Name: Poliovirüs Kimlik Parçacık Aglütinasyon Yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Öğrenin, poliovirüs izolatlarını hızlı tanımlamak için jelatin parçacıkları ve kimera moleküller kullanan parçacık aglütinasyon yöntemini. Bu teknik, viroloji tanılarında zaman ve emek tasarrufu sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Junko Wada Biz onu mükemmel teknik yardım için teşekkür ediyoruz. Prof Akio Nomoto PVR-IgG2a için nazik bir bakülovirüs ifade vektör sağlamak için minnettarız. Bu çalışma kısmen desteklenen Hibeler Yardım Polio Eradikasyon Tanıtım ve Araştırma, Sağlık, Çalışma ve Refah Bakanlığı Emerging Infectious Diseases ve yeniden ortaya çıkan.

1. Bakım ortamın hazırlanması (MM) ve büyüme ortamı (GM) MM ve GM hazırlanması için, 1 Çocuk Felci laboratuar kılavuzuna bakın lütfen. Dulbecco'nun modifiye Eagle orta (DMEM),% 2 fetal buzağı serumu (FCS) ve% 10 FCS sırasıyla, MM ve GM yerine kullanılabilecek ile desteklenmiştir. 2. Anti-PV antikorların hazırlanması <ol><li> Anti-PV antikor (tip 1, 2 veya 3) Her flakon (vialde 0.5 ml) su ekleyerek sulandırın anti-PV antikor (RIVM PV yazarak antiserum). Bu sulandırılmış antikor çözümleri (her biri 0.5 mL), MM ayrı etiketli tüpler 4,5 ml ekleyin. Not: Bazı anti-PV antikor birçok sulandırılmış formu (vialde 0.5 mL) olarak verilmiştir. Anti-PV antikor böyle bir lot için, sulandırıldıktan için su eklenmesi gerekli değildir. </li><li> Sulandırılmış bir anti-PV antikor eşit miktarda karıştırın. Anti-PV1 +2, 2 +3 veya 3 +1: Mix her sulandırılmış antikor 1.8 mL (1.8 mL her bir karışım için + 1.8 ml = 3.6 ml). Anti-PV1 +2 +3: 1.2 mL (1.2 mL + 1.2 ml + 1.2 ml = 3.6 mL) her sulandırılmış antikor karıştırın. Not: PV örnekleri PV farklı serotipleri bir karışımını içerebilir. PV'lerin karışımı ile örneklerinde PV tek serotip tanımlamak için gerekli olan, anti-PV antikorları (yani 1 +2, 2 +3, 3 +1, 1 +2 +3) havuzları. </li><li> FCS (0.72 ml) 1 / 5 birim, her anti-PV (1 +2, 2 +3, 3 +1, 1 +2 +3) antikoru (3.6 mL Her) (son 18.2% FCS) ekleyin. Not: FCS eklenmesi non-spesifik antikorların yol açtığı jelatin parçacığın aglütinasyon azaltılması için. </li><li> -20 ° C'de PA tayininde kadar antikor havuzları tutun. </li></ol> 3. Sensitize jelatin parçacık, Sulandırma <ol><li> Sensitize jelatin parçacığın bir flakon (dondurularak kurutulmuş toz olarak verilmiştir) kiti dahil sulandırıldıktan tampon 1,5 ml ekleyin. </li><li> Nazik dokunarak iyice karıştırınız. </li><li> 4 sulandırılmış sensitize parçacık ° C tutun Sulandırılmış jelatin parçacık, 4 ° C'de muhafaza en az 2 hafta aktif olabilir, ancak testin hemen önce hazırlanmalıdır. </li></ol> Önemli not: Sensitize jelatin parçacıklar olmayan aglütinasyon görüntü parçacıkların çok farklı olabilir, çünkü farklı sensitize jelatin parçacıklar çok karışmaz. Her deney için, tek bir çok hassaslaşmış jelatin parçacık kullanılmalıdır. 4. PV kimlik PA testi <ol><li> Bir mikro-titrasyon tabak hazırlayın. Bir virüs örneği tanımlanması için, 5 kuyu gerekir + en az bir negatif kontrol (aşağıda sensitize virüs ve antikor olmadan parçacık, iyi # 6 Örnek hiçbir virüs ve antikor kontrol bakınız). Toplam kuyu sayısı 5 x örnekleri tahlil + en az bir kontrol. Önemli not: Tayininde en az bir virüs ve antikor kontrol ayırın. Sensitize parçacık Bir flakon için yaklaşık 10 virüs örneklerinin belirlenmesi. </li><li> Mikro-titrasyon plaka 12 mcL / anti-PV antikor ya da GM ekleyin. (Aşağıdaki örneğe bakın) aşağıdaki gibi plaka düzenlemedir. Antikor (iyi # 1 ve 6) neden olmadan numunelerin, 12 GM mcL yerine anti-PV antikor ekleyin. Önemli not: Bu testte birçok PV örnekleri test edilmesi gerekir, çok kanallı pipet veya dağıtıcı Bu adım için faydalı olacaktır. <table border="1"><tbody><tr><td> Eh # 1 </td><td> Eh # 2 </td><td> Eh # 3 </td><td> Eh # 4 </td><td> Eh # 5 </td><td> Eh # 6 </td></tr><tr><td> GM </td><td> anti-P1 +2 +3 </td><td> anti-P1 2 </td><td> anti-P2 3 </td><td> ani-P1 3 </td><td> GM </td></tr></tbody></table></li><li> / Iyi virüs örneği 12 mcL ekleyin. Virüs olmayan bir örnek (iyi # 6), 12 GM mcL virüs çözümü yerine ekleyin. Not: Virüs örnek, enfekte olmuş hücreleri, genellikle L20B hücreleri veya RD hücre kültürü süpernatant. Önemli not: Birçok PV numuneleri bu testte test edilecek olursa, çok kanallı pipet, bu adım için faydalı olacaktır. <table border="1"><tbody><tr><td> Eh # 1 </td><td> Eh # 2 </td><td> Eh # 3 </td><td> Eh # 4 </td><td> Eh # 5 </td><td> Eh # 6 </td></tr><tr><td> virüs örneği </td><td> virüs örneği </td><td> virüs örneği </td><td> virüs örneği </td><td> virüs örneği </td><td> GM </td></tr></tbody></table></li><li> 4 ° C oda sıcaklığına kadar sulandırılmış sensitize parçacık çözümü alın ve hafifçe dokunun parçacıklar tamamen askıya almak. Önemli not: Nazik dokunarak parçacıkların tam süspansiyon sonra yağış asılı kalan parçacıkları önce plakaları, parçacıklar hemen eklendi olmalıdırte ve form homojen olmayan bir çözüm. </li><li> Tüm kuyuları sensitize parçacık / iyi 25 mcL ekleyin. Önemli not: Sensitize parçacık eklenmesinden sonra, plaka örnekleri tek tip tepki hemen başlatmak için karıştırma plaka tabi olmalıdır. Bu nedenle, hassaslaşmış parçacık ek plakasını örnekleri arasında bir zaman farkı en aza indirmek için dağıtıcı kullanarak yapılmalıdır. </li><li> Mikro-titrasyon plaka bir plaka mikser üzerine koyun ve 30 saniye için plaka karıştırın. </li><li> Oda sıcaklığında bir masanın üzerine beyaz kağıt üzerinde mikro-titrasyon plaka koyun (görsel gözlem kolaylığı için) (15 ~ 30 ° C) 2 saat Önemli not: Plaka sonuçları gözlem ve fotoğraf alma için tepkime sırasında ve sonrasında hareket etmeyin. Oluşan aglütinasyon stabil değildir ve kolayca hareketli plakalar rahatsız. </li><li> Plaka fotoğraflar çekin. Önemli not: Fotoğrafların Kısmi görünümü, sonuçların yorumlanması için sonraki muayene ve inceleme için yeterli veri veremiyordum. Bazı fotoğraflar, kuyulardan aglütinasyon görüntü odaklanarak plakaların tüm kuyuları kapsayacak şekilde alınmalıdır. </li></ol> 5. Sonuçların Yorumlanması <ol><li> Pozitif ve negatif kuyuların belirlenmesi. Hayır virüs ve antikor kontrolü (jelatin parçacıklar, non-aglütinasyon yağış) (Şekil 1 ve 2) bu örnekleri aglütinasyon karşılaştırın. Pozitif olarak değerlendirilecek hiçbir virüs ve hiçbir antikor kontrolü (non-aglütinasyon negatif kontrol) açıkça ayırt aglütinasyon Görüntüler ve aglütinasyon negatif kontrol için benzer görüntüler negatif olarak değerlendirilecektir. Açık, ancak sadece kısmi aglütinasyon gösteren Örnekleri 'Olumlu (kısmi aglütinasyon)' gibi olumlu, ancak kayıt olarak değerlendirilecektir. </li><li> PV belirlenmesi. PV serotipleri belirlemek için anti-PV antikorları ile pozitif ve negatif kuyu dayalı sonuçları yorumlamak. Sonucun yorumlanması ilkesi hücre kültürü sistemi nötralizasyon testi (örneğin anti-P1 2 antikor için pozitif örnek tip 3 PV içerdiğini gösterir) 'e benzer. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar PA testi PV kimlik Temsilcisi sonucu Şekil 1'de gösterilmiştir. PV suşları sensitize jelatin partikülleri (No antikorlar örnekleri) aglütinasyon kurdu. Karşılık gelen anti-PV antikorları Hayır virüs benzer jelatin parçacıklar (non-aglütinasyon), yağış ve hiçbir antikorlar kontrolü (negatif kontrol) varlığında (örneğin, PV1 (Sabin) veya anti-P1 +2 varlığı gözlendi anti-P3 +1 antikorlar). <img src="/files/ftp_upload/2824/2824fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. PV1 (Sabin) PA yöntemi ile PV belirlenmesi Virüs çözümleri, PV2 (Sabin) ve PV3 (Sabin) (1.2 x 10 8 CCID 50 / 12 mcL, 8.2 x 10 7 CCID 50/12 mcL virüs titreleri ve 3,5 x 10 7 CCID 50/12 sırasıyla mcL), PA yöntemi ile belirlenmesi için kullanılmıştır . Hayır virüs ve hiçbir antikorlar kontrolü jelatin partikülleri (non-aglütinasyon, Negatif kontrol) yağış gösterdi. <img src="/files/ftp_upload/2824/2824fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Pozitif ve Negatif kuyu PV1 (Sabin) Virüs çözümleri, PV2 (Sabin) ve PV3 (Sabin) (2.4 x 10 8 CCID 50 / 25 mcL virüs titreleri, 1.7 x 10 8 CCID 50 / 25 mcL, yorumlanması. sırasıyla 7.3 x 10 7 CCID 50 / 25 mcL), 1 / 320 1 / 20 sulandırılmış, ve daha sonra seyreltilmiş örneklerinin 25 mcL anti-PV antikorları olmadan PA yöntemi ile incelendi.

<ol><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Polio+Laboratory+Manual+%284th+edition%29+WHO%2FIVB%2F04.10%22">Polio Laboratory Manual (4th edition) WHO/IVB/04.10</a>. , 4th Edition, World Health Organization. (2004).</li>
<li>Arita, M., Masujima, S., Wakita, T., Shimizu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+particle+agglutination+method+with+soluble+virus+receptor+for+identification+of+poliovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of a particle agglutination method with soluble virus receptor for identification of poliovirus.</a> J. Clin. Microbiol. 48, 2698-2702 (2010).</li>
<li>Bibb, J. A., Witherell, G., Bernhardt, G., Wimmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+poliovirus+with+its+cell+surface+binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Interaction of poliovirus with its cell surface binding site.</a> Virology. 201, 107-115 (1994).</li>
<li>Koike, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+poliovirus+receptor+protein+is+produced+both+as+membrane-bound+and+secreted+forms%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J.+9%22%5BJournal%5D)">The poliovirus receptor protein is produced both as membrane-bound and secreted forms.</a> Embo J. 9. , 3217-3224 (1990).</li>
<li>Mendelsohn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+a+human+poliovirus+receptor+gene+into+mouse+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transformation of a human poliovirus receptor gene into mouse cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 83, 7845-7849 (1986).</li>
<li>Mendelsohn, C. L., Wimmer, E., Racaniello, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+receptor+for+poliovirus%3A+molecular+cloning%2C+nucleotide+sequence%2C+and+expression+of+a+new+member+of+the+immunoglobulin+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular receptor for poliovirus: molecular cloning, nucleotide sequence, and expression of a new member of the immunoglobulin superfamily.</a> Cell. 56, 855-865 (1989).</li>
<li>Arita, M., Koike, S., Aoki, J., Horie, H., Nomoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+poliovirus+with+its+purified+receptor+and+conformational+alteration+in+the+virion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Interaction of poliovirus with its purified receptor and conformational alteration in the virion.</a> J. Virol. 72, 3578-3586 (1998).</li>
<li>McDermott, B. M., Rux, A. H., Eisenberg, R. J., Cohen, G. H., Racaniello, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+binding+affinities+of+poliovirus+for+its+cellular+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Two distinct binding affinities of poliovirus for its cellular receptor.</a> J. Biol. Chem. 275, 23089-23096 (2000).</li>
<li>Pipkin, P. A., Wood, D. J., Racaniello, V. R., Minor, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+L+cells+expressing+the+human+poliovirus+receptor+for+the+specific+detection+of+polioviruses+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterisation of L cells expressing the human poliovirus receptor for the specific detection of polioviruses in vitro.</a> J. Virol. Methods. 41, 333-340 (1993).</li>
<li>Avoort, H. G. vander <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+five+methods+for+intratypic+differentiation+of+polioviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparative study of five methods for intratypic differentiation of polioviruses.</a> J. Clin. Microbiol. 33, 2562-2566 (1995).</li>
<li>Kilpatrick, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+group-%2C+serotype-%2C+and+vaccine+strain-specific+identification+of+poliovirus+isolates+by+real-time+reverse+transcription-PCR+using+degenerate+primers+and+probes+containing+deoxyinosine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid group-, serotype-, and vaccine strain-specific identification of poliovirus isolates by real-time reverse transcription-PCR using degenerate primers and probes containing deoxyinosine residues.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 1939-1941 (2009).</li>
</ol>

Yeni Ürün Tasarımı Bölümü, Fujirebio Inc. Souji Masujima bir çalışanın

Bu PA testinin benzersiz bakış PV 2 tespiti için anti-PV antikor PVR molekülünün yerine kullanılmasıdır. Bu PV 3-6 üç serotipe düzgün bir yakınlığa sahip PV ile sensitize jelatin parçacıklar belirli bir etkileşim sağlar. PVR monomerik formları virion tek bağlayıcı site sadece orta yakınlık (~ -8 M 10 -7 asitlik sabiti) 7 çünkü, jelatin parçacıklar hassasiyete PVR immunoadhesin formu (PVR IgG2a) 8 ve başarıyla PV izolatların sensitize jelatin parçacıklar belirli aglü...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> Hassaslaşmış-jelatin parçacıklar </td><td> Fujirebio Inc. </td><td></td><td> Test kiti </td></tr><tr><td> Sulandırma tampon </td><td> Fujirebio Inc. </td><td></td><td> Test kiti </td></tr><tr><td> Microtitration plaka </td><td> Fujirebio Inc. </td><td></td><td> Test kiti </td></tr><tr><td> Anti-PV antikor </td><td> RIVM </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

poliovirüs kimlik parçacık aglütinasyon yöntemi

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

Küresel Polio Eradikasyon Girişimi, laboratuvar tanısı, akut flask paralizi (AFP) vakalarının dışkı örneklerinden izole edilip tanımlanması PV kritik bir rol oynamaktadır. Dünya Sağlık Örgütü (WHO) Küresel Polio Laboratuvarı Network, PV izolasyon ve tanımlama şu anda sırasıyla hücre kültürü sistemi ve gerçek zamanlı RT-PCR kullanılarak yapılmaktadır. PV-eradikasyonu sonrası çağda, basit ve hızlı bir şekilde tespit işlemleri ulusal laboratuvarlar çocuk felci vakalarının hızlı onay için yararlı olacaktır. Bu çalışmada, biz PV tanımlanması için geliştirilen roman PA testinin prosedürü gösterecektir. Bu PA testi PV reseptör (PVR) molekülü ve PV tüm serotipleri belirli ve düzgün bir benzeşme virion etkileşimi kullanmaktadır. İşlem son derece basittir (reaksiyon plakalar bir adım prosedürü) ve hızlı (sonuçlar reaksiyon 2 saat içinde elde edilebilir), ve sonuç görsel (jelatin parçacıkların aglütinasyon gözlem) görülmektedir.

Poliovirus (PV) virüs alıcı molekül kullanan son zamanlarda geliştirilen bir roman partikül aglütinasyon (PA) tahlil hızlı ve kolay bir kimlik izin verdi. Bu makalede, biz PA PV kimlik tayini için prosedür gösterecektir.

Poliovirüs Kimlik Parçacık Aglütinasyon Yöntemi

Küresel Polioyomiyelitle Mücadele Girişimi'nde laboratuvar tanısı, akut ... vakalarının dışkı örneklerinden PV izolasyonu ve tanımlanması yoluyla kritik bir rol oynamaktadır.

Aşağıdaki prosedürün genel amacı, basit bir protokol kullanarak polio virüsü izolatlarını hızlı bir şekilde tanımlamaktır. Bu analiz için, insan poliovirüs reseptörünün hücre dışı alanını içeren ve IgG iki fc'ye bağlı kimerik moleküllerle kaplanmış duyarlı jelatin partikülleri kullanıyoruz. Bu partiküller, tüm poliovirüs izolatı serotipleri için tekdüze bir afiniteye sahip olduğundan, herhangi bir insan poliovirüsü içeren örneklerle inkübe edildiğinde partiküllerin aglütinasyonu gerçekleşir.Buna karşın, örneği izole edilen spesifik virüsü tanıyabilen antikorlar mevcutsa nötralizasyon gerçekleşir ve aglütinasyonu önler; bu deneysel sistem kullanılarak poliovirus izolatlarının hızlı tanımlaması tek aşamalı bir reaksiyonla gerçekleştirilebilir. Geleneksel nötralizasyon testleri gibi mevcut yöntemlerin yanında bu tekniğin temel avantajı, iş gücünü azaltmayı, işlemleri hızlandırmayı ve sonuç alma süresini kısaltmayı amaçlayan prosedür ve yorumlama basitliğidir. Anti PV 1, PV 2 ve PV 3 antikorlarını yeniden çözmek için her bir şişeye 0,5 ml su ekleyin.Ardından, her bir antikor çözeltisini 4,5 mililitre bakım ortamı içeren ayrı tüplere aktarın. Bazı anti PV antikoru lotları, yeniden konstitüe edilmiş formda sağlanmaktadır; bu tür anti PV antikoru lotları için su ekleyerek yeniden konstitüasyon yapılmasına gerek yoktur.Ardından, yeni etiketlenmiş tüplerde, toplam hacmi 3,6 mililitre olacak şekilde kombine antikor çözeltilerinin bire bir karışımlarını hazırlayın. Örneğin, 1,8 mililitre anti PV bir ile 1,8 mililitre anti PV ikiyi karıştırın. Anti PV bir artı PV iki kombinasyonu hazırlamak için, bunu mümkün olan her ikili kombinasyon için tekrarlayın ve ayrıca her bir antiserumdan 1,2 mililitre karıştırarak her üç antikor türünü de içeren bir çözelti hazırlayın.Dört karışım hazırlandıktan sonra, her antikor çözeltisine 720 µL FCS eklenir. Bu işlem, analiz sırasında antikorlar tarafından jelatin partiküllerinin meydana getirdiği non-spesifik aglütinasyonu azaltmaya yardımcı olacaktır. Antikor havuzları, aglütinasyon analizinde kullanılana kadar -20 °C'de saklanabilir.Bu analizde, insan poliovirüs reseptörünün hücre dışı bölgeleri ve IgG2 fare FC bölgeleri ile kaplanmış liyofilize jelatin partikülleri kullanıyoruz. Aglütinasyon görüntüsünün tutarlılığını sağlamak için tek bir deneyde farklı lotlar değil, tek bir lot partikül kullandığınızdan emin olun; partikülleri her şişe için 1,5 milliliters reconstitution buffer ile yeniden süspanse edin. İyice karıştırmak için hafifçe vurun.Yeniden konstitüe edilen partiküller, dört °C'de iki haftaya kadar saklanabilir. İlk olarak, deneyinizi 96 kuyucuklu bir mikrotitre plaka üzerinde tasarlayın. Her örnek için, birinci kuyucuk yalnızca virüs içerecektir.İki ile beş arasındaki kuyucuklar, virüsü ve dört karma antikor çözeltisinden birini içerecektir. Virüs veya antikor içermeyen, yalnızca besiyeri içeren bir negatif kontrol için bir kuyucuğu ayırdığınızdan emin olun. Plaka kurulumu tamamlandıktan sonra, iki ile beş arasındaki satırlardaki her bir kuyucuğa 12 µL uygun antikor çözeltisi ve 12 µL büyüme besiyeri ekleyin.Sadece virüs içeren ortama, birinci sıradaki kuyucuklara ve altıncı sıradaki negatif kontrol kuyucuğuna ekleyin. Ardından, ilk beş sıradaki kuyucuklara 12 µL virüs örneği ve altıncı sıradaki negatif kontrol kuyucuğuna 12 µL büyüme ortamı ekleyin. Antikorlar ve virüs plaka üzerine eklendikten sonra, yeniden oluşturulan jelatin partiküllerini hafifçe vurarak süspande edin ve hemen tüm kuyucuklara kuyucuk başına 25 µL partikül ekleyin.Her bir kuyucukta eşit miktarda partikül elde edebilmek için, partikülleri plağa aktarmadan önce çökmelerine izin vermemek önemlidir. Deney plağını bir plak karıştırıcıya yerleştirin ve 30 saniye boyunca karıştırın. Ardından plağı beyaz bir kağıt üzerine koyun ve aglütinasyonun gerçekleşmesi için plağı oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin.Oluşan aglütinasyon kararsız olduğu için inkübasyon sırasında veya sonrasında plakayı hiçbir zaman hareket ettirmemek önemlidir. Reaksiyon gerçekleştikten sonra, her kuyucuktaki aglütinasyon kalitesinin değerlendirilebileceği şekilde plakanın birkaç fotoğrafını çekin. Aglütinasyonun gerçekleşmediği kuyucuklarda, burada solda gösterildiği gibi renkli jelatin partikülleri kuyucuğun dibine çökecektir; aglütinasyonun gerçekleştiği kuyucuklarda ise durum farklıdır.Virüs ve pvr arasındaki etkileşim nedeniyle, IgG iki A kaplı jelatin partiküllerinde merkezde gösterildiği gibi yaygın bir renk paterni görülmektedir. Bu deneyde, PV bir, iki ve üç virüs çözeltilerinin antikor varlığında glu indükleme yeteneğini test ettik. Virüs veya antikorların yokluğunda burada gösterilen kombinasyonlarda aglütinasyon gerçekleşmez ve jelatin partikülleri çöker; buna karşılık virüs içeren ancak antikor içermeyen kuyucuklarda durum farklıdır.Virüsün etkileşimi nedeniyle aglütinasyon gerçekleşmiştir. Deney kuyucuklarındaki PVR IgG ile kaplı jelatin partiküllerinin bulunduğu durumda, belirli bir virüsü spesifik olarak nötralize eden antikorlar içeren herhangi bir kuyucukta virüslerin aglütinasyonu önlenir. Örneğin, anti PV 1 antikorları içeren kuyucuklarda poliovirüs tip 1'in aglütinasyonu önlenirken, sadece anti PV 2 ve anti PV 3 antikorları içeren kuyucuklarda önlenmez.Aynı durum poliovirüs tip iki ve üç için de geçerlidir. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, işlem düzgün bir şekilde yürütülürse üç saat kadar kısa bir sürede tamamlanabilir.

particle-agglutination-method-for-poliovirus-identification

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Influenza A virüsünün genomu sekiz ayrı kompleksleri, RNA ve protein olarak adlandırılan viral ribonükleoprotein kompleksleri (vRNPs) oluşur. Bu yazıda, gliserol degrade arıtma ve influenza A vRNPs transmisyon elektron mikroskobu görselleştirme açıklamaktadır.

İnfluenza A Viral ribonükleoprotein Kompleksleri saflaştırılması ve Görselleştirme

Bu makalede, basit, kantitatif, sıvı faz afinitesi yakalama deneyi sunulmuştur. Bu bir yandan, diğer tarafta etiketli protein ve ikinci, etiketli protein (örn. poliovirus) arasındaki yakınlığı manyetik boncuk ve etiketli proteinlerin (örneğin nanobodies) arasındaki etkileşime dayanan güvenilir bir tekniktir.

Protein-Protein Etkileşimi Okumak Manyetik Boncuk Kullanarak Bir Sıvı Faz Affinity Yakalama Testi: Poliovirüs-Nanobody Örnek

Bu videoda, bir numuneden antijen gösteren virüs benzeri parçacıkları veya VLP'leri izole etmek için VLP yakalama testi adı verilen bir immünopresipitasyon testi gösteriyoruz. Antijen, manyetik boncuklara bağlı spesifik antikorlarla bağlanır ve daha sonra ayrılan ve daha fazla analiz için saklanan hareketsizleştirilmiş bir antijen-antikor kompleksi oluşturur.

Virüs Benzeri Parçacıklar Yakalama Testi: Nötralize Edici Antikor Konjuge Manyetik Boncuklar Kullanarak Antijen Gösteren VLP'leri Bir Numuneden İzole Etme Yöntemi

Bu video, influenza A ve B virüsleri arasındaki antijenik ilişkileri analiz etmek için görüntüleme tabanlı mikro nötralizasyon testini göstermektedir. Viral enfeksiyonu önlemede antikorların veya diğer tedavilerin etkinliğini değerlendirmek için nicel ve görsel bir yol sağlar.

Virüsler Arasındaki Antijenik İlişkinin Görüntü Tabanlı Mikronötralizasyon Testi Kullanılarak Analiz Edilmesi

Atomik kuvvet mikroskobunu biyopanlama teknolojisi ile birlikte kullanarak, düşük konsantrasyonlarda bile herhangi bir biyolojik materyalde bulunan hastalığa özgü protein varyantlarına karşı antikorlar elde etmek için negatif ve pozitif bir biyopanlama sistemi oluşturduk.  Amyotrofik Lateral Sklerozda rol oynayan TDP-43 protein varyantlarına karşı antikor elde etmede başarılı olduk.

Amyotrofik Lateral Skleroz TDP-43 Türevleri karşı Morfoloji Özel Reaktifler İzolasyonunda Roman Atomik Kuvvet Mikroskobu Tabanlı biopanning

Adenovirüs (Ad) ile enfekte olmuş insan hücrelerinden viral replikasyon kompartmanlarını (RC) izole etmek için yeni bir strateji sunuyoruz. Bu yaklaşım, viral genom replikasyonunu ve ekspresyonunu düzenleyen moleküler mekanizmaların yanı sıra RC'de kurulan viral-konak etkileşimlerinin düzenlenmesine yardımcı olabilecek hücresiz bir sistemi temsil eder.

Adenovirüs ile enfekte Normal İnsan Hücreleri Viral Çoğaltma Bölme zenginleştirilmiş Alt nükleer Kesirler izolasyonu

Basılı bir glikan mikrodizi stratejisi kullanılarak, influenza A virüsü hemaglutinin aviditesi ve sialik asit içeren reseptörler için özgüllüğünün analizi için geleneksel bir 96 oyuklu plaka testi minyatürleştirildi.

Influenza A Virüsü hemaglutininler aviditesi ve özgünlüğünün değerlendirilmesi için Minyatür Glycan Mikroarray Testi

Burada, enfekte amiplerin ayrılması için tek bir hücreli mikro-aspirasyon yöntemini tanımlıyoruz. Faustovirüsler ve bilinmeyen dev virüsler tarafından enfekte Vermamoeba vermiformis viral alt popülasyonları ayırmak için, aşağıda ayrıntılı protokolü geliştirdi ve iki düşük bolluk yeni dev virüs ayırma yeteneğini gösterdi.

Dev Virüs Karışım Ayırma için Floresan-Aktive Hücre Sıralama alternatif bir strateji olarak Tek Hücreli Mikro-aspirasyon

Burada, antijen gösteren virüs benzeri parçacıklar (VLP'ler) üzerindeki nötralizasyon epitoplarını tespit etmek için bir protokol sunuyoruz. İnsan immün yetmezlik virüsünün (HIV) türevli VLP'lerin immün özürlülüğü, protein G-konjuge manyetik boncuklarla birleştirilmiş zarf glikoproteinlere özgü monoklonal antikorlar kullanılarak gerçekleştirilir. Yakalanan VLP'ler daha sonra viral çekirdek protein Gag spesifik antikorlar kullanan SDS-PAGE ve Batı blot analizine tabi tutulur.

Virüs Benzeri Parçacık (VLP) Tabanlı Aşılarda Bir Yakalama Tahlili Kullanılarak Görüntülenen Antijenlerde Nötralizasyona Duyarlı Epitopların Tespiti

AAV6'ya karşı nötralize edici unsurları tespit etmek için hızlı, uygun maliyetli ve basit kolorimetrik hücre tabanlı bir test için kapsamlı bir laboratuvar protokolü ve analiz iş akışı açıklanmaktadır.

Kolorimetrik Hücre Tabanlı Bir Test Kullanarak AAV'ye Karşı Nötralize Edici Antikorları Tespit Etmek İçin Adım Adım Bir Yöntem

Bu el yazması, optimize edilmiş bir heparin bazlı afinite kromatografisi yöntemi kullanılarak adeno ile ilişkili viral vektörlerin üretilmesi ve saflaştırılması için ayrıntılı bir protokolü açıklamaktadır. Ultrasantrifüjleme ihtiyacını ortadan kaldıran basit, ölçeklenebilir ve uygun maliyetli bir yaklaşım sunar. Elde edilen vektörler, klinik öncesi çalışmalarda değerlerini kanıtlayan yüksek saflık ve biyolojik aktivite sergiler.

Adeno ile İlişkili Viral Vektörlerin Tek Adımlı ve Yarı Otomatik Heparin Afinite Kromatografisi Protokolü ile İzolasyonu

Öğrenin, poliovirüs izolatlarını hızlı tanımlamak için jelatin parçacıkları ve kimera moleküller kullanan parçacık aglütinasyon yöntemini. Bu teknik, viroloji tanılarında zaman ve emek tasarrufu sağlar.

Poliovirüs Kimlik Parçacık Aglütinasyon Yöntemi

Daha fazla video keşfet