Poliovirüs Kimlik Parçacık Aglütinasyon Yöntemi

Aşağıdaki prosedürün genel amacı, basit bir protokol kullanarak izole edilen bir çocuk felci virüsünü hızlı bir şekilde tanımlamaktır. Bu test için, IgG iki fc'ye bağlı insan poliovirüs reseptörünün hücre dışı alanını içeren kimerik moleküllerle kaplanmış hassaslaştırılmış jelatin parçacıkları kullanıyoruz. Bu partiküller, poliovirüs izolatlarının tüm serotipleri için tek tip bir afiniteye sahip olduğundan, partiküllerin aglütinasyonu, herhangi bir insan poliovirüsü içeren numunelerle inkübasyon sırasında meydana gelir.

Bununla birlikte, numuneyi izole eden spesifik virajı tanıyabilen antikorlar mevcutsa, nötralizasyon meydana gelir ve bu deneysel sistem kullanılarak aglütinasyonu önlerse, poliovirüs izolatlarının hızlı bir şekilde tanımlanması tek aşamalı bir reaksiyonda gerçekleştirilebilir. Mevcut geminin bu tekniğinin temel avantajı, geleneksel nötralizasyon testi gibi, prosedürün ve yorumlamanın SIM basitliğidir, bu da işçiliği azaltmayı ve gereken hızı hızlandırmayı ve sonuç alma süresini kısaltmayı amaçlar. Anti PV bir, PV iki ve PV üç antikorlarını yeniden oluşturmak için her şişeye 0.5 mililitre su ekleyin.

Daha sonra her bir antikor çözeltisini 4.5 mililitre bakım ortamı içeren ayrı tüplere aktarın. Bazı anti PV antikorları, bu tür anti PV antikorları için sulandırılmış formda sağlanır. Sulandırma için su ilavesi gerekli değildir.

Daha sonra, taze etiketli tüplerde 3.6 mililitrelik bir nihai hacim ile kombine antikor çözeltisinin bire bir karışımlarını hazırlayın. Örneğin, 1.8 mililitre anti PV bir ile 1.8 mililitre anti PV iki karıştırın. Bir anti PV bir artı PV iki kombinasyonu hazırlamak için, bunu mümkün olan her ikili kombinasyon için tekrarlayın ve ayrıca her bir antiserumun 1.2 mililitresini karıştırarak üç tip antikorun tümünü içeren bir çözelti hazırlayın.

Dört karışım, her bir antikor çözeltisine 720 mikrolitre FCS'de yapıldıktan sonra. Bu, test sırasında jelatin parçacıklarının antikorlar tarafından spesifik olmayan aglütinasyonunu azaltmaya yardımcı olacaktır. Antikor havuzları, aglütinasyon testinde kullanılana kadar eksi 20 santigrat derecede saklanabilir.

Bu tahlilde, insan poliovirüs reseptörünün hücre dışı alanları ve IgG iki fare FC alanı ile kaplanmış liyofilize jelatin parçacıkları kullanıyoruz. Parçacıkları her bir şişeye 1.5 mililitre sulandırma tamponunda yeniden oluşturmak için aglütinasyon görüntüsünün tutarlılığını sağlamak için tek bir deneyde farklı partiler değil, tek bir parti parçacık kullandığınızdan emin olun. İyice karıştırmak için hafifçe vurun.

Sulandırılmış parçacıklar iki haftaya kadar dört santigrat derecede saklanabilir. İlk olarak, deneyinizi 96 kuyulu bir mikrotitre plakasında tasarlayın. Her numune için, bir numaralı kuyu yalnızca virüs içerecektir.

İki ila beş numaralı kuyular, virüsü ve dört karışık antikor çözeltisinden birini içerecektir. Yalnızca virüs veya antikor içermeyen ortam içeren negatif bir kontrol için bir tane iyi sakladığınızdan emin olun. Plaka kurulduktan sonra, iki ila beşinci sıralardan ve 12 mikrolitre büyümeden her bir oyuğa 12 mikrolitre doğru antikor çözeltisi ekleyin.

Orta, tek başına virüse, birinci sıradaki kuyulara ve altıncı sıradaki negatif kontrol kuyusuna. Daha sonra, ilk beş sıraya 12 mikrolitre virüs örneği ve altıncı sıradaki negatif kontrol kuyusuna 12 mikrolitre büyüme ortamı ekleyin. Antikorlar ve virüs kaplandıktan sonra, sulandırılmış jelatin parçacıklarını hafifçe vurarak yeniden askıya alın ve hemen tüm kuyucuklara oyuk başına 25 mikrolitre parçacık ekleyin.

Her birinde eşit miktarda parçacık elde etmek için parçacıkları plakaya aktarmadan önce çökelmesine izin vermemek önemlidir. Tahlil plakasını bir plaka karıştırıcısına yerleştirin ve 30 saniye karıştırın. Daha sonra plakayı bir beyaz kağıda yerleştirin ve bir aglütinasyonun gerçekleşmesine izin vermek için plakayı oda sıcaklığında iki saat inkübe edin.

Oluşan aglütinasyon kararsız olduğu için inkübasyon sırasında veya sonrasında herhangi bir zamanda plakayı hareket ettirmemek önemlidir. Reaksiyon meydana geldikten sonra, her bir oyuktaki aglütinasyon kalitesinin takdir edilebileceği plakanın birkaç fotoğrafını çekin. Aglütinasyonun gerçekleşmediği kuyularda, burada solda gösterildiği gibi, renkli jelatin parçacıkları, aglütinasyonun meydana geldiği kuyularda kuyu dibinde çökelecektir.

Virüs ve pvr, IgG iki A kaplı jelatin parçacığı arasındaki etkileşim nedeniyle, merkezde gösterildiği gibi dağınık renkli bir desen görülebilir. Bu deneyde, virüs çözeltilerinin, PV bir, iki ve üçünün, antikor varlığında glukozu indükleme yeteneğini test ettik. Burada gösterildiği gibi belirtilen kombinasyonlar, virüs veya antikorların yokluğunda, aglütinasyon meydana gelmez ve jelatin parçacıkları, iyi içeren virüste aksine çökelir, ancak antikor yoktur.

Virüsün etkileşimi nedeniyle aglütinasyon meydana gelmiştir. Deney kuyucuklarındaki PVR IgG iki A kaplı jelatin partikülü ile, bu virüsü spesifik olarak nötralize eden herhangi bir kuyucuk içeren antikorlarda virüslerin bol miktarda ulusu önlenir. Örneğin, anti PV bir antikor içeren kuyucuklarda poliovirüs tip bir bolluk ulusu önlenir, ancak sadece anti PV iki ve anti PV üç antikorları içeren kuyucuklarda önlenmez.

Aynısı ikinci ve üç poliovirüs tipleri için de geçerlidir. Usta olsa da, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa üç saat gibi kısa bir sürede yapılabilir.