Cerrahi Örneklerinin tümör eksplantlarındaki Roman Anti-Kanser İlaç Geliştirme Yöntemi

Bu prosedürün genel amacı, beyin tümörlerinin cerrahi örnekleri ile "tümör X explan yöntemi" olarak adlandırılan yeni bir ilaç etkinliği test yöntemi geliştirmektir. Bu işlem, öncelikle preklinik deneyler için cerrahi müdahale sırasında taze olarak çıkarılan malign gliom cerrahi örneklerinin temin edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, örnekler klinik teşhis ve araştırma amaçları doğrultusunda ayrıştırılmak üzere doku tedarik merkezine nakledilir.

Ardından araştırma laboratuvarında, tümör eksplantları birden fazla daha küçük doku parçasına ayrılır ve optimize edilmiş ortama aktarılır. Son olarak, ilaç adayları ile intratümöral enjeksiyonlar gerçekleştirilir ve eksplantlar 16 saat boyunca inkübe edilir. Nihayetinde, hematoksilin ve eozin boyamanın yanı sıra hücre tipiye özgü belirteçlerle yapılan immünohistokimya aracılığıyla tedavinin etkinliğini ortaya koyan sonuçlar elde edilebilir.

İlaç etkinliğini, akış sitometrisi ve nörosfer oluşum analizlerini kullanarak in vitro olarak da değerlendirebiliriz. Güncel ilaç etkinliği analizlerinin çoğu, mevcut preklinik deneysel modellerdeki ilaç etkinliği ile hastalardaki etkinlik arasında bir boşluk bırakmaktadır. Özellikle, ilaç adaylarını malign gliomlar gibi solid kanserler üzerinde test ederken, hücre içi sinyal alışverişlerinin yanı sıra hücreler arası sinyal alışverişlerini de göz ardı etmemeliyiz.

Solid tümörlerin mikroçevresini bozmamak adına, tümör eksplantımızla birlikte özel bir kültür yöntemi geliştirdik. Tümörler hastalardan çıkarıldıktan sonra, örnekler Patoloji Bölümü'nden transfer edilir veya oraya gönderilir. Tümör parçalarını iki kısma ayırırız. Bir parçadan alınan tümör örneği, klinik tanı için dondurulmuş kesit ve parafin gömme işlemleri için kullanılır; tümör dokusunun geri kalanı ise araştırmacılar tarafından kullanılmak üzere araştırma laboratuvarlarına gönderilir.

Bu yöntemle, tümörün mikroçevresini; komşu tümör endotelyal ve immün hücrelerinin yanı sıra, tümörü çevreleyen veya tümör boşluklarına göç eden normal beyin hücreleriyle birlikte koruyabiliriz. Glioblastom dokusunu işleme almadan önce sıvı, ortam ve agar çözeltisini hazırlayın. Bunları bire bir oranda karıştırın.

Ardından altı kuyucuklu plakaların her bir kuyucuğuna bir mililitre ekleyin. Taze glioblastoma multiforme dokusu alındıktan sonra, pens yardımıyla bir Petri kabına aktarın ve cerrahi bistüri ile pens kullanarak beş mililitrelik buz gibi 1x PBS ile dikkatlice üç kez yıkayın. Tümör blokları oluşturmak için diseke edilen örneklerden yaklaşık 10 mm çapında seri kesitler alın; her bir bloğu agar ortamı içeren altı kuyucuklu plakanın bir kuyucuğuna, canlılığını koruması için havayla yeterli temas sağlayacak şekilde aktarın.

Ardından, bir mililitrelik insülin şırıngası ve 28 gauge yarım inç iğne kullanarak, tümör bloklarına üç kez %5 DMSO veya 2,5 nanomolar temozolomide ya da yeni bir antikanser ilaç adayı enjekte edin ve %5 karbon dioksit içeren nemlendirilmiş havada 37 degrees Celsius sıcaklıkta 16 saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından, blokları beş mililitre 1x PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra 50 mililitrelik tüplerde, blokları 10 mililitre %10 hacim/hacim formalin ile 24 saat boyunca tespit edin.

Dokuyu parafine gömün ve kesitlerin deparafinizasyonu ile rehidratasyonunu sağlamak için dört mikronluk kesitler alın. Lamları bir rafa yerleştirin ve aşağıdaki çözeltilerde inkübe edin. Beşer dakikalık sürelerle üç kez ksilen uygulayın.

Beşer dakika boyunca üç kez %100 etanol. Beş dakika boyunca bir kez %95 etanol ve beş dakika boyunca bir kez %70 etanol. Son olarak, üç dakika boyunca akan musluk suyu ile durulayın.

Antijen geri kazanımı ve iç peroksit inhibisyonu ile ilgili ayrıntılar için lütfen ekteki yazılı protokole bakınız. Kesitleri bloke etmek için dokuları %10 normal keçi serumu ile kaplayın, ardından lamları nemli bir kutuya aktarın ve oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Lamları, her biri beş dakika olacak şekilde, 1x PBS ile üç kez yıkayın.

Ardından, 1x PBS ile seyreltilmiş insan spesifik caspase three veya KI 67 gibi primer antikorları ekleyin ve ardından 4 °C'de gece boyunca inkübe edin. Slaytları 1x PBS ile 10'ar dakikalık sürelerle 3 kez durulayın. Sonra, dokuların üzerine iki ila üç damla HRP işaretli sekonder antikor damlatın.

Slaytları nemli bir kutuya yerleştirin ve oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Her biri beş dakika sürecek şekilde 3 kez PBS ile yıkayın. Karşı boyama için üretici talimatlarını izleyerek bir kromojen DAB kiti kullanarak numuneleri geliştirin.

Slaytları 10 ila 15 saniye boyunca hematin içinde bekletin. Ardından, akan musluk suyu ile üç dakika boyunca durulayın. Slaytları, bir montaj reaktifi ve lamel kullanmadan önce aşağıdaki çözeltilere daldırarak örnekleriye değidrate edin.

Ardından slaytları görüntülemek için bir floresan mikroskobu kullanın. Bu şekildeki gadolinyum destekli T1 ağırlıklı MRI görüntüsü, ameliyat öncesi bir hastanın sağ frontal lobunda belirginleşmiş bir glioblastoma multiforme veya GBM tümörünü göstermektedir. Ameliyat sonrası görüntü, lezyonun subtotal rezeksiyonunu doğrulamıştır.

Hematin ve eosin boyaması; nekroz, psödo palizat hücreler ve mikrovasküler proliferasyon varlığını göstermektedir. Bu nedenle, bu tümör eksplant örneklerinin güvenilir bir şekilde kullanılıp kullanılamayacağını araştırmak amacıyla, tümörler histopatolojik olarak GBM olarak teşhis edilmiştir. Bir ilaç etkinliği testi amacıyla, temozolomide veya TMZ ilacının etkisini test ettik; TMZ ile tedavi edilen GBM dokularının immünohistokimyası, kontrol örneklerine kıyasla KI 67 pozitif tümör hücrelerinde önemli bir azalma olduğunu göstermektedir.

Buna karşılık, bir apoptoz belirteci olan caspase three ile yapılan immünohistokimya, TMZ ile tedavi edilen gliom örnekleri ve kontrol örnekleri arasında anlamlı bir fark ortaya koymamıştır. Temozolomid ile tedavi etkisi, bu ex explan analizi in vitro kültür veya akış sitometrisi ile birleştirilerek daha ayrıntılı şekilde karakterize edilebilir. Yeni anti-kanser ajanların taranması için bu ex explan yöntemini, ksenogreft transplantasyonu ve in vitro küre oluşturma analizi ile karşılaştırabiliriz.

Tümör dokuları laboratuvar ortamında elde edildikten sonra, bu deneyin prosedürü bir saat içinde tamamlanabilir. Bu yeni analiz, işlem görmüş tümör implantlarının disosyasyonundan sonra uygulanması nispeten kolay ve tekrarlanabilirdir. In vitro deneylerle birlikte kullanılabilir.

Bu analiz yönteminin en büyük avantajı, tümör mikroçevresini koruyor olmasıdır. Temodar ile tedavi edilen tümör eksplantları ile elde ettiğimiz pozitif veriler, cerrahi operasyonlar sonrası Temodar tedavisi gören aynı hastaların sonuçlarıyla tutarlılık göstermiştir. Son olarak, bu yöntem diğer solid kanserler için de uygulanabilir olduğundan, solid kanser tedavisi için yeni kemoterapötik ajanların belirlenmesini hızlandırma potansiyeline sahiptir.