile tamamlandı. </li><li> Siyatik sinir, 4 mm'lik kesi arka ve deri yoluyla orta uyluk femur paralel yaparak ve ince forseps ile biseps femoris kasları dışında yayarak maruz kalmaktadır. </li><li> Maruz siyatik sinir sonra yaralı ve cilt iki dikiş klipleri ile kapatılır. </li></ol> NOT: Aynı kesi siyatik sinir ortaya çıkarmak için yapılır, fakat yara, sinir sahte yaralanma zedelemeden kapalı sütüre edilir . <ol start="5"><li> Dorsal kolon yaralanma, fare arkasına dikkatle traş ve epilasyon alkol sprey / okutma ile cilt temizliği için önce genel bir saç çıkarıcı ile tamamlandı. </li><li> Omurilik T7 hakkında T13 2.5 cm'lik kesi yaparak maruz kalmaktadır. Deri dışında yayılmış ve bağ dokusu, T9, T11 vertebra boyunca kaldırılır. </li><li> Laminektomi T10 seviyesinde </li></ol> NOT: en deneyler için, laminektomi Şam yaralanma olarak kabul edilir. <ol start="8"><li> Xylocain Birkaç damla kablosu uyuşturan doku eklenir ve dura mater omurilik dokunmamaya dikkat kaldırılır. </li><li> Dorsal sütun yaralanan ve kas tekrar omurilik dokunmamaya dikkat, yakın sütüre edilir. Son olarak, deri dikiş klipleri ile kapalı sütüre edilir. Buprenorfin (0.1 mg / kg vücut ağırlığı) 48 saat için ya da artık gerekli kadar günde iki kez uygulanmalıdır. </li></ol> 2. Çapraz bağlama <ol><li> Euthanization sonra yaralı farelerde L4 ve L5 DRG parçalara ayır. Buz HBSS + proteaz inhibitörleri kokteyl (2 toplam 4 hayvanların her hayvan yaralandı ve 2 sahte DRG) toplam 16 DRG toplayın. </li><li> Kısaca DRG santrifüj, sonra dikkatli bir şekilde 37 HBSS kaldırmak ve 500 ul, PBS + proteaz inhibitörleri kokteyl% 1 formaldehit ekleyin ve 30 dakika boyunca örnek inkübe ° C </li></ol> KRİTİK ADIM taze, moleküler biyoloji notu formaldehit kullanın. <ol start="3"><li> Fiksasyon ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe durdurmak için 125 mM glisin ekleyin. </li><li> Kısaca, santrifüj, tampon kapalı aspirat ve 500 ul buz gibi soğuk PBS + proteaz inhibitörleri kokteyl ile doku iki kez yıkayın. </li></ol> 3. Çekirdekler hazırlanması ve kromatin kesme <ol><li> PBS kapalı aspire, SDS lizis tamponu 400 ul eklemek, önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüpüne transfer ve micropestle yaklaşık 30 vuruş ile doku bozabilir. </li></ol> KRİTİK ADIM Lizis ve doku bozulması çapraz kromatin iyi bir verim için hayati önem taşımaktadır. <ol start="2"><li> 8 bakliyat,% 70 çıkış (Bandelin, Sonoplus GM70) her 10 saniyede örnek sonikasyon. </li></ol> DİKKAT. Kromatin kesme özel sonication için optimize edilmiş olmalıdır kurmak ve kromatin düzgün parçalanma gerçek IP deney çalıştırmadan önce kontrol edilmelidir (bkz. Bölüm 3). Kromatin NOT: Parçalanma micrococcal nükleaz (MNase) sindirim ile yapılabilir. Genel bir kural olarak, yerel doku kromatin immunoprecipitation MNase sindirim için tercih edilmektedir sonication tarafından parçalanması, sabit doku için tercih edilir. Çapraz bağlı, makaslanmış kromatin 2 ay kadar -80 ° C'de saklanan, ancak tekrarlanan donma / çözülme döngüleri önlemek olabilir. 4. Kromatin sindirim Analizi (önerilir) <ol><li> Analiz için makaslanmış kromatin örnek 10 ul çıkarın. 200 mM NaCl örnek ekleyin ve 2 saat için 65 ° C'de inkübe tarafından çapraz bağ ters. </li><li> DNA (bkz. Bölüm 8) arındırmak ve% 1 agaroz jel çalıştırın. DNA uzunluğu yaklaşık 200-1000 bp (Şekil 1) parçalanmış olmalıdır. </li></ol> Eksik parçalanma azalmış çözünürlük ve yüksek arka plan yol ise kromatin DİKKAT Aşırı parçalanma, sinyal azalması neden olabilir . 5. Immunoprecipitation <ol><li> Immunoprecipitation reaksiyonlar sayısı (NOT aşağıya bakınız) belirlemek ve yeni tüp içine eşit örnekleri bölmek. Her birinin hacmi getirChIP tampon + proteaz inhibitörleri kokteyl ile 500 ul. </li><li> Seyreltilmiş numune 5 ul çıkarın ve yeni bir tüp içine aktarmak. Bu,% 1 giriş örnek ve gerektiği kadar (Bölüm 7) -20 ° C'de saklanır. </li><li> Her immunoprecipitation için, uygun antikor veya normal IgG kontrolü ekleyin ve 4 ° C rotasyon ile bir gecede inkübe. </li></ol> NOT. Immunoprecipitation, sayısı, pozitif kontrol (örneğin Histon H3 antikor) ve negatif kontrol (Normal IgG) belirlerken dikkate alınmalıdır. Her IP için kullanılan antikor miktarı antikorlar arasında değişir ve ampirik olarak tespit edilmelidir. Bununla birlikte, genellikle 2-10 aralığında g / immunoprecipitation. <ol start="4"><li> Antikor / protein / DNA kompleksi immunoprecipitate için, ChIP Sınıf Protein G Manyetik Boncuk 30 ul ekleyin ve 2 saat boyunca inkübe 4 ° C dönüş. </li></ol> 6. Yıkama <ol><li> Açılan bağlı kromatin-boncuk kompleksi için, manyetik rafa yerleştirilir. Çözelti berrak ve sonra dikkatle süpernatant kaldırmak kadar bekleyin. </li><li> Boncuklar, düşük tuz yıkama 1 ml (ChIP tampon) ekleyin ve inkübe 4 ° C rotasyon ile 3-5 dakika sonra boncuk aşağı çekme ve yıkama adım 6.1 'de kapalı aspire. Toplam 3 yıkama için bu adımı tekrarlayın. </li><li> Boncuklar 1 ml (ChIP tampon + 350 mM NaCl) yüksek tuz yıkama tamponu ekleyin ve sonra, rotasyon ile 3-5 dakika boyunca inkübe boncuk aşağı çekme ve yıkama adım 6.1 'de kapalı aspire. </li></ol> 7. Cross-linking Elüsyon ve ters <ol><li> Giriş numuneler -20 ° C, 150 ul ChIP Elüsyon tampon ekleyin ve 7.5 Adım kadar oda sıcaklığında kenara koyun. </li><li> Adım 6.3 her IP örnek için 150 1x ChIP Elüsyon tampon ul ekleyin. </li><li> Bir Thermomixer tüpler koyun ve 65 ° C ile 30 dakika nazik bir vorteks örnekleri kuluçka boncuk kromatin Zehir. </li><li> Manyetik raf boncuk aşağı çekin ve yeni tüp içine dikkatlice yıkandı, kromatin (süpernatant) aktarmak. </li><li> Giriş örnekleri de dahil olmak üzere tüm tüpler için, 2 saat boyunca NaCl ve 40 mikrogram / Proteinaz K ve inkübe reaksiyon 65 ° C 200mm ekleyin. </li></ol> NOT: elüsyon adım çok oda sıcaklığında gerçekleştirilen olabilir, ama o kadar etkili olabilir. 8. DNA kurtarma <ol><li> Adım 7.5 ve 30 saniye boyunca girdap örnekleri Fenol Kloroform / 1 hacim ekleyin. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında bir mikrosantrifüj maksimum hızda santrifüjleyin. </li><li> Sulu (üst) yeni tüp içine faz, sulu faz 1 hacim kloroform ekleyin ve 30 saniye boyunca girdap dikkatlice kurtarmak. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında bir mikrosantrifüj maksimum hızda santrifüjleyin. </li><li> Dikkatle yeni tüp içine sulu faz (üst) kurtarmak, sonra buz gibi% 100 etanol, 20 mikrogram / glikojen reaksiyon ve 2.5 hacimli NaOAc 300mm ekleyin. </li></ol> DİKKAT glikojen gibi bir taşıyıcı, Ayrıca, nispeten küçük ölçekli DNA parçalarının yağış geliştirmek için gereklidir. <ol start="6"><li> Çökelti DNA için -80 ° C'de 2 saat süreyle inkübe edin. </li></ol> NOT: yağış adım, aynı zamanda -20 ° C'de bir gece yapılabilir <ol start="7"><li> 4, 20 dakika boyunca bir mikrosantrifüj maksimum hızda örnekler Santrifüj ° C </li><li> Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve buz% 70 etanol 300 ul ile çöktürülmüş DNA pelet yıkayın. </li><li> 4, 10 dakika boyunca bir mikrosantrifüj maksimum hızda örnekler Santrifüj ° C </li><li> Dikkatle çok supernatant mümkün kaldırmak ve pelet kurumaya izin verin. </li><li> 20 ul steril H 2 O. içinde süspanse edin Örnekleri PCR için hazır, ya da DNA -20 ° C'de saklanabilir </li></ol> 9 - Temsilcisi Sonuçlar ChIP siyatik lezyon DRG'ler bir deney bir temsilci sonucu (Şekil 1 ve 2) gösterilir. İlk olarak, parçalanmış DNA uzunluğu yaklaşık 200-1000 bp (Şekil 1). İkinci olarak, protein-43 (GAP-43) sadece bağlı siyatik sinir yaralanması (şerit 4, Şekil 2, 5 ') ilişkili büyüme proksimal organizatörü PCR sinyali aşağıdaki ChIP göstermektedir. PCR sinyal yok hayvan sadece bir sahte yaralanma alır (şerit 3) ve IP (şeritli 5 ve 6) normal IgG serum kullanırken. Özgüllüğü antikor testi için, biz de aynı DNA örnekleri incelendiğinde, ama, bizim herhangi bir doluluk bekleniyor faiz genin 3'-UTR bir bölge algılayan bir kontrol astar set kullandı. PCR sinyalleri, standart PCR denetimleri gibi IP olmayan DNA örnekleri temsil giriş sinyali dışında şerit (şerit 3-6, Şekil 2, 3 '), (1-2 şeritli, figu bulunmadığınare 2). Bu ChIP prosedürü ya da siyatik ya da spinal dorsal kolon yaralanma bir şema (Şekil 3) özetlendiği gibi yapılabilir. <img src="/files/ftp_upload/2803/2803fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 parçası uzunlukları uygun aralığı sonication tarafından makaslanmış oldu ters çapraz bağlı DNA agaroz jel. <img src="/files/ftp_upload/2803/2803fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 asetillenmiş p53 GAP-43 siyatik sinir yaralanması 48 saat sonra proksimal promotor bölgesinde bağlar olduğunu gösteren siyatik sinir lezyonu aşağıdaki DRG doku Yarı-kantitatif PCR sonuçları. Kontrol PCR asetillenmiş p53 DNA GAP-43 geni (S = Şam, I = Sakat) 3'-çevrilmemiş bölge (UTR) bulunan bir kontrol bölgesi bağlamak olmadığını aynı DRG doku göstermektedir. <img src="/files/ftp_upload/2803/2803fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 siyatik sinir lezyonu siteleri ve dorsal sütun yerini gösteren bir diyagram.

<ol><li>Beirowski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+qualitative+analysis+of+Wallerian+degeneration+using+restricted+axonal+labelling+in+YFP-H+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative and qualitative analysis of Wallerian degeneration using restricted axonal labelling in YFP-H mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 134, 23-35 (2004).</li>
<li>Carey, M. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarey%2C+MF+%22Chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29%22">Chromatin immunoprecipitation (ChIP)</a>. , Cold Spring Harb. Protocol. (2009).</li>
<li>Dahl, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+micro+chromatin+immunoprecipitation+assay+%28%26mu%3BChIP%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (&mu;ChIP.</a> Nat. Protoc. 3, 1032-1045 (2008).</li>
<li>Haring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation%3A+optimization%2C+quantitative+analysis+and+data+normalization.+Plant+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods.</a> 11, 3-11 (2007).</li>
<li>Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).</li>
<li>Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neural+stem+cells+from+the+postnatal+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum.</a> Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).</li>
<li>Makwana, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+in+successful+peripheral+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Febs+J%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration.</a> Febs J. 272, 2628-2638 (2005).</li>
<li>Tedeschi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+p53-CBP%2Fp300+transcription+module+is+required+for+GAP-43+expression%2C+axon+outgrowth%2C+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">A p53-CBP/p300 transcription module is required for GAP-43 expression, axon outgrowth, and regeneration.</a> Cell Death and Differentiation. 16, 543-554 (2009).</li>
<li>Teng, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+regeneration+in+adult+CNS+neurons--signaling+molecules+and+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Axonal regeneration in adult CNS neurons--signaling molecules and pathways.</a> J Neurochem. 96, 1501-1508 (2006).</li>
</ol>

Bu protokol doğrudan aksonal yaralanma aşağıdaki yetişkin sinir sisteminde aksonal rejenerasyon sırasında kromatin çevre ile ilgili sormak için bir yöntem sağlar. PNS veya merkezi sinir sistemi ya da yaralanma sonraki transkripsiyonel ve epigenetik bir ortam probu ile kromatin immunoprecipitation DRG yaralanma modeli içermektedir. Sevdikleri transkripsiyon faktörü bağlayıcı varsayılan siteleri karakterize etmek istiyorum ve bu sitelerin doluluk hasarına yanıt olarak oluşup oluşmadığını belirlemek için araştırmacılar içi...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th></tr><tr><td> 10x ChIP Tampon </td><td> Hücre Sinyalizasyonu </td><td> 7008 </td></tr><tr><td> 2x ChIP Elüsyon Tampon </td><td> Hücre Sinyalizasyonu </td><td> 7009 </td></tr><tr><td> ChIP Sınıf Protein G Manyetik Boncuklar </td><td> Hücre Sinyalizasyonu </td><td> 9006 </td></tr><tr><td> Magna Yol Tutuş Raf (iyi 8) </td><td> Millipore </td><td> 20-400 </td></tr><tr><td> Kloroform </td><td> MERCK </td><td> BM 1888 </td></tr><tr><td> 37% Formaldehit </td><td> ROTH </td><td> CP10.1 </td></tr><tr><td> 10x Glycine Çözümü </td><td> Hücre Sinyalizasyonu </td><td> 7005 </td></tr><tr><td> Glikojen </td><td> Sigma </td><td> G1767 </td></tr><tr><td> 10x HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14185 </td></tr><tr><td> Histon H3 antikor (tavşan) </td><td> Hücre Sinyalizasyonu </td><td> 2650 </td></tr><tr><td> Normal tavşan IgG </td><td> Hücre Sinyalizasyonu </td><td> 2729 </td></tr><tr><td> Fenol / Kloroform / izoamil Alkol </td><td> ROTH </td><td> A156.1 </td></tr><tr><td> Proteaz İnhibitörleri Kokteyl Tablet </td><td> Roche </td><td> 04 693 116 001 </td></tr><tr><td> Proteinaz K (20 mg / ml) </td><td> Hücre Sinyalizasyonu </td><td> 10012 </td></tr><tr><td> SDS Lizis Tampon </td><td> Taşradaki </td><td> 20-163 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><th> Gerekli ekipman </th></tr><tr><td> Sonikatör </td></tr><tr><td> Micropestle </td></tr><tr><td> Mikrosantrifüj </td></tr><tr><td> Thermomixer </td></tr></tbody></table>

kromatin aksonal yaralanma dorsal kök ganglia doku immunoprecipitation

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Periferik sinir sistemi (PNS), bu yaralanma sonrası sınırlı bir ölçüde (Teng ve ark, 2006), rejenerasyon yaparken, merkezi sinir sistemi (MSS) aksonlar rejenere yok . PNS (Makwana ve ark, 2005) yaralanması üzerine yeniden neurite ve aksonal akıbet transkripsiyonel programları için gerekli olduğu kabul edilmektedir. Ancak, in vivo nöronal gen regülasyonu analiz araçları sınırlı ve genellikle zorlu . Dorsal kök gangliyon (DRG), santral sinir sistemi ve PNS hem de aynı soma kaynaklanan bir çatallı akson tarafından innerve çünkü mükemmel bir yaralanma model sistem sunmaktadır. Ganglionlar tüm transkripsiyonel olaylar meydana hücre gövdeleri ayrı bir toplama temsil eder ve bu nedenle kolay ve tekrarlanabilir hayvan çıkarılabilir transkripsiyonel aktivitesini açıkça tanımlanmış bir bölge. Aksonal rejenerasyon meydana PNS (örneğin siyatik sinir), sinir lifleri Sakatlık rejenerasyon yerde (örneğin omurilik almaz MSS benzer bir yaralanma yanıt, farklı bir dizi transkripsiyonel programları ortaya .) Histon, bağlayıcı transkripsiyon faktörü ve yaralanma ya PNS veya MSS çıkan DNA modifikasyonu Siteleri kromatin immunoprecipitation (ChIP) ile karakterize edilebilir. Burada, aksonal yaralanma sonrasında sabit fare DRG doku kullanarak ChIP protokol açıklar. Bu güçlü kombinasyon, aksonal rejenerasyonu teşvik için gerekli yanlısı rejenerasyon kromatin ortamı tanımlamak için bir araç sağlar.

Biz dorsal kök ganglion dokusundan kromatin immunoprecipitation aksonal yaralanma sonrası için bir yöntem mevcut. Bu yaklaşım, belirli bir transkripsiyon faktörü bağlayıcı siteleri ve periferik ve santral sinir sistemi hem de yaralı aksonların rejenerasyonu için histon ve DNA önemli epigenetik modifikasyon tanımlamak için kullanılır.

Kromatin Aksonal Yaralanma Dorsal Kök Ganglia Doku Immunoprecipitation

Merkezi sinir sistemindeki (MSS) aksonlar rejenerasyon göstermezken, periferik sinir sistemindekiler (PSS) ... sonrası sınırlı ölçüde rejenerasyon gösterir.

Bu prosedürün genel amacı, sinir hasarını takiben dorsal kök gangliyon dokusundan çapraz bağlı protein DNA komplekslerini immünopresipite etmektir. Bu işlem, öncelikle siyatik veya dorsal kolon hasarı indüklenerek gerçekleştirilir. İkinci adım ise örneğin çapraz bağlanması ve protein DNA kompleksinin çözünür hale getirilmesidir.Prosedürün üçüncü adımı, spesifik bir protein-DNA kompleksinin immünopresipitasyonunu yapmaktır. Son olarak, DNA saflaştırılır ve geri kazanılır. Nihayetinde, bir protein veya DNA histon modifikasyonu ile ilişkili DNA fragmanlarının zenginleşmesini gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bu yöntem, aksonal rejenerasyonun teşvik edilmesinde önemli olan genlerin düzenlenmesi için hangi DNA bağlanma bölgelerinin, transkripsiyon faktörlerinin ve histon modifikasyonlarının gerekli olduğu gibi, renal rejenerasyon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Başlamak için anestezi uygulanmış hayvanı cerrahi masaya yerleştirin. İşleme devam etmeden önce, burun konisi aracılığıyla sürekli isofluran oksijen uygulaması yaparak cerrahi boyunca anesteziyi sürdürün.Siyatik sinir yaralanması için ayak parmağı sıkıştırma refleksi ile anestezi derinliğinin uygunluğunu doğrulayın. Arka çeyreği dikkatlice tıraş edin ve kalan tüyleri bir epilasyon ajanı ile temizleyin. Tüyler temizlendikten sonra cildi ardışık alkol ve ardından Betadine uygulamaları ile temizleyin.Femurun posteriorunda ve ona paralel olacak şekilde cilt üzerinden dört milimetrelik bir insizyon yapın. Uyluğun orta kısmında, kasları birbirinden ayırmak ve altındaki beyaz siyatik siniri açığa çıkarmak için ince pensler kullanın. İzole edildikten sonra sinir, şam cerrahi kontrol olarak hizmet etmesi için kesilmeden bırakılabilir veya yaralanma oluşturmak için kesilebilir.Son olarak, dorsal kolon yaralanması için deriyi bir araya getirip iki sütür klipsi ile kapatın. Sırt bölgesindeki tüyleri temizleyin ve daha önce gösterildiği gibi insizyon bölgesini temizleyin. T 7 ile T 13 arasından spinal kordun üzerine 2,5 santimetrelik bir insizyon yapın.Yağı ayırırken cildi tutmak için ince pens kullanın. Ardından, yüzeysel yağı iki kanca ile sabitleyin. Yağ geriye çekildikten sonra, referans noktası olarak kullanmak üzere altıncı ve yedinci vertebralar arasındaki boşlukta bulunan kan damarını belirleyin.Sekizinci ve 10. vertebraların üzerinden kası bilateral olarak kesin ve açık tutmak için iki kanca yerleştirin. Spinöz çıkıntıyı tutarak, T 8'den T 10'a kadar lamina üzerindeki kasları temizlemek için küçük makas kullanın. Her iki taraftaki bağlantı kemiğini keserek T 10 seviyesinde laminektomi gerçekleştirin.Alttaki omuriliği açığa çıkarmak için vertebranın üst yarısını dikkatlice kaldırın. Omuriliği anestezi etmek için birkaç damla %2 Xylocaine uygulayın ve ardından dura mater'i çıkarın. Bu sırada omuriliğe dokunmamaya özen gösterin.Bu noktada durmak, dorsal kolonu zedelemek için şam cerrahi kontrol sağlayacaktır. Omurilik boyunca 0.3 ila 0.4 milimetre derinliğinde bir kesi yapın. Son olarak, kası dikerek kapatın ve yüzeysel yağı serbest bırakın.Deriyi bir araya getirip sütür klipsleri ile kapatın. Hayvanı ana kafesine geri yerleştirin ve tamamen iyileşene kadar izleyin. Yaralanmadan 48 saat sonra hayvanı ötanize edin ve L four ve L five dorsal kök ganglionlarını veya DRG'yi toplayın.İlk adım ventral spinal kolonun açığa çıkarılmasıdır. Ardından, T 12'den L 6'ya kadar olan vertebraların ventral yarısı çıkarılır. Omuriliği açığa çıkarmak için, vertebralar arasındaki boşlukta, omuriliğin yan tarafında yer alan DRG'ler belirlenir.L4 ve L5 DRG'lerini hafifçe kaldırmak için ince pensler kullanın. DRG gövdesine mümkün olduğunca yakın bir yerden kesin. Dört hayvandan toplam 16 DRG toplayın ve bunları buz soğukluğundaki HBSS içerisine yerleştirin.DRG'yi kısaca santrifüjleyin, 500 µL %1 formaldehit ekleyin ve örneği 37 °C'de 30 dakika inkübe edin. Fiksasyonu durdurmak için 125 mM glisin ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Kısaca santrifüjledikten sonra tamponu aspire edin ve dokuyu, proteaz inhibitörleri kokteyli eklenmiş 500 µL buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkayın.Ardından, PBS'yi aspire edin, 400 µL SDS lizis tamponu ekleyin ve dokuyu bir mikro havan eliyle yaklaşık 30 darbe ile parçalayın. Sonra, kromatini %70 çıkış gücünde, onar saniyelik sekiz pulse ile sonikasyona tabi tutun. DNA fragmantasyonunun yaklaşık 200 ila 1000 baz çifti uzunluğunda olduğunu doğrulamak için bir örneği analiz etmeniz önerilir.Parçalanmış kromatin örneğini yeni bir tüpe eşit olarak paylaştırın. Gerçekleştirilecek her bir immünpresipitasyon reaksiyonu için, her tüpün hacmini chip tamponu ve proteaz inhibitörleri kokteyli ile 500 microliters seviyesine tamamlayın. Ardından, seyreltilmiş örneğinizden beş microliters alın ve yeni bir tüpe aktarın.Bu sizin %1'lik girdi örneğinizdir ve ihtiyaç duyulana kadar -20 °C'de saklanacaktır. Daha sonra, her tüpe antikor veya normal IgG kontrolü ekleyin ve 4 °C'de, rotasyonla gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün.30 µL Protein G manyetik boncuğu ekleyip dört °C'de iki saat boyunca rotasyonla inkübe ederek kompleksi immün çöktürün. Ardından, bağlı kromatin boncuk kompleksini aşağı çekmek için tüpü manyetik bir rafa yerleştirin. Çözelti berraklaştığında süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın, boncukları bir mL düşük tuzlu tamponla üç kez yıkayın; her yıkama işlemi için dört °C'de üç ila beş dakika rotasyonla inkübasyon uygulayın.Ardından, bir mililitre yüksek tuz tamponu ile bir kez yıkayın. Bu aşamada, -20 °C'de saklanan %1 input örneğini çıkarın ve 150 µL çip elüsyon tamponu ekleyin. Tüpü, daha sonra kullanılmak üzere oda sıcaklığında kenara ayırın.IP örneklerine geri dönerek, her tüpe 150 µL 1x chip elüsyon tamponu ekleyin. Kromatini boncuklardan elüe etmek için örnekleri 65 °C'de 30 dakika boyunca hafif vorteksleme ile inkübe edin. Boncukları manyetik rafta çöktürün ve elüe edilen kromatini, girdi örnekleri de dahil olmak üzere tüm tüplerden yeni tüplere dikkatlice aktarın.Reaksiyon başına 200 millimolar sodyum klorür ve 40 micrograms proteinaz K ekleyin ve 65 degrees Celsius sıcaklıkta iki saat boyunca inkübe edin; inkübasyonun ardından, daha ileri analizler için DNA'yı standart prosedürleri kullanarak geri kazanın. Siyatik sinir lezyonunu takiben DRG dokusundan elde edilen yarı nicel PCR sonuçları gösterilmiştir. Birinci ve ikinci şeritler, girdi örneklerinden gelen PCR sinyalini göstermektedir.Dördüncü şeritteki PCR sinyali, asetillenmiş P 53'ün gap 43 proksimal promotör bölgesine yalnızca siyatik sinir yaralanmasından sonra bağlandığını göstermektedir. Üçüncü şeritte görüldüğü üzere hayvan yalancı yaralanmaya maruz kaldığında ve beşinci ile altıncı şeritlerde gösterilen normal IgG serumu kullanıldığında PCR sinyali görülmemektedir. Aynı DRG dokusundan alınan kontrol PCR'ı, asetillenmiş P 53'ün gap 43 geninin üç-asal çevrilmeyen bölgesinde bulunan bir kontrol DNA bölgesine bağlanmadığını göstermektedir.Bu prosedürü uygularken, başarı için üç kritik adımı hatırlamak önemlidir. Yeterli miktarda doku ile başlayın, DNA protein kompleksinin etkin bir şekilde fragmantasyonunu ve çözünmesini sağlayın ve ilgilendiğiniz protein için uygun bir immünopresipitasyon antikoru seçin.

chromatin-immunoprecipitation-from-dorsal-root-ganglia-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Biz yetişkin sıçan siyatik sinir miyelin bırakın ve kalan akson zenginleştirilmiş malzeme çıkarılması takip olmayan aksonal yapıları, lyse hipotonik orta sinir fasiküller ve kuluçka diseksiyonu dayalı axoplasm izolasyonu için bir protokol göstermektedir.

Sıçan Siyatik Sinir Axoplasm İzolasyon

Rizotomi sonra Dorsal Kök Aksonlar Canlı Görüntüleme

Kültür Yetişkin Dorsal Root Ganglion Nöronlar ile Axon Rejenerasyon Genetik Çalışma

Kaynak: Li, Q., et al. Memeli Akson Rejenerasyonunun Araştırılması: Yetişkin Fare Dorsal Kök Ganglionunun İn Vivo Elektroporasyonu. J. Vis. Uzm. (2018)Bu video, bir ezilme yaralanmasını takiben bir fare siyatik sinirinde aksonal rejenerasyon sürecini göstermektedir. İzole edilen sinir sabitlenir ve akson büyümesini görselleştirmek için nöronlarda eksprese edilen floresan proteinler ile görüntüleme için hazırlanır. Bir epifloresan mikroskobu kullanılarak, yeniden büyümenin derecesini...

Ezilme yaralanmasını takiben bir farenin siyatik sinirinde aksonal rejenerasyon

Kaynak: Li, Q. et al. Memeli Akson Rejenerasyonunun Araştırılması: Yetişkin Fare Dorsal Kök Ganglionunun İn Vivo Elektroporasyonu. J. Vis. Uzm. (2018)Bu video, akson rejenerasyonunu incelemek için fare DRG nöronlarının elektroporasyon aracılı transfeksiyonunu göstermektedir. Nükleik asit yapılarını DRG nöronlarına iletmek, siyatik sinir hasarını indüklemek ve aksonal rejenerasyonu değerlendirmek için adımları ana hatlarıyla belirtir.

Duyusal Akson Rejenerasyonunu Teşvik Etmek için Fare Dorsal Kök Gangliyonlarının Elektroporasyon Aracılı Transfeksiyonu

Santral sinir sistemi rejenerasyon ve onarım araştırmak Drosophila larva ventral sinir kablosu kullanarak bir yaralanma paradigma açıklanmıştır. Kasıtlı geliştirilen yazılım ve genetiği ile kantitatif analiz ile birlikte zaman atlamalı ve sabit örneklerde konfokal mikroskopi lazer tarama, ardından bıçaklama MSS rejenerasyon ve onarım moleküler mekanizmalarının araştırılması için kullanılır.

Santral Sinir Sistemi Onarım İnceleyecek Bir Sakatlık Paradigma<em&gt; Drosophila</em

Bu protokol, duyusal akson rejenerasyonunu incelemek için bir model olarak yetişkin bir sıçanda viral vektör ile bir dorsal kök ganglion (DRG) enjeksiyonunun ve eşzamanlı bir dorsal kök ezilme yaralanmasının kullanımını sunar. Bu model, duyusal akson rejenerasyonunu teşvik etmek için gen terapisinin kullanımını araştırmak için uygundur.

Sırt kök ganglion Enjeksiyon ve Dorsal Kök Duyusal Axon Rejenerasyon Modeli Olarak Ezilme Yaralanması

Elektroporasyon genler çıkarlarının hücrelere teslim etmek için etkili bir yaklaşımdır. Bu yaklaşım içinde vivo yetişkin fare dorsal kök gangliyon (DRG) nöronlar üzerinde uygulayarak, biz axon yenilenme içinde vivoçalışmaya bir modeli açıklar.

Soruşturma memeli Axon rejenerasyon: Vivo Elektroporasyon yetişkin fare Dorsal kök gangliyon

Burada sunulan, sürekli olarak yüksek kaliteli dorsal kök ganglion kriyostat kesitleri elde etmek için yapılan geliştirmedir.

Fare Dorsal Kök Ganglion Kriyoseksiyonu için Bir Prosedür

Bu protokol, aksonal yaralanma sonrası nöronal metabolik dinamikleri modelleyen, görüntüleme, çoklu omik analiz ve içsel metabolik yeniden şekillenmenin mekanik çalışmalarını mümkün kılan bir mikroakışkan sistemi tanımlar.

Aksonal Yaralanma Modelleri Yapımı ve Çoklu Omik Analizin Etkinleştirilmesi için Mikroakışkan Çip

Dorsal kök ganglionları (DRG), birincil duyusal nöron hücre gövdelerini içerir ve çevresel duyusal sinyalleri omuriliğe iletir. Bu protokol, yapısal olarak sağlam gangliyonların standartlaştırılmış izolasyonunu, anatomik segmental tanımlamayı, yeni başlayanlar için sezgisel rehberliği ve prosedürel doku hasarını azaltmayı destekleyen fare DRG diseksiyon yöntemini tanımlar.

Fare Dorsal Kök Gangliyonlarının Diseksiyonu ve İzolasyonu

Öğrenin, dorsal kök ganglia dokusundan kromatin immunoprecipitation yöntemiyle aksonal yaralanma sonrası transkripsiyon faktörü bağlanma bölgelerini ve epigenetik modifikasyonları nasıl tanımlayacağınızı.

Kromatin Aksonal Yaralanma Dorsal Kök Ganglia Doku Immunoprecipitation

Daha fazla video keşfet