Name: Cerrahi Örneklerinin tümör eksplantlarındaki Roman Anti-Kanser İlaç Geliştirme Yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Öğrenin, tümör eksplant yöntemiyle beyin tümörlerinin cerrahi örneklerinde ilaç etkinliğini değerlendirmeyi. Bu yöntem, tümör mikroçevresini koruyarak gliom tedavileri için güvenilir sonuçlar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Amerikan Kanser Derneği (MRSG-08-108-01), Vincent J. Sgro / Amerikan Beyin Tümörü Derneği ve Ben Nakano Han Aile Vakfı.

1. Ortam hazırlanması <ol><li> Toz (1.01614.1000-EMD,% 0.6 Arıtılmış Agar çözüm - DMEM/F-12 (1X), Sıvı 01:01 (Invitrogen 10.565-042) - medya% 10 FBS (Gibco 16.140-071) kullanılarak hazırlanmıştır. .) Deney boyunca steril koşullar tutuldu. </li><li> FBS medya 5ml hazırlanması için (16.140-071 - Gibco) - 50ml son hacim Sıvı 1:1 (Invitrogen 10.565-042), DMEM/F-12 (1X) 45mL eklendi. Hazırlanan medya, 37 ° C sıcaklık su banyosunda tutuldu. </li><li> Agar çözüm ısı mikrodalga yöntemi kullanılarak hazırlanmıştır. 0.3 gram toz agar mikrodalga kullanarak 50ml distile su dağıldı. Agar çözüm su banyosu içine tutarak 37 ° C sıcaklığa kadar soğumaya oldu. </li><li> Biz medya adım 1.2 ve 1.3 ve hazır stok çözelti eşit hacimde kullandı. Oranı% 0.6 agar (0.5mL) ve% 10 FBS-D-MEM/F-12 medya (0.5mL), 1:1, 6 kuyucuğu her kuyuda toplam hacim 1 ml. </li></ol> 2. Doku işleme <ol><li> Glioblastoma Multiforme (GBM) dokuları Patoloji Anabilim Dalı ameliyattan sonra hemen alındı. Doku Patoloji Anabilim Dalı GBM olarak sınıflandırıldı. </li><li> Doku dikkatlice forseps kullanarak patri plakalı aktarılır ve buz 5ml 1XPBS ile 3 kez yıkandı. </li><li> Disseke örneklerinden bir cerrahi bıçak (Feather-2976 # 10) ve forsepsle (balıkçı bilimsel) ile tümör bloklar (çapı yaklaşık 10 mm) oluşturmak için numuneler seri bölümleri kesilmiştir. </li><li> Blokları 6 plaka aktarılır. Her ortam de içeren oldu 1mL 1.4 adım söz. Doku doku canlı tutmak için hava yeterince maruz vardı. </li><li> Tümör bloklar sonra DMSO (% 5) veya TMZ (2.5 nM) enjekte edilir ve 37 ° 16 saat süreyle inkübe edildi ° C,% 5 CO2 içeren nemlendirilmiş hava. DMSO 0.1ml (% 5) veya TMZ tutarlı tedavisi için farklı yerlerde tümör bloklar 3 kez enjekte edildi. 28G1 / 2 0.37X12.7mm İnsülin Şırınga 1mL (Rahatlık noktası 26.027) kullanarak ilaç enjekte edildi. </li><li> 16 saat sonra blok 3 kez 5 ml 1XPBS ile yıkandı. Bloklar yıkadıktan sonra 10 ml, 50 ml tüpler 24 saat için v / v% 10 formalin (Ricca kimya şirketi) (BASIX 5.539.802) ile tespit edildi ve 4μm bölümleri gömülü parafin için işlenmiş. </li><li> "HAYIR ISI" formalin sabit bölümünde heyecan plaka beher yerleştirilir ve 30 dakika her çözüm için aşağıdaki çözümleri yoluyla işlenmiş. % 30 etanol,% 50 etanol,% 75 etanol,% 80 etanol,% 95 etanol,% 100 etanol, ksilen. </li><li> Doku kağıt havlu, lekelenen ve 30 dakika boyunca erimiş parafin (58 - 60 ° C, Fisher paraplast parafin) yerleştirildi. </li><li> Doku Surgipath Blue Ribbon parafin kullanarak kalıpları gömülü, gömülü doku oda sıcaklığına kadar soğutulur. </li><li> Parafin 4μm doku kesitlerinde alınan ve Fisher Plus, slaytlar yerleştirildi. </li></ol> 3. İmmünohistokimya Daha önce açıklandığı gibi İmmünohistokimya yapıldı. 1 <ol><li> Deparaffinization ve rehidrasyon rafa yerleştirin slaytlar ve aşağıdaki adımları uygulayın. 3x5 dakika (5 dakika boyunca 3 kez), 3x5 dakika süreyle% 100 etanol, 1x5 dakika boyunca% 95 etanol, 1x5 dakika boyunca% 70 etanol, ksilen, 3 dakika boyunca çalışan musluk suyu ile durulayın. </li><li> Bir cam behere distile su ile seyreltilmiş 1X sitrat tamponu (Thermo bilimsel-AP9003-500), ısıya bağlı epitopu alma daldırın slaytlar ile antigen retrieval. Sıcak bir tabak (emin bölümleri don "t slayt düşmek olun) 15 dakika boyunca kaynatın. Oda sıcaklığında 30 dakika süreyle soğuk çözüm. Slaytlar 3x5 dakika için 1X PBS ile yıkayın. </li><li> Iç peroksit inhibisyonu, 15 dakika boyunca cam beher% 0,3 hidrojen peroksit (distile su Fisher Scientific-BP2633-500-seyreltilmiş), metanol slaytları (Fisher Scientific-A-452-4) bırakın. 3x5 dakika için 1X PBS içinde durulayın. </li><li> % 10 normal keçi serumu ile dokuların Kapak engelleme. Nemli bir kutuya aktarın ve slaytlar az 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. Slaytlar, 3x5 dakika için 1X PBS ile yıkayın. </li><li> 1X PBS ile sulandırılmış insan özel Kaspaz-3 (1:1,000, Ar-Ge sistemleri, AF835), Ki67 (1:1, Dako, 15.626): Primer antikor Bölüm ° C primer antikor ile aşağıdaki konsantrasyonlarda 4 gece inkübe edildi. Ertesi gün 1X PBS 3x10 dakikalık slayt durulayın. </li><li> İkincil antikor reaksiyonu dokuların HRP etiketli ikincil antikor 2-3 damla (tahayyül sistemleri) ile kaplayın. Slaytlar nemli bir kutuya koyun ve 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. 3x10 dakika için 1X PBS ile yıkayın. </li><li> Algılama üreticinin protokolü takiben primer antikor tespiti için kromojen DAB kiti (Vektör laboratuarlar-SK-4100) geliştirin. </li><li> Sayaç boyama (hematoksilen ile slaytlar daldırın 10-15 s saniye basılı tutun) emin don "t taşması DAB sinyali olun. 3 dakika şebeke musluk suyu ile durulayın. </li><li> Dehidrasyon daldırın aşağıdaki sırayla slaytlar, Ksilen 3x5 dakika için 5 dakika, 5 dakika boyunca% 95 etanol, 3x5 dakika süreyle% 100 etanol,% 70 etanol. </li><li> Kapak permount montaj reaktifi (Fisher Scientific-SP-15-100) ile slaytlar kayma. </li><li> Görüntüler Olympus floresan mikroskobu (DP-72) .3.11) kullanarak alınmıştır. Tüm deneyler, özel etiketleme primer antikor olmadan negatif kontrol tarafından da teyit edildi. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: Glioblastoma multiforme (GBM) cerrahi örneği toplandı. Temozolomide (TMZ) dahil olmak üzere önceden kemoterapi olmadan hastalarda ilk cerrahi uygulandı. Şekil-1a Gadolinyum geliştirme ile MRI T1 ağırlıklı görüntü, ameliyattan önce sağ frontal lob gelişmiş bir tümör saptandı. Ameliyat sonrası görüntü (Şekil-1b), cerrahi sonrası lezyonun subtotal çıkarılması doğruladı. Cerrahi dokuların klinik tanı amaçlı Patoloji Anabilim gönderildi ve kalan örnekleri onaylanan Kurumsal Değerlendirme Kurulu (KİK), Ohio State Üniversitesi Tıp Merkezi tarafından da protokol kapsamında doku ihale işlendi. Hematoksilen ve Eosin (H &amp; E) ile boyanarak nekroz varlığı pseudopallisading hücreleri, ve mikrovasküler proliferasyon (Şekil 1-c) gösterdi. Böylece, bu tümörlerin histopatolojik GBM olarak teşhis edildi. Notu, 48 saate kadar TMZ olmadan inkübasyon tümör eksplantlar GBM hücre mimarisini korumuştur. Aksine, 72 saat veya daha uzun kuluçka, bazı tümör hücreleri başlayan düşündüren örneklerinde yoğunlaşmış çekirdeklerin artan sayıda fark apoptozis tabi. Sonuç olarak, uzun inkübasyon sonrası tümör dokularında tümör hücrelerinin, tercihen nekrotik alanlar (veriler gösterilmemiştir) ve çevresinde gözlenmiştir kaybetti yamalı bölgeleri içeriyordu. Bu tümör eksplant örnekleri güvenilir ilaç etkinliğini test amaçlı kullanılabilir araştırmak amacıyla, TMZ tedavi etkisi test edilmiştir. Şekil-2 Bu çalışmada deneyler akışını temsil eder. Son zamanlarda yapılan bir çalışma, TMZ intratümöral enjeksiyon, bu ilacın 2 sistemik yönetiminin daha malign glioma büyüme kontrolü daha güçlü etkiye sahip olduğunu belirtti. 16 saat inkübasyon sonrasında, bu eksplantlar parafin ve seri bölümleri boyama için hazırlanmıştır gömüldü. TMZ tedavi GBM dokuların İmmünohistokimya kontrol örnekleri ile karşılaştırılması Ki-67 pozitif tümör hücrelerinin önemli bir azalma göstermiştir. Buna karşılık, bir apoptozis marker, Kaspaz-3, ile immünohistokimya TMZ tedavi glioma numuneler ve kontrol numuneleri (Şekil-3) arasında anlamlı bir fark elde edemedim. TMZ ile tedavi etkisi daha fazla in vitro kültür veya flow sitometri ile birlikte bu eksplant tahlil birleştirerek karakterize edildi. Özellikle, kök hücre gibi tümör hücrelerinin (SCLTC) üzerindeki etkisini belirlemek için çalıştı. Bu nedenle, TMZ ile intratümöral tedaviyi takiben, küre oluşturan bu tümör eksplant tahlil ve flow sitometri yapıldı. TMZ muamele örnekleri tek tek tek hücrelerin içine ayrışmış ve bu tek hücre, serum serbest ortamda bFGF ve AGF ile desteklenen 96-kuyucuğu (1 mikrolitrelik hücre başına veya daha düşük) bir düşük yoğunluklu ekilirler. Kontrol grubunda ise 7 günlük inkübasyondan sonra, tümör eksplantlar tümör alanlarında oluşumu gözlenmiştir. Kürenin oluşumu SCLTC 3 4 bir özellik olduğu göz önüne alındığında, bir ilaç tedavisi ile tümör küre sayısında değişiklikler SCLTC üzerindeki etkisini gösterir. Benzer şekilde, bir hücre yüzey marker, CD133 ile ayrışmış tümör eksplant flow sitometri, SCLTC üzerindeki etkisini doğrulamak amacıyla yapılmıştır. GBM heterojen tümör hücrelerinde SCLTC seçici bir ilaç tedavisi ile ortadan kaldırılması ise, bir tedavi (veriler gösterilmemiştir) flow sitometri CD133 pozitif kesir azalma tespit tahmin olabilir. <img src="/files/ftp_upload/2846/2846fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Bir hasta GBM Şekil.1 Manyetik rezonans görüntüleri (MRG), operasyon öncesi Şekil-1a ve post-işlem Şekil-1b Temsilcisi rakamlar . Şekil-1c, taze GBM doku örneği H &amp; E boyama. Orijinal büyütme, 40X. <img src="/files/ftp_upload/2846/2846fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil. 2 blok kültür deney deneysel akışı Şekil-2a. Image taze cerrahi GBM patoloji bölümü alınan. Şekil-2b yardım cerrahi bıçak ile 10mm küçük parçalar halinde Diseksiyon tümör bloğu gösterir. Şekil-2c insülin şırınga kullanarak tümör blokları (TMZ) ilaç tedavi yöntemidir. e 3 "/&gt; Şekil. 3 İmmünohistokimya aktif Kaspaz-3 ve Ki67 DMSO veya TMZ enjekte GBM doku blokları İmmünohistokimya. Hematoksilen nükleer boyanma için kullanılmıştır. Orijinal büyütme, 40X.

<ol><li>Hemmati, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancerous+stem+cells+can+arise+from+pediatric+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cancerous stem cells can arise from pediatric brain tumors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 15178-15183 (2003).</li>
<li>Heimberger, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temozolomide+delivered+by+intracerebral+microinfusion+is+safe+and+efficacious+against+malignant+gliomas+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Temozolomide delivered by intracerebral microinfusion is safe and efficacious against malignant gliomas in rats.</a> Clin Cancer Res. 6, 4148-4153 (2000).</li>
<li>Nakano, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+embryonic+leucine+zipper+kinase+is+a+key+regulator+of+the+proliferation+of+malignant+brain+tumors%2C+including+brain+tumor+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Maternal embryonic leucine zipper kinase is a key regulator of the proliferation of malignant brain tumors, including brain tumor stem cells.</a> J Neurosci Res. 86, 48-60 (2008).</li>
<li>Laks, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosphere+formation+is+an+independent+predictor+of+clinical+outcome+in+malignant+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Neurosphere formation is an independent predictor of clinical outcome in malignant glioma.</a> Stem Cells. 27, 980-987 (2009).</li>
<li>Phillips, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+subclasses+of+high-grade+glioma+predict+prognosis%2C+delineate+a+pattern+of+disease+progression%2C+and+resemble+stages+in+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular subclasses of high-grade glioma predict prognosis, delineate a pattern of disease progression, and resemble stages in neurogenesis.</a> Cancer Cell. 9, 157-173 (2006).</li>
<li>He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoproteomic+Analysis+of+Glioblastoma+Stem+Cell+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Glycoproteomic Analysis of Glioblastoma Stem Cell Differentiation.</a> J Proteome Res. , (2010).</li>
<li>Ma, Y. H., Xu, Q. S., Zheng, J. S., Zhou, Y. Q., Zhan, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+stem+cell+markers+and+proliferative+labeling+on+glioma+cell+lines%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Zhonghua+Bing+Li+Xue+Za+Zhi%22%5BJournal%5D)">Expression of stem cell markers and proliferative labeling on glioma cell lines].</a> Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi. 37, 333-334 (2008).</li>
<li>Vik-Mo, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumor+stem+cells+maintain+overall+phenotype+and+tumorigenicity+after+in+vitro+culturing+in+serum-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Brain tumor stem cells maintain overall phenotype and tumorigenicity after in vitro culturing in serum-free conditions.</a> Neuro Oncol. 12, 1220-1230 (2010).</li>
<li>Hovinga, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+notch+signaling+in+glioblastoma+targets+cancer+stem+cells+via+an+endothelial+cell+intermediate.+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Inhibition of notch signaling in glioblastoma targets cancer stem cells via an endothelial cell intermediate. Stem Cells.</a> 28, 1019-1029 (2010).</li>
<li>de Groot, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+invasion+after+treatment+of+glioblastoma+with+bevacizumab%3A+radiographic+and+pathologic+correlation+in+humans+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Tumor invasion after treatment of glioblastoma with bevacizumab: radiographic and pathologic correlation in humans and mice.</a> Neuro Oncol. 12, 233-242 (2010).</li>
</ol>

Ilacın etkinliği ve klinik öncesi deneysel modeller hastalarda etkinliği arasında bir boşluk vardır. Daha spesifik olarak, beyin tümörü araştırma alanında, roman ve güvenilir yöntemler mevcut yöntemleri ile ilaç değerlendirme ve hastalarda etkinliği arasındaki mevcut boşluğu doldurarak yardımcı olacağını gereklidir. Bu çalışmada açıklanan tahlil, etkilenen hastaların deneysel veriler ve sonuç tutarsızlık doldurarak kolaylaştırmak için bir çözüm değilse, ek bir varlık. , In vitro hücre kültürleri Tercihen kültür koşulları ne olursa olsun belirli bir tümör hücre türleri genişletmek ve ek olarak sadece bir tümörün tamamını ICSI&#39;nin 5 temsil eden yapay hücre genişleme, genetik ve fenotipik dönüşüm gerçekleşir ve uzun vadeli hücre kültürleri ile kaçınılmaz . Malign glioma tedavi için en önemli engellerden biri, tek bir tümör içinde ve tümör örnekleri 6, 7 arasında iki tümör hücrelerinin, heterojen . Bu nedenle, selektif zenginleştirme, ne olursa olsun bir tür veya başka bir tümör hücreleri belirli bir nüfusun heterojen tümör hücreleri üzerinde herhangi bir kemoterapötik ajanların etkinliğini belirlemek için uygun bir araç olamaz. Beyin tümörlerinin bir ICSI&#39;nin türetilen 8 9 Herhangi bir hayvan modeli tümör hücrelerinin ICSI&#39;nin ilaç etkinliği üzerine ışık tutacak, ancak tümörün tamamını. Çeşitli sınırlamalar, diğer taraftan, hala bu tümör eksplant yöntemi olmaya devam etmektedir. Böyle bir sınırlama tedavi nispeten kısa bir süre. Malign tümör hücreleri değil, tüm tedaviler zamanla, kısa vadeli tümör hücre büyümesini ilk kontrolü uzun süreli hasta prognozu yansıtılacaktır olmayabilir eğer, çoğu direnç elde etmek için kabul olduğundan, yakın zamanda bir anti-rapor edildi anjiyogenik ajan, 10 bevacizumab. Böylece, uzun bir süre için dokuları korumak için bu eksplant tayini için protokol iyileştirilmesi, daha ileri araştırmalar gereklidir. Diğer bir soru, belirli bir tümör SCLTC üzerinde test edilen ilaç etkisi. SCLTC malign glioma, kuvvetli SCLTC garanti ortadan kaldırılması, yeni anti-kanser ilaçlar belirlenmesi için mevcut tedaviler oldukça dayanıklı olduğu göz önüne alındığında. Bu bağlamda, şu anda, neurosphere oluşturan assay (veriler gösterilmemiştir) gibi in vitro deneyler, sonraki bu eksplant tahlil birleştirmek için çalışırlar . Biz, bu kombine testleri aracılığıyla SCLTC bir ilaç adayı varsa, etkileri hakkında daha fazla bilgi edinmek almak için bekliyoruz. Son olarak, tümör örneklerinin küçük bloklar kullanılarak, geleneksel cerrahi örneklerinden tümör hücre hatları veya primer kültürlerinde olduğu gibi, tüm tümör hücre popülasyonlarının yansıtmıyor olabilir. Bu konular bir yana, vasküler niş de dahil olmak üzere tümör stroma, koruyarak, tümör hücreleri için çevresel faktörler karakterize yararlı olur. Bu nedenle, bu testte daha fizyolojik ilgili bir koşul altında herhangi bir tedavi stratejileri değerlendirmek için potansiyeli olabilir. Burada, GBM cerrahi örneklerin eksplantlar ilaç etkinlik testleri için bir test kurdu. Aslında, test edilen cerrahi numuneler, TMZ direkt enjeksiyon GBM örneklerin çoğalması azalttığı bulundu. Bu doku eksplant yöntemi teorik diğer katı kanser uygulanabilir ve umarım bize kanserler için klinik çalışmalarda bir başarısızlık kaçınarak yardımcı olacak bir hastanın tümör ilaç etkinliği belirlemek için varlık sağlar.

<table border="1"><tr><td> Reaktifin Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum, Nitelikli, Isı-İnaktive </td><td> Gibco </td><td> 16140-071 </td></tr><tr><td> D-MEM/F-12 (1X) Sıvı 01:01 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565-042 </td></tr><tr><td> Agar-Agar Saflaştırılmış, Granül </td><td> EMD </td><td> 1.01614.1000 </td></tr><tr><td> Boyama DPBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td></tr><tr><td> Hematoksilen </td><td> Richalrd allan BİLİM </td><td> 7211 </td></tr><tr><td> % 10 w / v formalin Kaspaz-3 </td><td> Ricca kimyasal şirketi </td><td> 3810 </td></tr><tr><td> Kaspaz-3 </td><td> Ar-Ge sistemleri </td><td> AF835 </td></tr><tr><td> Ki67 </td><td> Dako </td><td> 15626 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D2650 </td></tr><tr><td> Sistem anti-fare imgeleyin </td><td> Dako </td><td> 2012-07 </td></tr><tr><td> Imgeleyin sistem anti-tavşan </td><td> Dako </td><td> 2011-12 </td></tr><tr><td> DAB-kit </td><td> Vektör Lab. </td><td> SK-4100 </td></tr></table> Tablo 1: Malzeme. <table border="1"><tr><td> Ekipman Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> 6 plaka </td><td> Greiner-biyolojik bir </td><td> 657160 </td></tr><tr><td> Petri kabı </td><td> VWR </td><td> 25384-302 </td></tr><tr><td> Serolojik pipet </td><td> Axygen </td><td></td></tr><tr><td> Filtre ipuçları </td><td> ABD bilimsel </td><td></td></tr><tr><td> 500 mikron polyester mesh Netwell insert </td><td> Costar </td><td> 3480 </td></tr><tr><td> Matrigel Matrix </td><td> BD Biosciences </td><td> 354230 </td></tr><tr><td> BD 10 ml şırınga </td><td> BD biyoloji </td><td> 309604 </td></tr><tr><td> Hipodermik iğne Alüminyum Hub. </td><td> Tyco Health Care </td><td> 2000029 </td></tr><tr><td> Doku kültürü şişesi </td><td> Corning </td><td></td></tr><tr><td> Santrifüj tüpleri </td><td> BASIX </td><td> 5539800 </td></tr><tr><td> İnce borular </td><td> Eton </td><td> 1107A </td></tr><tr><td> Cerrahi Bıçak paslanmaz çelik </td><td> Tüy </td><td> 2976 # 10 </td></tr><tr><td> İnsülin Şırınga </td><td> Rahatlık noktası </td><td> 26027 </td></tr><tr><td> 50ml düz üst vidalı kapaklı tüp </td><td> BASIX </td><td> 5539802 </td></tr><tr><td> Diseksiyon mikroskobu </td><td> TriTech </td><td></td></tr><tr><td> Floresan mikroskop </td><td> Olympus </td><td> DP-72 </td></tr><tr><td> Forsepsle </td><td> Fisher Bilim </td><td></td></tr></table> Tablo 2. Ekipman.

cerrahi Örneklerinin tümör eksplantlarındaki roman anti-kanser İlaç geliştirme yöntemi

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

Malign glioma için mevcut tedaviler, sadece palyatif bir etkiye sahip. Terapötik gelişmesi için, bir engel mevcut ilaç etkinliği testleri ve hasta üzerinde etkinliği tespit etkinlik tutarsızlık. Böylece, ilaç etkinliğini değerlendirmek için yeni ve güvenilir yöntemleri klinik öncesi faz garantilidir. Tümör doku, hücre hatları da dahil olmak üzere in vitro kültüründe hücre kültürü yapay bir ortam neden olduğu kanser hücrelerinin önemli fenotipik, genetik ve epigenetik değişiklikler, in situ orijinal tümörlerin biyolojisi yansıtmıyor olabilir. Xenograftlarında bağışık yetmezliği olan farelere modelleri de, yani bağışıklık sistemi eksikliği sınırlamaları vardır ve mikroçevresinin genetik ve epigenetik farklılıklar interspecies. Burada, tedavi etkilerini değerlendirmek için undissociated tümör blok olarak malign glioma cerrahi örnekler kullanarak yeni bir yöntem ortaya koymaktadır. Bu yöntemi doğrulamak için, ilk satır mevcut kemoterapötik ajan, temozolomide (TMZ), ile veri açıklanmıştır. Biz, deneyler için malign glioma taze kaldırıldı cerrahi örnek kullanılır. Kuluçka ve cerrahi örneklerin analizi ile takip TMZ veya diğer ilaç adayları, intratümöral enjeksiyon yapıldı. Burada, yeni anti-kanser tedavilerinin etkinliğini belirlemek için bir platform olarak biz, en azından bazı mevcut sınırlamaların üstesinden gelmek ve mevcut deneysel arasındaki mevcut boşluğu doldurmak için mümkün olabilir, böylece tümör dokusu eksplant yöntemi kurmak için çalıştı veri ve gerçek bir hastanın tümör üzerindeki etkinliği. Bu yöntem, katı kanser tedavisi için yeni kemoterapötik ajanlar tespit hızlandırmak için potansiyeli olabilir.

Burada, beyin tümörlerinin cerrahi örnekleri, olarak adlandırılan &quot;tümör eksplant yöntemi&quot; ile ilaç etkinliğini test etmek için bir yöntem kurmuştur. Bu yöntemde, katı tümörlerin mikroçevresinin bozmadan ilaç etkinliğini değerlendirmek. Bu yöntemin güvenilirliğini doğrulamak için, ilk basamak kemoterapötik ajan, temozolomide tedavi glioma örnek temsili verileri açıklanmaktadır.

Cerrahi Örneklerinin tümör eksplantlarındaki Roman Anti-Kanser İlaç Geliştirme Yöntemi

Malign gliomalar için mevcut tedaviler yalnızca palyatif etkiye sahiptir. Terapötik geliştirme sürecindeki engellerden biri, belirlenen etkinliğin ... arasındaki tutarsızlıktır.

Bu prosedürün genel amacı, beyin tümörlerinin cerrahi örnekleri ile "tümör X explan yöntemi" olarak adlandırılan yeni bir ilaç etkinliği test yöntemi geliştirmektir. Bu işlem, öncelikle preklinik deneyler için cerrahi müdahale sırasında taze olarak çıkarılan malign gliom cerrahi örneklerinin temin edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, örnekler klinik teşhis ve araştırma amaçları doğrultusunda ayrıştırılmak üzere doku tedarik merkezine nakledilir.Ardından araştırma laboratuvarında, tümör eksplantları birden fazla daha küçük doku parçasına ayrılır ve optimize edilmiş ortama aktarılır. Son olarak, ilaç adayları ile intratümöral enjeksiyonlar gerçekleştirilir ve eksplantlar 16 saat boyunca inkübe edilir. Nihayetinde, hematoksilin ve eozin boyamanın yanı sıra hücre tipiye özgü belirteçlerle yapılan immünohistokimya aracılığıyla tedavinin etkinliğini ortaya koyan sonuçlar elde edilebilir.İlaç etkinliğini, akış sitometrisi ve nörosfer oluşum analizlerini kullanarak in vitro olarak da değerlendirebiliriz. Güncel ilaç etkinliği analizlerinin çoğu, mevcut preklinik deneysel modellerdeki ilaç etkinliği ile hastalardaki etkinlik arasında bir boşluk bırakmaktadır. Özellikle, ilaç adaylarını malign gliomlar gibi solid kanserler üzerinde test ederken, hücre içi sinyal alışverişlerinin yanı sıra hücreler arası sinyal alışverişlerini de göz ardı etmemeliyiz.Solid tümörlerin mikroçevresini bozmamak adına, tümör eksplantımızla birlikte özel bir kültür yöntemi geliştirdik. Tümörler hastalardan çıkarıldıktan sonra, örnekler Patoloji Bölümü'nden transfer edilir veya oraya gönderilir. Tümör parçalarını iki kısma ayırırız. Bir parçadan alınan tümör örneği, klinik tanı için dondurulmuş kesit ve parafin gömme işlemleri için kullanılır; tümör dokusunun geri kalanı ise araştırmacılar tarafından kullanılmak üzere araştırma laboratuvarlarına gönderilir.Bu yöntemle, tümörün mikroçevresini; komşu tümör endotelyal ve immün hücrelerinin yanı sıra, tümörü çevreleyen veya tümör boşluklarına göç eden normal beyin hücreleriyle birlikte koruyabiliriz. Glioblastom dokusunu işleme almadan önce sıvı, ortam ve agar çözeltisini hazırlayın. Bunları bire bir oranda karıştırın.Ardından altı kuyucuklu plakaların her bir kuyucuğuna bir mililitre ekleyin. Taze glioblastoma multiforme dokusu alındıktan sonra, pens yardımıyla bir Petri kabına aktarın ve cerrahi bistüri ile pens kullanarak beş mililitrelik buz gibi 1x PBS ile dikkatlice üç kez yıkayın. Tümör blokları oluşturmak için diseke edilen örneklerden yaklaşık 10 mm çapında seri kesitler alın; her bir bloğu agar ortamı içeren altı kuyucuklu plakanın bir kuyucuğuna, canlılığını koruması için havayla yeterli temas sağlayacak şekilde aktarın.Ardından, bir mililitrelik insülin şırıngası ve 28 gauge yarım inç iğne kullanarak, tümör bloklarına üç kez %5 DMSO veya 2,5 nanomolar temozolomide ya da yeni bir antikanser ilaç adayı enjekte edin ve %5 karbon dioksit içeren nemlendirilmiş havada 37 degrees Celsius sıcaklıkta 16 saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından, blokları beş mililitre 1x PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra 50 mililitrelik tüplerde, blokları 10 mililitre %10 hacim/hacim formalin ile 24 saat boyunca tespit edin.Dokuyu parafine gömün ve kesitlerin deparafinizasyonu ile rehidratasyonunu sağlamak için dört mikronluk kesitler alın. Lamları bir rafa yerleştirin ve aşağıdaki çözeltilerde inkübe edin. Beşer dakikalık sürelerle üç kez ksilen uygulayın.Beşer dakika boyunca üç kez %100 etanol. Beş dakika boyunca bir kez %95 etanol ve beş dakika boyunca bir kez %70 etanol. Son olarak, üç dakika boyunca akan musluk suyu ile durulayın.Antijen geri kazanımı ve iç peroksit inhibisyonu ile ilgili ayrıntılar için lütfen ekteki yazılı protokole bakınız. Kesitleri bloke etmek için dokuları %10 normal keçi serumu ile kaplayın, ardından lamları nemli bir kutuya aktarın ve oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Lamları, her biri beş dakika olacak şekilde, 1x PBS ile üç kez yıkayın.Ardından, 1x PBS ile seyreltilmiş insan spesifik caspase three veya KI 67 gibi primer antikorları ekleyin ve ardından 4 °C'de gece boyunca inkübe edin. Slaytları 1x PBS ile 10'ar dakikalık sürelerle 3 kez durulayın. Sonra, dokuların üzerine iki ila üç damla HRP işaretli sekonder antikor damlatın.Slaytları nemli bir kutuya yerleştirin ve oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Her biri beş dakika sürecek şekilde 3 kez PBS ile yıkayın. Karşı boyama için üretici talimatlarını izleyerek bir kromojen DAB kiti kullanarak numuneleri geliştirin.Slaytları 10 ila 15 saniye boyunca hematin içinde bekletin. Ardından, akan musluk suyu ile üç dakika boyunca durulayın. Slaytları, bir montaj reaktifi ve lamel kullanmadan önce aşağıdaki çözeltilere daldırarak örnekleriye değidrate edin.Ardından slaytları görüntülemek için bir floresan mikroskobu kullanın. Bu şekildeki gadolinyum destekli T1 ağırlıklı MRI görüntüsü, ameliyat öncesi bir hastanın sağ frontal lobunda belirginleşmiş bir glioblastoma multiforme veya GBM tümörünü göstermektedir. Ameliyat sonrası görüntü, lezyonun subtotal rezeksiyonunu doğrulamıştır.Hematin ve eosin boyaması; nekroz, psödo palizat hücreler ve mikrovasküler proliferasyon varlığını göstermektedir. Bu nedenle, bu tümör eksplant örneklerinin güvenilir bir şekilde kullanılıp kullanılamayacağını araştırmak amacıyla, tümörler histopatolojik olarak GBM olarak teşhis edilmiştir. Bir ilaç etkinliği testi amacıyla, temozolomide veya TMZ ilacının etkisini test ettik; TMZ ile tedavi edilen GBM dokularının immünohistokimyası, kontrol örneklerine kıyasla KI 67 pozitif tümör hücrelerinde önemli bir azalma olduğunu göstermektedir.Buna karşılık, bir apoptoz belirteci olan caspase three ile yapılan immünohistokimya, TMZ ile tedavi edilen gliom örnekleri ve kontrol örnekleri arasında anlamlı bir fark ortaya koymamıştır. Temozolomid ile tedavi etkisi, bu ex explan analizi in vitro kültür veya akış sitometrisi ile birleştirilerek daha ayrıntılı şekilde karakterize edilebilir. Yeni anti-kanser ajanların taranması için bu ex explan yöntemini, ksenogreft transplantasyonu ve in vitro küre oluşturma analizi ile karşılaştırabiliriz.Tümör dokuları laboratuvar ortamında elde edildikten sonra, bu deneyin prosedürü bir saat içinde tamamlanabilir. Bu yeni analiz, işlem görmüş tümör implantlarının disosyasyonundan sonra uygulanması nispeten kolay ve tekrarlanabilirdir. In vitro deneylerle birlikte kullanılabilir.Bu analiz yönteminin en büyük avantajı, tümör mikroçevresini koruyor olmasıdır. Temodar ile tedavi edilen tümör eksplantları ile elde ettiğimiz pozitif veriler, cerrahi operasyonlar sonrası Temodar tedavisi gören aynı hastaların sonuçlarıyla tutarlılık göstermiştir. Son olarak, bu yöntem diğer solid kanserler için de uygulanabilir olduğundan, solid kanser tedavisi için yeni kemoterapötik ajanların belirlenmesini hızlandırma potansiyeline sahiptir.

method-for-novel-anti-cancer-drug-development-using-tumor-explants

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu video, bir fare tümörü ksenogreft modelinde tümöre özgü antikorların in vivo lokalizasyonunu incelemek için bir tekniği göstermektedir. Tümör oluşumu için kanser hücrelerinin farelere deri altına enjekte edilmesinin ardından, tümöre özgü reseptörlere bağlanan floresan etiketli antikorlar enjekte edilir ve görüntüleme yoluyla antikor lokalizasyonunun in vivo olarak değerlendirilmesini sağlar.

Tümöre Özgü Antikorların İn Vivo Lokalizasyonunu Değerlendirmek İçin Bir Teknik

Bu video, meme kanserinin bir fare modelinde tümör hedefleme antikorlarının biyolojik dağılımını incelemek için in vivo immünofloresan lokalizasyon (IVIL) tekniğini göstermektedir. Farede tümöre özgü bir antikorun intravenöz enjeksiyonu üzerine, tümör cerrahi olarak izole edilir ve antikorun tümör dokusu içindeki lokalizasyonu ex vivo immün boyama yoluyla doğrulanır.

Antikor Biyodağılımını İncelemek için Bir İn Vivo İmmünofloresan Lokalizasyon Yöntemi

Kurulmuş kanser hücre hatları ve ksenogratflardır son birkaç yıldır kanser araştırma dayanak noktası olmuştur. Bununla birlikte, son bulgular terapötik tepki özellikle, tümör hücre mikro-ortamı tarafından etkilendiğini göstermektedir. Bu nedenle, ilaç geliştirme amaçları için primer tümör numunelerinin bir ex vivo analiz geliştirdik.

İlköğretim Tümörleri ve / veya klinik öncesi için İlişkili Metastazlarının ve Tedavi Klinik Geliştirme Ex Vivo Tedavisi Tepki

Tümör Başlatan hücrelerin insan sarkomu hasta türevi xenograflarından floresan-aktif hücre sıralama ile yalıtılması için ayrıntılı bir protokol tanımlayarak, insan lökosit antijen-1 (HLA-1) ' i negatif bir işaret olarak kullanarak ve daha fazla doğrulama ve Bu HLA-1-negatif tümör başlatma hücrelerinin karakterizasyonu.

Sarkom hasta türevi xenografts tümör-başlatma hücrelerinin yalıtım ve karakterizasyonu

Burada, biyolojik ilgili sitelerdeki kanser için güvenilir preklinik modelleri oluşturmak için bir protokol ultrason destekli enjeksiyon Nöroblastom (NB) ve Ewing sarkomu (ES) hücre yararlanmak için (hücre satırları ve hasta kaynaklı tümör hücreleri kurulu) mevcut araştırma.

Ultrason kullanımı doku Yönetmen: hücresel implantasyon biyolojik ilgili metastatik tümör Xenografts kurulması için güdümlü

Biz üretimi, yetiştirme ve fare akciğer tümörleri türetilmiş organotypic dilimleri sistematik analizi için bir yöntem sağlar. Biz de dilim kalınlığı için en iyi duruma getirme ve tümör dilimleri tedavisi için ilaç konsantrasyonları seçin anlatan.

Kuruluş ve tümör dilim analizini Explants tanı testleri için bir önkoşul olarak

In vivo immünfloresans lokalizasyonu (IVIL) yöntemi, in vivo tümör hedeflemesi ve ekzo immünboyama kombinasyonu nu kullanarak canlı organizmalarda onkolojik amaçlarla antikor ve antikor konjugatörlerinin in vivo biyodağılımını incelemek için kullanılabilir. Yöntemler.

Kanser Araştırmalarında Terapötik ve Tanısal Antikor Biyodağılımının Değerlendirilmesi için In Vivo Immunofluoresence Lokalizasyonu

Burada fare tümörü ksenogreft modellerinde antikorların in vivo lokalizasyonunu incelemek için bir protokol sayılmaktadır.

Hedef Antijen Spesifik Terapötik Antikor tümör ve doku dağılımının analizi

Hasta kaynaklı ksinograft (PDX) modelleri ve nakledilebilir genetik olarak tasarlanmış fare modelleri insan hastalığına sadık kalınarak rekapitulate edilir ve temel ve çevirisel meme kanseri araştırmaları için tercih edilen modellerdir. Burada, tümör biyolojisini incelemek ve ilaç yanıtını değerlendirmek için meme tümörü parçalarını meme yağ yastığına ortotopik olarak nakleden bir yöntem açıklanmaktadır.

Meme Kanseri için Preklinik Modeller Olarak Meme Tümörlerinin Ortopedik Transplantasyonu

Bu makalede, canlı, hastaya bağlı, preklinik bir model sisteminde tümör ilaç yanıtlarının değerlendirilmesi için hasta kaynaklı eksplantların üretimi, ilaç tedavisi ve analizi için yöntemler açıklanmaktadır.

Hasta Kaynaklı Tümör, Hastalarda İlaç Direncini Tahmin Etmek İçin "Canlı" Preklinik Bir Platform Olarak Eksplantlar

Burada, antitümör antikorların önemli bir kanser hücresi öldürme mekanizması olan ADCC mekanizmasını modüle eden bileşikleri tanımlamak için bir yöntem sunuyoruz. NK hücrelerinin sitotoksik etkisi, Trastuzumab varlığında meme kanseri hücre sferoidlerinde ölçülür. Görüntü analizi, sferoidlerdeki canlı ve ölü öldürücü ve hedef hücreleri tanımlar.

Bir Tümör Sferoid Modelinde Antikora Bağımlı Hücresel Sitotoksisitenin Ölçülmesi: İlaç Keşfi Uygulaması

Öğrenin, tümör eksplant yöntemiyle beyin tümörlerinin cerrahi örneklerinde ilaç etkinliğini değerlendirmeyi. Bu yöntem, tümör mikroçevresini koruyarak gliom tedavileri için güvenilir sonuçlar sunar.

Cerrahi Örneklerinin tümör eksplantlarındaki Roman Anti-Kanser İlaç Geliştirme Yöntemi

Daha fazla video keşfet