Zebra balığı Pronephros Lazer Ablasyon Böbrek Epitel Rejenerasyon Eğitim

Bu prosedürün genel amacı, akut böbrek hasarı sonrası renal epitelyum rejenerasyonunu incelemek amacıyla, zebrafish embriyonik böbreği olan pronefros'taki böbrek hücrelerinin hedefe yönelik işaretlemesini gerçekleştirmektir. Bu işlem, öncelikle zebrafish embriyolarına bir dekstran floresan konjugatı mikroenjeksiyonu yapılarak gerçekleştirilir. Gece boyunca süren inkübasyon sırasında, konjugatlar nefron proksimal tübül hücreleri tarafından seçici olarak absorbe edilir.

Ertesi gün hücreler epi-floresan altında incelenir ve seçilen hücreler darbeli bir lazer sistemi kullanılarak ablate edilir. Daha sonra, histoloji, tüm bağlam C2 hibridizasyonu ve immünohistokimya kullanılarak morfolojik ve moleküler değişiklikler değerlendirilir. Bu tekniğin, nefrotoksik antibiyotik gentamisin kullanılarak oluşturulan akut böbrek hasarı gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, bu tür tedavilerin katastrofik hasarları tetiklemesi ve ölümcül olması nedeniyle renal rejenerasyon olaylarının zaman içindeki analizini engellemesidir.

Bu yöntem, epitel rejenerasyonu sırasında meydana gelen moleküler sinyalizasyon olaylarının tanımlanması gibi, böbrek alanıyla ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu teknikle ilgili ilk fikri, Petri kaplarında renal epitel rejenerasyonunun ayrıntılı bir analizini geliştirmek istediğimizde edindik. Fertilize zebrafish embriyolarını, metilen mavisi içermeyen modifiye E3 solüsyonu içinde toplayın.

Enjeksiyonlara başlamadan önce, embriyoların renal sisteminin çalışmaya başladığı, döllenme sonrası 48 ile 55 saat arası süreye kadar döllenmiş embriyoları 28.5 °C'de büyütün; embriyoları tutmak için üçgen çukurları olan bir kalıp kullanarak bir enjeksiyon ağacı hazırlayın. Ardından, standart mikroenjeksiyon iğneleri ve proksimal tübülü etiketlemek için bir enjeksiyon solüsyonu hazırlayın. Deneye embriyoları hazırlayarak başlayın.

İlk olarak, ince pens kullanarak çatlamamış yumurtaların üzerindeki Corian'ı temizleyin. Ardından Corian kalıntılarını ve Petri kabındaki artıklarını durulayın ve kabı 30 milliliters modifiye E three çözeltisi ile yeniden doldurun. İkinci olarak, larvaları beş milliliters trica ile anestezi edin.

Dokunma yanıtını kontrol ederek larvaların tamamen anestezi altında olduğundan emin olun. Tam olarak anestezi altına alınmadıkları takdirde, enjeksiyon sırasında seyirme yapacaklardır. Üçüncü olarak, plastik bir transfer pipeti kullanarak larvaları kalıba yerleştirin.

Hayvanları, başları çukurun en derin kısmına ve gövdeleri kuyucuğun yan tarafına gelecek şekilde yerleştirin. Hazırlanmış bir iğneye iki ila üç mikrolitre dekstran floresein yükleyerek intramüsküler mikroenjeksiyon işlemine geçin; iğneyi konumlandırın ve her hayvanın gövde somitine yaklaşık bir nanolitre çözelti enjekte edin. Dekstran konjugatları nefron proksimal tübülü tarafından kolayca endositoz edilir, bu da bu epitel hücre popülasyonunun tercihen etiketlenmesini sağlar.

Somitlerin üst kısmını hedefleyin ve vitellus kesesi uzantısından kaçının; aksi takdirde, bu hatalı enjekte edilmiş hayvanda olduğu gibi nefron tübülleri hasar görecektir. Larvalar enjekte edildikten sonra, onları temiz bir Petri kabına aktarın ve trica kalıntılarını tamamen temizlemek için taze E3 medyum ile üç kez yıkayın. Şimdi, kapağı folyo ile kapatın ve hayvanları gece boyunca 28 °C'de inkübe edin.

Bu prosedüre başlamadan önce immobilizasyon medyasını hazırlayın; bazı alikotları oda sıcaklığında hemen kullanmak üzere, geri kalan alikotları ise uzun süreli saklama için dört derece Celsius'ta tutun. İşleme, zebra balığı larvalarını 30 mL E3 içindeki beş mililitre trica ile anestezi ederek başlayın. Daha önce olduğu gibi, balıkların dokunsal uyarılara yanıt vermediğinden emin olun.

Şimdi, proksimal tübülleri kolayca görüntülenen larvaları seçmek için enjekte edilen hayvanları floresan altında inceleyin. 12 adede kadar larvayı; fitzy filtresi, parlak alan aydınlatması ve bir lazer performansı ile donatılmış bileşik bir floresan mikroskobunda, aynı konsantrasyonda trica içeren yeni bir kaba aktarın. Ablasyon işlemi, larvaların immobilizasyon medyası içeren bir kaba aktarılması ve anestezi uygulanmasıyla başlar.

İki dakika bekleyin, ardından larvayı immobilizasyon medyumu içeren bir cam çukur lam üzerine transfer edin. Hayvanı ince bir prob yardımıyla nazikçe sırtı yukarı gelecek şekilde konumlandırın ve sırt tarafına odaklanın. Şimdi, kalibre edilmiş bir darbeli mikro nokta lazer sistemi kullanarak, diğerini kontrol olarak sağlam bırakacak şekilde nefronlardan birini ablate edin.

Renal epitel hücreleri ablate edildikçe floresansın dağıldığını göreceksiniz. Ardından hayvanı nazikçe 12 kuyucuklu bir plağın kuyucuğuna aktarın ve metil selülozu temizlemek için E3 medyumunda üç kez durulayın. İlk 12 kuyucuklu plak dolana kadar nefronları ablate etmeye devam edin.

Ardından diğer 12 hayvanı anestezi altında bırakın ve işlemi tekrarlayın. Proksimal tübülü öncelikli olarak etiketlemek için Dextra Fitzy enjekte edildi. Döllenmeden üç gün sonra her hayvanın nefronuna lazer ablasyonu uygulandı.

Ablasyonun bir gün sonrası. Ablasyondan dört gün sonra rejenerasyon belirgin değildir, ancak in situ iki bölgesindeki hücre ablasyonunu takiben rejenerasyon gerçekleşmiştir. Tekil zaman noktalarındaki fikse edilmiş örneklerdeki değişiklikleri analiz etmek için hibridizasyon kullanılmıştır.

Bu embriyo ablasyona tabi tutulmamıştır. Buna karşılık, bu embriyonun tübüler epitelinin geniş bir kısmı ablate edilmiş ve bu embriyonun tübüler epitelinin kısa bir aralığı ablate edilmiştir. Bu prosedürün ardından, nefron rejenerasyonu sırasında gen ekspresyonu değişikliklerinin kimliği gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla, hol mount situ hibridizasyonu gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Kimyasallarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu prosedür sırasında laboratuvar önlüğü ve eldiven gibi kişisel koruyucu ekipmanların kullanılması gibi önlemler önerilir.